신경과학에서의 압타머 응용 2부
May 27, 2024
또 다른 신경 전달 물질인 세로토닌은 수면, 공격성, 식욕 및 성 활동에 영향을 미치는 신경 조절 활동에 역할을 합니다. 이는 뇌, 척수, 혈소판 및 내장과 같은 다양한 신체 부위에서 생산됩니다 [81-84].
세로토닌은 인간의 신체적, 정신적 건강에 중요한 역할을 하는 신경 전달 물질입니다. 인체에서 세로토닌은 기분을 조절하고, 식욕과 수면을 조절하며, 육체적인 즐거움과 행복감을 촉진합니다. 그러나 세로토닌은 기억력에 영향을 미치는 데에도 중요한 역할을 합니다.
연구에 따르면 세로토닌은 뉴런 사이의 신호 전달을 조절하여 기억력 향상을 촉진할 수 있는 것으로 나타났습니다. 사람들이 긍정적인 자극을 받으면 신체는 세로토닌을 방출하는데, 이는 뉴런 간의 연결을 강화하고 기억 효율성을 향상시키는 데 도움이 됩니다. 세로토닌은 또한 사람들을 더욱 창의적으로 만들고, 정신적 민첩성을 향상시키며, 사람들이 더 빨리 배우고 생각하도록 유도하는 데 도움을 줄 수 있습니다.
또한 세로토닌은 사람들의 집중력과 기억력에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 불안과 우울증, 기분 문제의 증상을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 행복한 기분과 정신 상태는 종종 새로운 것에 대한 사람들의 인식과 학습 능력을 촉진할 수 있습니다.
요약하자면, 세로토닌은 신체적, 정신적 건강 학습과 기억에 없어서는 안 될 역할을 합니다. 식습관, 운동량, 학습 방법 등을 바꾸고, 긍정적이고 건강한 사고방식을 기르며, 지속적인 기억력 향상을 위해 끊임없이 도전함으로써 세로토닌의 방출을 증가시키고 [기억력을 향상]할 수 있습니다. 기억력 향상이 필요하다는 것을 알 수 있는데, 시스탄체 데저티콜라에는 항산화, 항염증, 항노화 효과가 있어 뇌의 산화 및 염증 반응을 감소시켜 뇌를 보호할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 신경계의 건강. 또한 Cistanche Deserticola는 신경 세포의 성장과 복구를 촉진하여 신경 네트워크의 연결성과 기능을 향상시킬 수 있습니다. 이러한 효과는 기억력, 학습 및 사고 속도를 향상시키는 데 도움이 될 수 있으며 인지 기능 장애 및 신경퇴행성 질환의 발병을 예방할 수도 있습니다.
말초 세로토닌 수준의 불균형은 고혈압, 신장 질환 및 우울증을 포함한 여러 질병 상태와 관련이 있습니다. 따라서 질병 상태를 예측하고 적절한 치료를 시작하기 위해 세로토닌을 사용하는 것은 임상적으로 중요합니다.
세로토닌의 존재 하에 응집이 변경되는 앱타머-AuNP 접합체를 사용하여 세로토닌에 대한 플라즈몬 분석이 개발되었습니다. 입자 응집의 변화는 흡수 피크 파장의 변화로 측정될 수 있습니다.
이 분석에서는 세로토닌에 대한 특정 반응이 나타났으며, 각 대사물질인 5-하이드록시인돌아세트산(5-HIAA), 에피네프린 또는 노르에피네프린을 1μM로 테스트했을 때 통계적으로 유의미한 신호가 나타나지 않았습니다.
인간 혈청을 모방한 소태아혈청(Fetal bovineserum)도 신호를 시작하지 않았습니다[85]. 최근에는 뇌 조직의 세로토닌 수준을 모니터링하기 위해 이식 가능한 앱타머 전계 효과 트랜지스터(FET) 신경탐침이 개발되었습니다. 나노크기 FET의 초박형 In2O3 표면은 압타머로 변형되었으며 이러한 신경탐침은 생체 오염을 최소화하면서 생체 내에서 fM 세로토닌 검출 한계를 가능하게 했습니다[86].
추가 신경 프로브를 사용하면 신경 활동의 시공간 기록이 가능하므로 뇌 기능을 훨씬 더 깊은 수준에서 이해할 수 있습니다. 에피네프린은 비정상적인 수준이 부정맥, 심근 경색, 혈액과 같은 건강 문제를 일으킬 수 있는 광범위한 생리 기능을 가진 카테콜아민 신경 전달 물질입니다. 압력 증가 및 폐부종.
이러한 관련 질병 상태를 관찰하기 위해서는 순환하는 에피네프린을 정량화하는 것이 중요합니다. 이러한 목표를 위해 에피네프린과 앱타머 기능화된 Au-NP의 상호 작용을 기반으로 하는 비색 검출 방법이 개발되었습니다. 이 시스템은 액체 크로마토그래피, 분광 광도법 등 에피네프린을 정량화하는 다른 기술보다 비용이 저렴하고 더 구체적입니다.
또한, UV-visible 분광학에 의해 검출 한계 0.9 nM이 결정되었으며, 이는 모든 비색 방법을 사용하여 에피네프린에 대해 기록된 최저 검출 한계입니다. 에피네프린, 3,4-디하이드록시페닐아세트산(DOPAC), 트립토판, 아스코르브산, 도파민, 티로신 및 호모바닐산의 유사체는 반응이 거의 없거나 전혀 나타나지 않았는데, 이는 앱타센서의 높은 특이성을 나타냅니다[87].
단일 신경전달물질 수준의 변화는 여러 질병 중 하나를 나타낼 수 있으므로 단일 신경전달물질의 측정을 기반으로 질병 진단을 내릴 가능성은 매우 낮습니다. 따라서 대부분의 앱타센서를 멀티플렉스 플랫폼에 통합할 수 있으면 진료소에 더 적합한 진단 도구가 탄생하고 더 정확한 질병 식별을 지원할 수 있는 잠재력을 갖게 될 것입니다.
2.3. 바이오마커 검출
바이오마커는 결과를 초래하거나 특정 질병의 존재를 나타내는 신체의 모든 물질, 구조 또는 과정입니다. 많은 바이오마커는 혈액, 타액, 소변 등 생체액에서 측정할 수 있는 물질입니다.
신경질환 바이오마커 특성화의 주요 문제는 많은 단백질을 포함한 많은 분자가 통과할 수 없는 혈액뇌장벽(BBB)입니다. 단백질이 특정 질병에 대한 지배적인 바이오마커임에도 불구하고, 신경펩타이드 Y나 단백질 조각과 같은 작은 펩타이드는 BBB를 통과하여 순환계에서 검출될 가능성이 더 높습니다.
대사산물은 신경 질환에 대한 바이오마커의 또 다른 중요한 그룹입니다. NeoVentures Biotechnology Inc.는 표면에 부착된 짧은올리고뉴클레오티드와 표적 사이의 경쟁을 기반으로 압타머를 선택할 수 있는 FRELEX라는 앱타머 선택 접근 방식을 개발했습니다. cell-SELEX 및 다른 형태의 구조 전환 SELEX와 마찬가지로 이 프로토콜은 압타머가 선택될 대상에 대한 사전 지식 없이 구성 요소의 혼합물을 포함하는 샘플을 사용하여 수행될 수 있습니다.
이러한 형태의 SELEX를 사용하면 원하는 특이성을 충족하는 압타머 선택을 유도하기 위해 구성 요소의 특정 하위 집합을 사용하여 카운터 선택이 수행됩니다. FRELEX를 사용하여 인간 타우 단백질을 과발현하는 형질전환 쥐의 혈청에 대해 압타머를 선택했습니다.
인간 타우에 대한 압타머 선택과 타우 과발현의 결과를 유도하기 위해 야생형 마우스의 혈청을 역선택에 사용했습니다. 이 그룹은 NGS를 사용하여 농축된 앱타머 서열을 확인하고 상대적 풍부함을 비교하여 후기 단계 형질전환 마우스와 야생형 마우스에 대한 특정 앱타머를 특성화했습니다.
그들은 풍부함의 차이가 압타머가 상호작용할 수 있는 에피토프의 농도(타우 과발현에 반응하여 증가)를 반영한다는 가설을 세웠습니다[29].
3. 진단 및 치료 응용
신경퇴행성 질환(ND)은 뇌의 뉴런 퇴화와 관련되어 중추신경계의 구조와 기능의 상실을 초래합니다. ND는 노화, 유전적, 환경적 요인으로 인해 발생할 수 있습니다.
치매는 알츠하이머병(AD)과 마찬가지로 가장 흔한 연령 관련 ND 중 하나입니다. 파킨슨병(PD)은 유전적 돌연변이 및/또는 환경 독소로 인해 발생할 수 있습니다. 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다발성 경화증(MS), 헌팅턴병(HD) 및 프리온 질환은 유전적 연관이 있는 기타 일반적인 ND입니다.
불행하게도 이러한 질병에는 효과적인 치료법이나 조기 발견 전략이 없습니다. 널리 사용되는 항체와 마찬가지로 압타머도 ND의 조기 진단 및 질병 치료를 위한 새로운 바이오센서 개발에 적용할 수 있는 매력적인 물질이 되었습니다[88].
3.1. 알츠하이머병
정신 결핍을 초래하는 연령 관련 진행성 뇌 장애인 AD는 치매의 가장 흔한 형태입니다. 그 병리학은 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에서 유래되고 해마의 뇌 영역에서 시작되는 아밀로이드-(A)의 응집을 특징으로 합니다.
과학자들은 A 유도 신경독성이 불용성 A 플라크(AP) 및 원섬유(AF)와 상관관계가 있다는 가설을 세웠지만, 최근 증거에 따르면 가용성 A 올리고머(AO)도 AD 발병과 연관되어 있는 것으로 나타났습니다.
따라서 AO는 AD의 조기 진단을 위한 매력적인 바이오마커로 확인되었으며, A와 tau는 AD 치료를 위한 중요한 치료 표적으로 간주됩니다[89].
3.1.1. AD 진단
AO에 대해 초기에 기술된 앱타머는 낮은 친화성과 특이성을 가지고 있었지만, 이후 연구에서는 40-잔류 형태의 A(A 40)의 원섬유를 선택적으로 인식하지만 A 40 폴리머는 인식하지 못하는 앱타머를 식별하는 데 더 성공적이었습니다[90].
그러나 압타머는 테스트된 여러 다른 아밀로이드 생성 단백질의 원섬유에 비해 A40 원섬유에 대한 높은 특이성이 부족했습니다. 68-nM 친화성을 갖는 -synuclein(-syn) 올리고머와 상호작용하도록 선택된 DNA 앱타머는 또한 25-nM 친화성으로 AO에 결합하는 것으로 나타났습니다[91]. 2019년에는 Tsukakoshi 등이 얻은 동일한 앱타머를 사용하여 AO를 보다 구체적으로 인식하기 위해 라벨이 없는 전기화학 앱타센서가 개발되었습니다[92].
앱타머는 티올(-S) 상호작용을 통해 금 막대 전극을 자가 조립하며 시스템의 검출 한계는 EIS에 의해 결정된 30ppm입니다. 이는 EIS를 기반으로 A 단백질 응집을 모니터링하는 데 성공적으로 사용된 최초의 앱타센서였으며, 이는 A 종 중에서 앱타머의 높은 선택성으로 인해 가능했습니다. 쉬운 제작과 효과적인 재생을 통해 이 앱타센서는 AD의 조기 발견과 A 단백질 축적을 입증하기 위한 유망한 진단 도구가 될 수 있습니다[92].
A 올리고머를 검출하기 위한 앱타센서는 메틸렌 블루(MB)와 복합체로 된 -syn DNA 앱타머[91]를 사용하여 개발되었으며 나노다공성 아노디칼루미나에 부착되었습니다. 백색광에 대한 MB의 높은 흡수 계수로 인해 반사되는 백색광의 강도가 낮아졌습니다.
A 올리고머의 존재 하에서 압타머/MB 복합체는 해리되고 반사광의 증가는 간섭계 반사 분광법(IRS)에 의해 검출되었습니다[93]. 앱타센서는 8pM의 검출 한계를 가지며 0.5~50nM의 농도 범위에서 A 올리고머에 대해 우수한 반응을 보였습니다. 신경섬유엉킴(NFT)은 AD의 병리학적 특징입니다.
NFT의 형성은 해마에서 시작되며 NFT 형성의 정도는 AD 치매의 중증도와 관련이 있습니다. 미세소관 관련 단백질인 타우의 과인산화는 정상적인 타우를 NFT가 되는 필라멘트로 모집하고 조직하는 능력을 촉진합니다. 따라서, 타우의 과인산화는 AD의 주요 원인 중 하나로 제안됩니다.
미세소관 조립을 촉진하고 조립된 미세소관을 안정화시키는 일반적인 역할 외에도 tau는 비평형 모세혈관 전기영동(CE)에 의해 무작위로 선택된 3개의 ssDNA 올리고뉴클레오티드에 결합하는 것으로 관찰되었으며 그 중 하나인 ssDNA1은 높은 친화력으로 tau381에 결합했습니다(Kd {{ 3}}nM) [94].
표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 인간 혈장 내 Tau 단백질의 펨토몰 농도를 검출하기 위해 ssDNA1을 사용하여 압타머/항체 샌드위치 분석이 개발되었습니다[95].
또 다른 연구에서는 하루에 3번의 선택 라운드가 완료되는 모세관 전기영동 분할을 기반으로 한 신속한 선택 기술을 통해 441개 아미노산의 전체 타우 단백질(tau441)에 대해 DNA 앱타머를 선택했습니다. 높은 처리량 시퀀싱 결과에서 선택된 5개의 압타머는 타우 인식 능력에 대해 SPR에 의해 평가되었습니다.
더 높은 친화력을 갖는 압타머의 분석적 잠재력은 균질상형광 이방성 분석에 의해 입증되었습니다. 이 고친화성 앱타머는 tau441 단백질과 더 짧은 isoform인 tau352, tau381 및 tau383에 결합했으며 이 분석에서 각각 28nM, 6.3nM, 3.2nM 및 22nM의 검출 한계를 갖습니다[96].
3.1.2. AD 치료제
잠재적 치료법 중 하나로 A40 응집을 억제하기 위해 RNA 앱타머가 선택되었습니다. 선택하는 동안 A 올리고머가 금 나노입자(A-AuNPs)에 접합되었으며 SELEX 후 두 개의 압타머가 압타머 후보로 식별되었습니다.
10~20nM의 아이들. 이러한 압타머는 투과전자현미경과 A40 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 밝혀진 바와 같이 A 플라크 및 원섬유 형성을 억제했습니다[97].
A와 상호작용하는 알코올 탈수소효소(ABAD) 미끼 펩티드(DP)는 A 펩티드의 세포독성을 길항합니다. ABAD-DP 서열은 티오레독신(TRX)에서 이황화 결합을 형성하는 2티올 사이에 삽입되어 TRX1-ABAD-DP-TRX2펩티드 앱타머를 생성했습니다. 아데노 관련 바이러스를 이용한 NIH 3T3 세포에서의 안정적인 발현은 면역형광염색을 통해 검증되었습니다.
발현된 앱타머는 A 펩타이드에 결합하여 세포 생존력을 향상시킬 수 있습니다. 이 조사를 통해 펩타이드 앱타머에 의한 A 펩타이드의 세포 독성 효과가 효과적으로 억제된다는 것이 확인되었습니다[98]. 타우 단백질은 일반적으로 미세소관과 결합하고 안정화하지만, 이들의 과인산화는 독성이 있는 "타우병증"이라는 단백질 응집체를 초래할 수 있습니다.
인간 tau441에 대해 선택된 DNA 앱타머 Tau{0}}는 시험관 내에서 Tau1 올리고머화를 억제합니다[99]. 이러한 억제는 HEK293 세포를 사용한 세포 배양 연구에서도 검증되었습니다[100]. 베타-세크레타제(BACE1)는 A 생산에 역할을 하며 BACE1 발현 억제는 생쥐에서 치명적입니다. AD 치료에는 BACE1 조절이 포함될 수 있습니다.
그러나 BACE1의 큰 활성 부위로 인해 BACE1은 소분자 억제제에 대한 도전적인 표적이 됩니다. 이를 우회하기 위해 핵산 압타머는 BACE1 활동을 억제하는 새로운 도구가 될 수 있습니다. 이 효소는 세포질 꼬리인 B1-CT를 갖고 있어 슈퍼옥사이드 디스뮤타제-1(CCS) 및 ADP 리보실화 인자 결합(GGA1) 단백질에 대한 구리 샤프론과 같은 단백질의 도킹 부위 역할을 합니다.
B1-CT의 생리학적 역할은 거의 알려져 있지 않습니다. B1-CT를 표적으로 하는 RNA 앱타머는 BACE1 C 말단의 막 근위 절반에 결합하여 CCS 모집을 방지하는 동시에 GGA1이 BACE1에 결합하도록 허용하고 BACE1 수송을 재활용 엔도솜으로 조절합니다[101].
BACE1을 특이적으로 표적으로 삼기 위해 BACE1에 대해 DNA 압타머인 BI1과 BI2가 생성되었는데, 이는 BACE1을 억제하지만 알파-세크레타제나 감마-분비효소는 억제하지 않았습니다. 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포주를 사용하여 아밀로이드 단백질 전구체(APP)를 발현하고 체외 형광 공명 에너지 전달(FRET) 분석을 사용하여 A 수준이 감소하고 일차 배양된 신경세포주에서 세포 결핍이 구제되는 것을 보여주었습니다. [102]. 콜레스테릴테트라에틸렌글리콜(TEG)을 첨가하면 압타머 효율이 더욱 향상되었습니다.
3.2. 파킨슨병
파킨슨병(PD)은 두 번째로 흔한 신경퇴행성 질환으로, 전 세계적으로 약 700만 명에게 영향을 미칩니다. 운동 및 비운동 특징을 특징으로 하는 진행성 질환이기는 하지만 이동성과 근육 조절의 상실로 인해 환자에게 심각한 임상적 영향을 미칩니다.
선조체 도파민성 뉴런의 손실 및 비도파민성 영역의 뉴런 손실이 PD의 특징입니다. 뉴런의 손실은 일반적으로 특징적인 루이소체 형성과 연관되어 있습니다. 따라서, 뇌에 α-syn 올리고머를 함유한 루이소체의 존재는 PD에 대한 가능한 치료 및 진단 표적으로 간주됩니다.
3.2.1. PD 진단
-syn에 대해 선택된 첫 번째 압타머인 "M5-15"은 올리고머에 대한 특이성이 부족했으며 -syn 단량체에도 결합할 수 있었습니다[103]. 선택된 DNA 앱타머는 -syn 단량체가 아닌 -syn 올리고머와 상호작용하는 것으로 나타났으나 A 1-40 올리고머에는 결합했습니다.
연구자들은 또한 피롤로퀴놀린 퀴닌 포도당 탈수소효소(PQQH)의 α-시트 프로펠러 구조와 같이 주로 시트인 구조를 가진 다른 단백질에 비해 α-syn 올리고머에 대한 앱타머의 특이성을 조사했으며 앱타머가 PQQH에 결합하지 않는다는 것을 입증했습니다[91]. 앱타센서 중 β-synoliligomer를 정량화할 수 있는 것으로 보고되었습니다.
α-시놀리고머에 대한 DNA 압타머를 사용하는 비색 압타센서는 금 나노입자(AuNP)에 흡착되어 염에 의해 나노입자가 응집되는 것을 방지했습니다. -syn 올리고머에 대한 결합은 앱타머가 AuNP 표면에 흡수되는 것을 방지하여 높은 염 농도에서 AuNP의 응집이 유발되어 색상 변화를 초래합니다.
이 시스템은 10nM의 LoD로 보고되었습니다. 그러나 혈청(2%에서도)은 분석에서 색상 변화 범위에서 화합물을 흡수하는 데 기여했으며 압타머-Au-NP의 염 의존적 응집을 방해했습니다.
EIS와 SPR을 사용하는 앱타센서는 LoD가 각각 1pM과 8pM으로 더 민감했습니다[104]. EIS 앱타센서는 단량체에 비해 올리고머에 매우 특이적이고 혈청의 존재에 영향을 받지 않는 것으로 나타났습니다[104]. -syn 올리고머를 검출하기 위한 전기화학적 앱타센서에 대한 정교한 설계에는 티올 결합을 통해 금 표면에 연결된 -syn 올리고머 앱타머에 대한 상보적 서열에 의해 형성된 하이브리드가 포함되었으며 압타머의 30말단을 확장하기 위한 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)와 dTTP가 포함되었습니다. 추가 폴립으로 보완하십시오.
확장된 ssDNA는 메틸렌 블루와 결합하여 금 표면과의 결합을 촉진하여 전기화학적 신호를 생성합니다. 또한 시스템에는 ssDNA에 특이적인 엑소뉴클레아제 I(Exo I)이 포함되어 있습니다. 압타머가 -syn 올리고머에 결합하여 보체와 함께 이원 복합체에서 제거되면 상보 가닥은 Exo I에 의해 소화되어 금 표면에 메틸렌 블루가 축적되는 것을 방지하고 전기화학적 신호를 감소시킵니다.
검출 한계는 오후 10시(S/N=3)였으며 10% 이하의 혈청 농도에서 신호 복구율은 95.3~107%로 매우 허용되었습니다[105]. 그러나 시스템의 복잡성과 효소의 통합으로 인해 이 시스템은 보관 안정성이 낮고 현장에서 재현성이 떨어집니다. 모세관 전기영동-질량 분석법(CE-MS)과 고체상 추출(SPE)을 결합하여 표적을 사전 농축합니다. 대량 주입된 시료에 앱타머 변형 마이크로 카트리지를 사용하면 CE-MS 시스템에 비해 검출 한계가 100-배 감소했습니다.
이 새로운 시스템에서는 샘플을 세척하고 표적을 선택적으로 유지하는 마이크로 카트리지를 사용하여 향상된 분석을 위해 부피를 최소화합니다. 카트리지에 있는 앱타머 친화성(AA) 흡착제는 항체에 대한 우수한 대안임이 밝혀졌습니다. 시스템을 헹구는 데 필요한 배경 전해질인 면역친화성(IA) 흡착제도 항체를 변성시킵니다.
AA-SPE-CE-MS의 개발은 M5-15 DNA 앱타머로 마이크로 카트리지를 변형하여 달성되었습니다. 이 시스템은 2.8nM의 LoD를 보여주었고 혈액 샘플에서 7~140nM의 -syn 선형 검출 범위를 가졌습니다.
또한, MS의 매우 정확한 질량 검출 및 분해능으로 인해 자유 및 N-아세틸화 -syn 단백질의 식별이 가능했습니다. 마지막으로, 마이크로 카트리지는 산성 BGE에서도 안정적인 것으로 확인되었으며, 대상의 정량 오류 가능성이 낮은 약 20가지 분석에 사용할 수 있었습니다[106].
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