아릴 탄화수소 수용체 의존 및 독립 경로는 커큐민 노화 방지 효과를 중재합니다 파트 2

2.2.6. 1차 인간 EC의 배양

인간 1차 EC(Lonza, Cologne, Germany)는 1 ug/mL 히드로코르티손, 12ug/mL 소 뇌 추출물, 50ug/가 보충된 완전한 내피 기저 배지(EBM)(Lonza, Cologne, Germany)에서 배양되었습니다. ml 겐타마이신, 10ng/mL 인간 표피 성장 인자, 및 37도 및 5% CO에서 10%(o/v) 태아 송아지 혈청을 세 번째 계대까지. 0.05%(o/o)Trypsin/EDTA(Thermo Scientific, Schwerte, Germany)로 분리한 후, 세포를 형질감염 또는 처리 전에 18시간 이상 동안 6cm 배양 접시 또는 6웰 배양 플레이트에서 배양했습니다.

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자세한 내용을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2.2.7. EC의 일시적인 형질감염

세포는 이전에 설명한 대로 형질감염되었습니다[65]. 간단히 말해서 EC는 제조사의 지시에 따라 SuperFectTransfection Reagent(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 형질감염되었다. AhR의 과발현 또는 녹다운은 각각 24시간 또는 48시간 후에 달성되었습니다. 과발현 시 transfection 효율은 약 40%였습니다.

2.2.8. EC의 스크래치 상처 분석

EC의 이동 능력을 조사하기 위해 이전에 설명한 대로 스크래치 상처 분석을 수행했습니다[66]. 상세하게는, 상처를 트레이스 라인을 따라 세포 스크레이퍼로 세포 단층으로 설정하였다. 손상 후, 부착되지 않은 세포는 부드러운 세척으로 제거하였다.시스탄체 살사 추출물커큐민 치료는 상처가 고정된 직후에 시행되었습니다. Cur-cumin을 DMSO에 녹여 최종 농도 7.5uM로 사용하였다. 세포가 고정된 후 PBS에서 5 ug/mL 4',{5}}디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)(Carl Roth, Karlsruhe, Germany)로 세포를 염색하여 EC 이동을 정량화했습니다. 실온에서 15분 동안 4%(v/v) 파라포름알데히드로. Zeiss AxioVision Observer D1 형광 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 200-배율로 이미지를 촬영했습니다. Image]1.52a]67I의 입자분석 기능을 이용하여 trace line에서 상처로 이동한 세포를 자동으로 카운트하여 중복 핵을 분리하였다.

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Cistanche 캔 안티 에이징

2.2.9. EC의 면역염색

EC는 실온에서 15분 동안 4%(o/v) 파라포름알데히드로 고정되었습니다. PBS 중 0.3%(o/o)Triton-X 100 및 3%(o/u)정상 염소 혈청에서 투과 및 차단 후 세포를 AhR(1:100, Abcam, Cambridge, United Kingdom) 또는 Nrf2(clone D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurt, Germany)를 PBS 중 1%(o/v) 정상 염소 혈청에 4℃에서 밤새 희석하였다. 그런 다음, 세포를 다음으로 세척하였다. PBS 및 Alexa{16}}결합된 염소 항토끼 IgG(1:500, Invitrogen, Darmstadt, Germany)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다.시스탄체 줄기액틴 염색을 위해 세포를 Alexa FluorTM 488 Phalloidin(1:70, Invitrogen, Darmstadt, Germany)과 함께 실온에서 20분 동안 배양했습니다. 핵은 실온에서 5분 동안 PBS 중 0.5 ug/mL DAPI로 대조염색되었고 세포는 ProLong'MDiamond Antifade Mountant(Invitrogen, Darmstadt, Germany)로 장착되었습니다. Zeiss AxioVision Observer D1 형광 현미경을 사용하여 400X 또는 200X 배율로 형광 이미지를 촬영했습니다.

2.2.10. 세포에서 qPCR

제조사의 지시에 따라 RNeasy Mini Kit(Qiagen(Hilden, Germany))를 사용하여 TRIzol™에서의 용해와 다운스트림 처리를 결합하여 전체 세포 RNA를 분리했습니다. cDNA 합성은 제조업체의 지침에 따라 1ug RNA가 포함된 QuantiTect9 역전사 키트(Qiagen(Hilden, Germany))를 사용하여 수행되었습니다. 상대적 전사 수준은 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix와 Rotor-Gene Q Thermal cycler(Qiagen(Hilden, Germany))를 사용한 PCR에 의해 결정되었습니다. ribosomal protein L32(rp132)의 전사체를 reference로 하여 AC method로 상대적 발현을 계산하였다[68]. 다음 Intron 스패닝 프라이머 쌍이 사용되었습니다. 대문자(유전자 수탁 번호 NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(gene 수탁 번호 NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(유전자 수탁 번호 NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTGGGTTC-3';rpl32(유전자 수탁 번호 NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCAGCAC{{ 41}}'.

2.3.마우스

2.3.1.마우스 계통 및 번식

암컷 8-12-주령("젊은") 및 18-월령("늙은") AHR 결핍 B6.129-AHRtmlBra/J(Schmidt et al., 1996; 참조 여기에서 AHR-KO) 마우스는 IUF의 동물 시설에서 이형 접합체로 사육되었습니다. 야생형 한배 새끼를 방제에 사용했습니다. 마우스를 12/12시간 명암 주기에서 특정 병원체가 없는 조건에서 사육하고 유지하고 표준 음식(ssniff"MZ, SSNIFF, Soest, Germany)을 임의로 제공했습니다. 2.3.2.qPCR in Mice

총 RNA는 TriZol[. 그런 다음 역전사효소 M-MLV(Promega, Madison, WI, USA)와 무작위 6량체 프라이머를 사용하여 400ng의 RNA를 역전사했습니다. 유전자 발현 수준은 Rotor-Gene Q(Qiagen, Hilden, Germany)에서 7.5μL Rotor Gene SybrGreenTM(Biorad, Feldkirchen, Germany) 1μM을 포함하는 15μL 최종 부피에서 각 마우스 조직에 대해 이중으로 측정되었습니다. ,1.5 μL cDNA 및 RNase 유리수. 프라이머 효율은 90%에서 146% 사이였습니다. 프라이머 서열 및 효율성은 표 S2를 참조하십시오. 발현 수준은 {{ 14}}CT 방법[69].

2.4.실리코 분석

CeAhR LBD의 상동성 모델링

C. elegans AhR LBD(잔기 267-372)의 구조 모델은 상동성 모델링에 의해 생성되었습니다. CeAhR PASB와 가장 높은 서열 동일성(약 20%)을 공유하는 상동 bHLH-PAS 패밀리 구성원의 PASB 도메인의 X선 구조를 주형으로 사용했습니다. 신경 PAS 도메인 함유 단백질 3(NPAS3, PDB:5SY7), 저산소증 유발 인자 20(HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N) 및 lo(HIFlo, PDB:4H6J). 모델은 MODELLER[70-72]로 가져왔습니다.cistanche tubulosa의 이점과 부작용생성된 10개 중에서 최적의 DOPE SCORE를 기준으로 최적의 모델을 선택하였다[73]. 모델의 품질은 PROCHECK[74]를 사용하여 평가되었습니다. 2차 구조는 DSSPcont[75]에 의해 설명되었습니다. 모델링된 LBD 내의 결합 공동은 CASTp 서버를 사용하여 특성화되었습니다[76]. 모델의 시각화는 PYMOL[77]을 사용하여 수행되었습니다.

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2.5.통계분석

달리 명시되지 않는 한, 통계 분석은 GraphPad Prism(버전 6.01)(GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA)에서 수행되었습니다. 수명/건강 기간 분석의 경우 OASIS[53]를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 마이크로어레이 데이터의 통계적 분석은 R(R Foundation(Vienna, Austria))에서 수행되었습니다. 상자 그림은 GraphPad Prism(버전 6.01)(GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA)에서 생성되었으며 중앙값(선),{5}}번째 백분위수(상자) 및 10-90번째 백분위수를 보여줍니다. (구레나룻).

3. 결과

3.1. 커큐민은 AhR 의존적이고 독립적인 방식으로 건강 기간을 촉진합니다.

ahr{0}}의 손실은 기초 조건에서 C.elegans의 건강과 수명을 촉진하고[14] 벤조[a]피렌(BaP), UVB와 같은 포유류 AhR 조절제에 대한 반응으로 연령 관련 특성에 부정적인 영향을 미칩니다. 빛, 미생물군 [25]. cur-cumin과 같은 식이 폴리페놀은 C. elegans에서 장수 효과가 있는 포유동물 AhR 조절제의 중요한 그룹을 형성하므로[78,79] 따라서 우리는 curcumin의 ahr에 대한 수명 연장 효과를 조사했습니다.{10}} 의존. 커큐민은 아르의존적 방식으로 C. elegans의 수명과 건강 기간을 재현 가능하고 상당히 연장했습니다(그림 1A,B). 이전에 우리는 헌팅턴병 및 파킨슨병 모델에서 hr{14}} 손실이 각각 응집되기 쉬운 폴리글루타민(polyQ40) 및 -synuclein( -syn)의 근육 과발현으로 수명을 연장한다는 것을 보여주었습니다. 동시에 단백질 응집체의 함량을 증가시킵니다[25]. 흥미롭게도 커큐민 처리는 ahr{23}} 기능 상실과 동일한 정도로 polyQ40 및 -syn 응집체의 수를 증가시켰습니다(그림 1C). Curcumin은 또한 이러한 질병 모델에서 수명과 운동 능력을 향상시켰지만(그림 1DE), ahr{26}} 손실과 curcumin 보충의 효과는 PolyQbackground에서 추가되어(그림 1D) AHR{28}}독립적인 보호 기능을 나타냈습니다. 적어도 이 손상된 배경에서 커큐민의.

그림 1. Curcumin은 AHR{1}}의존적이고 독립적인 방식으로 건강을 증진합니다. DMSO 또는 커큐민 처리된 wt 및 ahr{5}} 선충의 수명(A) 및 건강 기간(B) 곡선. 생존 곡선은 5개의 실험에서 290-300 벌레/조건의 통합 데이터를 보여줍니다. 통계 검정: 로그 순위 검정, # 유의성 대 DMSO,*유의성 대.wt, Bonferronip-값<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 커큐민과 ahr{4}} 고갈의 노화 방지 효과를 매개합니다.

커큐민의 다운스트림{0}}의존성 이펙터를 찾기 위해 우리는 표적화되고 편향되지 않은 접근 방식을 취했습니다. 우리는 curcumin이 포유류 세포에서 Cyp1A1 및 CyplB1 발현을 변경하기 때문에 고전적인 포유류 AhR 표적 유전자의 발현을 조사하고 Cyp 유전자에 초점을 맞췄습니다[80,81]. 그러나 반정량적 실시간 PCR(qPCR)로 C.elegans에서 47개의 서로 다른 cyp를 정량화하면 cyp-13B1만이 ahr{11}} 고갈 또는 curcumin에 의해 크게 상향 조절되는 것으로 나타났습니다. ahr{12}}의존 방식으로(그림 S1A-B), 다른 3개의 cyp(즉, cyp-13A5, cyp{17}}A8 및 cyp{19}}A1)는 ahr이 없는 경우에만 커큐민에 의해 증가합니다{21}}(그림 S1). 이 데이터는 다른 연구[25,82]와 함께 cyps가 CeAhR의 주요 표적이 아닐 가능성이 있음을 시사합니다. 이는 야생형 및 ahr{26}} 돌연변이의 전사체 분석에서도 뒷받침됩니다. 실제로, 뉴런 결정에서 AHR{27}}의 역할[37,38,40,41]과 일치하게, 야생형 돌연변이와 ahr{33}} 돌연변이 사이의 유전자 발현 변화는 뉴런 발달과 관련된 과정이 풍부함을 보여주었습니다. 및 분화 및 고전적인 해독 유전자의 주요 변화 없음(그림 2A). ahr{37}}(jul45)과 야생형(atf{40}} 사이에서 가장 상향 및 하향 조절된 일부 유전자의 qPCR 분석 , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3)대부분 기본 조건에서 ahr{60}}의존성을 확인했지만(그림 2B) UVB[25]나 커큐민(그림 2C) 모두 이 유전자의 발현에 유의한 영향을 미치지 않았습니다. 우리는 이 유전자의 발현 변화가 진화적으로 보존되는지 궁금하고 8- 및 18-월령 야생형 및 AhR KO 마우스. 일부 유전자는 조직 특이적 방식으로 어린(atf{68}} 상동체) 또는 노령(lpr{69}}/5 상동체) 마우스에서 발현이 증가하는 경향을 나타내었지만 명백한 패턴이나 보존된 변화는 없었습니다. 관찰됨(그림 S2). 이러한 결과는 C. elegans의 전체 동물 전사체 분석에서 간과된 포유동물에서 가능한 종별 차이 또는 조직 의존적 AhR 전사 활성을 반영합니다. C. elegans 야생형과 ahr{77}}(jul45) 사이에서 가장 차별적으로 발현되는 유전자에 대한 철저한 조사는 이러한 많은 유전자의 발현이 노화 동안 C.elegans에서 그리고 식이성 포유동물의 AhR 조절인자에 의해 영향을 받는 것으로 밝혀졌습니다( 예: 케르세틴 및 레스베라트롤)[25], 따라서 폴리페놀 조절 유전자 발현에서 AHR{80}}의 역할을 제안합니다. 이 시나리오에 따라 마이크로어레이 데이터는 커큐민 처리 시 차등적으로 발현되는 대부분의 유전자가 실제로 ahr{82}}의존 방식으로 조절되었음을 보여주었습니다(그림 2D, 표 1).시스탄체 튜불로사 추출물야생형에서 curcumin에 의해 변경된 47개 유전자(43개 상향 및 4개 하향 조절) 중 5개만이 ahr-1(ju145)에서 curcumin에 의해 유도되었습니다. AHR{9}}의존 방식으로 curcumin에 의해 조절되는 유전자 중에는 Phase II 효소가 있으며 흥미롭게도 그 중 일부(ugt{10}} 및 ugt{11}})는 curcumin에 의해 동일한 방향으로 조절되었습니다. orby ahr{12}} 손실(표 1). 따라서 다중 비교에서 수정되지 않은 덜 제한적인 통계 분석을 적용할 때 차등적으로 표현된 추가 ugts(ugt-45 및 ugt-57)의 표현과 그 표현을 확인했습니다. 조사된 유전자 중 ugt{16}}는 ahr{17}}(ijul45) 및 커큐민 처리에 의해 증가했습니다(그림 3A,B). 또한 야생형과 조직 의존적 방식으로 AhR KO 마우스. 이들 유전자의 차등 발현은 Ugt2a3(C.elegans의 경우 ugt-9 및 ugt-29)이 다운이고 Hpgds(C. elegans의 경우 gst-4)인 뇌에서 가장 높았습니다. 상향 조절되었습니다(그림 S3A). 마우스의 간 샘플에서 테스트된 유전자의 발현에는 변화가 없었습니다(그림 S3B). C,elegans 데이터와 일치하여, ugt{31}} 뮤린 상동체 Ugt3a2는 Ahr KO 마우스의 창자(그림 S3C). 특히, ugt{35}} RNAi는 커큐민(그림 3C,D) 또는 ahr{38}} 고갈(그림 3E,F)에 의해 촉진되는 수명과 건강 기간에 대한 유익한 효과를 방지했으며, 이는 두 가지 중재가 다음에 의존할 수 있음을 나타냅니다. 노화 방지 활동을 유도하기 위해 다운스트림 신호를 공동으로 변조했습니다.

그림 2. 커큐민에 의해 차등적으로 조절되는 유전자는 주로 ahr{1}}의존 방식으로 조절됩니다.(A) GO 용어 융합 후 생물학적 과정에 대한 유전자 온톨로지(GO) 농축(ahr{2}} 대 wt. (B, C) wt와 ahr-1[25] 사이의 가장 강력한 하향 및 상향 조절 유전자의 발현은 wt 대 ahr-1(B) 및 DMSO-vs에서 qPCR에 의해 평가되었습니다. . 커큐민 처리된 선충류(C). 상자 그림은 3번의 실험에서 얻은 데이터를 보여줍니다. 식은 DMSO 처리된 wt(점선)에 대해 표시됩니다. 통계 테스트:{12}}Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 방법 ANOVA,*p-값<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

그림 3.ugt-45는 curcumin 및 ahr-1 돌연변이의 수명 연장에 필요합니다. (A, B) 유전자 발현은 wt 대 ahr-1(A) 및 DMSO 대 커큐민 처리된 wt 선충(B)의 qPCR에 의해 평가되었습니다. 상자 그림은 3번의 실험에서 얻은 데이터를 보여줍니다. 식은 DMSO 처리된 wt에 대해 표시됩니다(점선으로 표시). 통계 테스트: 2-Sidak의 다중 비교 테스트를 사용한 Way ANOVA, *p-값<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 및 커큐민은 산화 스트레스로부터 독립적으로 보호합니다

폴리페놀의 유익한 특성은 종종 반응성 산소종(ROS)으로부터 보호하는 능력에 기인합니다. AhR은 산화 스트레스 매개 과정[85-87]에 관여하기 때문에 우리는 커큐민이 AhR 조절 항산화 반응을 통해 동물의 생리에 영향을 미칠 수 있는지 궁금했습니다. 우리는 ahr-1 돌연변이가 더 많은 미토콘드리아(mt)ROS를 생성하고 미토콘드리아 막 전위가 감소한다는 것을 관찰했는데(그림 4A,B), 수명과 상관관계가 있는 두 가지 매개변수[88,89]. mitohormesis 패러다임 ahr{10}}(jul45)과 일치하는 반면, 이 동물은 야생형보다 약간 더 많은 mtROS를 생성하고 더 오래 살지만 산화 스트레스에 더 민감합니다. 특히 juglone과 H2O2가 동물의 점프, 운동성 및 생존에 미치는 해로운 영향은 야생형에 비해 ahr{14}}(jul45)에서 훨씬 더 강력했습니다(그림 4C-F). 이러한 데이터는 AHR{18}} 고갈이 기초 조건에서 유익한 운동 의학적 효과를 갖는 반면 산화 스트레스 보호를 위해서는 AHR의 존재가 필요하므로 수명과 스트레스 저항이라는 종종 상관 관계가 있는 두 가지 연령 관련 매개변수를 분리할 수 있음을 시사합니다. 대신 커큐민은 야생형 돌연변이와 ahr{21}} 돌연변이 모두에서 H,O 및 주글론 내성을 크게 개선했으며(그림 4E,F), 커큐민이 ahr{23}}독립적인 항산화 반응을 유도함을 시사합니다. 수명 및 산화 스트레스 저항성의 결합되지 않은 조절과 일치하게, ugt{24}} 침묵은 ahr{25}} 돌연변이 또는 커큐민 처리 동물에 대한 산화 스트레스에 대한 민감도에 영향을 미치지 않았습니다(그림 4G).cistanche tubulosa 리뷰따라서 커큐민은 ahr-1 및 ugt-45를 통해 장수 효과가 있지만 ahr-1-독립적인 메커니즘을 통해 산화 스트레스로부터 보호합니다.

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3.4. Nrf2/SKN-1은 커큐민의 AhR 독립 효과를 매개합니다.

추가적인 연령 관련 기능에서 AhR-커큐민 누화를 추가로 평가하기 위해 우리는 인간의 일차 EC에서 이동 능력을 측정했습니다. 이는 혈관 기능의 특징으로, 연령이 증가함에 따라 감소하고 [90] AhR 활성화 [14]에 의해 감소됩니다. ahr{5}} 억제 및 curcumin의 노화 방지 활성과 함께, AhR 과발현은 현저하게 억제된 반면 curcumin은 증가하여 1차 인간 EC의 이동 능력이 증가했습니다(그림 5A). 참고로, 커큐민에 의한 이동 능력의 유도는 빈 벡터 또는 AhR 발현 벡터가 형질감염된 세포에서 유사했습니다(그림 5A). 그러나 커큐민 처리된 세포의 이동은 AhR 과발현에 의해 크게 감소했습니다. 커큐민은 빈 벡터 형질감염된 세포에서 고전력 필드당 최대 60개의 이동된 세포를 유도하는 반면, AhR 과발현 세포에서는 고전력 필드당 최대 25개의 세포만 유도합니다(그림 5A). 이러한 데이터는 커큐민의 이동 촉진 효과가 AhR-독립적 메커니즘에 의해 조절되지만 아마도 AhR 활성의 감소에 의해 조절될 수 있음을 시사합니다. 우리는 다음으로 curcumin 처리된 인간 EC에서 세포내 AhR 분포와 cVpla의 발현을 결정했으며, Curcumin은 AhR-핵 전좌(그림 5B) 또는 cypral 발현(그림 5C)에 영향을 미치지 않았습니다. AhR과 무관한 방식으로 커큐민에 의해 조절되는 경로를 찾기 위해 우리는 ahr{23}} 또는 야생형 동물에서 커큐민 처리에 의해 크게 조절되는 유전자를 조절하는 전사 인자를 찾기 위해 선충 전사체 프로필로 돌아갔습니다(표 1 ). 이 in silico 검색은 인간 Nrf2(핵인자 적혈구계 2-관련 인자 2)의 이종인 산화환원 전사 인자 SKN{26}}을 확인했으며, 이 인자의 커큐민[91]에 의한 활성화는 항산화 활성 [92,93]. 따라서 프로토타입 C.elegans Nrf2/SKN{35}}의존 유전자 gst{36}}는 alhr{37}} 돌연변이[25]에서 과발현되고 야생형에서 커큐민에 의해 유도됩니다. ahr{40}} 돌연변이에서(그림 5D). 더욱이, 커큐민은 1차 인간 EC에서 Nrf2의 안정화 및 핵 전위를 증가시켰고(그림 5E) 빈 벡터로 형질감염된 세포 또는 AhR은 shRNA에 의해 침묵됩니다(그림 5F). EC에서 AhR shRNA에 의한 Sod2 유도의 부족은 발현의 부분적 감소(50%) 때문일 수 있으며(그림 S3D), 이는 Nrf2 또는 추가 전사 인자(TF)의 활성화를 촉발하기에 충분하지 않을 수 있습니다. , C.elegans에서 완전한 AhR 고갈 시 gst의 유도에 동의할 수 있습니다. 흥미롭게도 C.elegans gst-4의 상동체인 Hpgds는 AhR KO 마우스의 뇌에서 크게 증가했지만(그림 S3A) Nrf2의 표적은 아닙니다. ahr{58}} 고갈에 의해 활성화된 Nrf2/SKN{57}} 독립적인 신호에 대한 추가 증거는 curcumin에 의한 gst{59}} 활성화가 피부의 RNAi에 의해 완전히 억제된다는 것입니다. C.elegans 야생형인 반면 ahr{61}} 돌연변이는 피부 고갈에도 불구하고 여전히 gst{62}}를 유도합니다(그림 5G, H). 그러나 skin{65}} RNAi는 야생형과 ahr{67}} 모두에서 산화 스트레스 저항성을 감소시켰습니다(ju145)(그림 5I). 예상외로 피부 침묵은 커큐민 처리 동물의 주글론 내성에 영향을 미치지 않았습니다(그림 5I). 우리의 데이터는 커큐민이 AhR 의존성 또는 AhR 독립적이지만 Nrf2/SKN{77}}의존성(및 추가) 신호에 의존하는 다양한 노화 방지 기능을 촉진하는 복잡한 시나리오를 보여줍니다.

그림 4. AHR-1과 curcumin은 산화 스트레스로부터 독립적으로 보호합니다. (A) MitoSOX로 염색된 wt 또는 ahr{3}} 선충의 대표적인 이미지(왼쪽) 및 DSRed 강도 정량화(오른쪽). 상자 그림은 3개의 실험에서 129-135개의 웜/조건에서 풀링된 데이터를 보여줍니다. (B) 미토콘드리아 막 전위는 표시된 연령의 선충에서 TRME 염색에 의해 평가되었습니다. 대표적인 이미지(왼쪽)와 TMRE 형광의 정량화(오른쪽)가 표시됩니다. 상자 그림은 3개의 실험에서 통합된 데이터를 보여줍니다.(C,D) H2O2 처리 후 wt 및 ahr{7}} 돌연변이의 인두 펌핑 활성(C) 및 운동성(D). 상자 그림은 39-54실험의 39-54(C) 또는 35-36 웜/조건(D)에서 풀링된 데이터를 보여줍니다.*p-값<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

그림 5. 커큐민은 AhR과 무관하게 Nrf2/SKN-1을 활성화합니다.(A) 빈 벡터(EV) 또는 인간 AhR. 상단 패널: 대표 사진; 파선은 마이그레이션 시작을 나타냅니다. 스케일 바: 100 um. 하단 패널: 정량화; 상자 그림은 4-6실험 데이터를 보여줍니다. 통계 테스트:1-방법 ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. 커큐민과 산화촉진제는 AHR-1 활동에 반대 효과를 나타냅니다

감소된 AhR 발현/활성의 노화 방지 효과와 일치하게, 당사의 데이터는 커큐민이 AHR-1- 발현/활성의 감소 또는 작용을 통해 AHR{1}}조절 경로를 억제함으로써 C.elegans의 수명을 연장할 수 있음을 시사합니다 일반적인 다운스트림 신호 전달 경로에서. 따라서 우리는 C.elegans에서 AHR-1 활성을 정량화하려고 시도했지만 항체(포유류 AhR 또는 CeAhR에 대한 맞춤형 항체) 또는 형광 태그를 사용하여 AHR-1 발현 및 세포내 국소화를 평가하려는 수많은 시도가 있었습니다. 기자(OP562, UL1709, ZG93)는 의미 있는 증거를 제공하지 않았습니다. AHR-1이 시험관 내에서 XRE에 결합한다는 점을 고려할 때[35], 우리는 XRE 기반 유전자 발현을 AHR{12}} 활성에 대한 판독값으로 사용하는 것으로 생각했습니다. 따라서 우리는 내인성 AhR을 발현하지 않아 내인성 AhR 활성을 나타내지 않는 원숭이 유래 Cos7 세포로 눈을 돌렸습니다. 활동(Larigot et al.; 이 연구와 함께 제출됨). Cos7 세포를 C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1 및 인간 CYPIA1 유전자의 루시페라제 결합 XRE 함유 프로모터를 발현하는 벡터로 공동 형질감염시킨 경우 [64] AHR{ {27}}는 기본(비히클 처리) 조건에서 낮은 활성을 보였다. 참고로, 루테인[97] 및 레스베라트롤[98,99]과 같이 C.elegans의 건강한 노화를 촉진하는 커큐민 또는 기타 기능식품을 사용한 치료는 AHR-1 활성을 유의하게 억제했습니다(그림 6A-C). 대신 포유류에서 알려진 AhR 활성제인 BaP와 leflunomide는 우리가 사용한 농도에서 AHR{35}} 활성에 영향을 미치지 않았습니다(그림 6A,B). 특히, AHR-1 활성은 야생형 대립유전자 대신 ahr{39}}(jul45) 대립유전자를 발현하는 벡터로 형질감염된 Cos7 세포에서 폐지되었으며(그림 6A-C), 이는 jul45가 참임을 시사합니다. 기능 상실 대립유전자이고 측정된 루시퍼라제 강도는 기능적 AHR{47}} 때문입니다.

그런 다음 curcumin이 직접 결합 또는 간접 변조를 통해 AHR{0}}의 활성을 감소시키는지 여부를 조사했습니다. 현재까지 C.elegans AHR-1의 리간드는 확인되지 않았으며 LBD에 대한 정보가 없기 때문에 이를 특성화하기 위해 in silico 분석을 수행했습니다. 두 AHR-1 isoforms, la 및 1b가 정렬되었으며 길이는 다르지만 PASB 도메인 서열은 동일합니다. 그런 다음 이 서열은 Drosophila melanogaster의 PASB 도메인과 구조 모델이 이전에 생성된 척추동물, 즉 마우스(Mus musculus)[100] 및 zebrafish(Danio rerio)[101]의 두 AhR 도메인에 정렬되었습니다. 6D). 정렬은 나선형 번들(C , D , E 나선) 및 이러한 요소(그림 6D,E). 이러한 삭제는 이러한 AhR의 결합 공동에서 사용 가능한 공간을 줄일 수 있습니다. 그런 다음 상동성 모델링을 통해 AHR-1 PASB의 3D 모델을 생성했습니다. 이 모델은 일반적인 PAS 접힘을 나타내지만 다른 AhR에 비해 Do 나선이 더 짧습니다. 그러나 내부 공동에는 몇 가지 특성이 있습니다. 그것은 더 많은 소수성 잔기를 포함하고 일부 내부 측쇄에 의해 반으로 잘립니다. 특히, H365와 H274는 마주보고 있으며 공동의 중간에 수소 결합을 형성할 수 있습니다. 또한 Y332, L363 및 L302 측쇄가 공동을 방해하여 리간드에 사용할 수 있는 내부 공간을 줄일 수 있습니다(그림 6E). 이 작고 잘린 공동은 큰 리간드(예: TCDD 또는 커큐민)의 결합을 허용하지 않을 가능성이 높습니다. AHR{16}} 구조 모델과 유사하게 zebrafish zfAhRla 모델은 TCDD 결합 파라로그 zfAhR1b 및 zfAhR2에 비해 LBD 공동이 잘린 것으로 나타났습니다[101]. leflunomide와 같은 작고 유연한 리간드는 zfAhRla에 결합하여 활성화하지만 테스트한 leflunomide 농도는 Cos7 세포 시스템에서 AHR{21}}을 활성화하지 않았습니다(그림 6B). 그런 다음 우리는 LBD의 작은 공동을 담당하는 아미노산의 돌연변이가 고전적 리간드가 CeAhR을 활성화할 수 있는지 궁금해했습니다. CeAhR L363 잔기(그림 6D)는 mAhRb-I의 A375 및 마드리드의 V375에 해당하며 이 잔기는 리간드 결합에 중요한 영향을 미칩니다[102]. 유사하게, zfAhRla의 T386(그림 6D)은 mAhRb-1의 A375 및 zfAhR1b 및 zfAhR2의 A386과 일치하며, zfAhRla의 TCDD 결합 부족에 기여하고, 알라닌으로 돌연변이될 때 Y296DDH 감도도 복원합니다. 도입[101]. 아미노산 Y296은 C.elegans(H274)에서 이미 히스티딘입니다. 따라서 우리는 CeAhR 벡터의 위치 L363에 있는 류신만 알라닌(L363A)으로 돌연변이시켰습니다(그림 6D,E 화살표로 표시). 또한, H365 위치의 인근 히스티딘을 글루타민(H365Q)으로 돌연변이시켰으며, 이는 마우스에서 Q377입니다(그림 6D, E는 화살표로 표시됨). 이는 H274와 수소 결합을 형성할 가능성이 있고 AHR의 작은 공동에 기여할 수 있기 때문입니다{ {49}}(그림 6E). 그런 다음 L363과 H365가 돌연변이되었을 때 포유류 AhR 리간드가 AHR{51}} 활성에 영향을 미치는지 테스트했습니다. 그러나 이러한 변경은 zebrafish[101]에서와 같이 생체이물 리간드에 대한 반응을 복원하는 대신 ju145 대립 유전자와 유사한 기본 AHR{55}} 활성을 제거했습니다(그림 6F). 이러한 결과는 C.elegans와 zebrafish의 LBD 사이에 분명한 차이를 보여주지만 LBD가 기초 AHR{58}} 활동에 기본임을 보여줍니다. 이전 연구[35,38,82]와 함께 우리의 결과는 AHR{62}}이 고전적인 생체이물에 의해 유도된 트랜스활성화 반응에 관여할 가능성이 낮기 때문에 규제되는 hr{64}}과 관련이 없을 수 있음을 시사합니다. 생리적 노화. 대신, 식물 유래 화합물은 AHR 조절 경로의 억제를 통해 최소한 부분적으로는 보존 효과를 발휘할 수 있습니다. 우리의 3D 모델은 curcumin이 LBD를 결합하여 AHR{68}} 활성을 조절하지 않는다고 제안합니다. 따라서 커큐민에 의한 AHR{69}} 활성 억제는 항산화 효과 때문일 수 있습니다. 이러한 가능성과 산화 스트레스에 대한 C.elegans ahr{70}} 돌연변이의 증가된 감도와 일치하여, 우리는 AHR{71}} 활성이 실제로 ROS 유도제에 의해 증가한다는 것을 발견했습니다. 즉, 산화촉진제 로테논으로 처리된 Cos7 세포는 C.elegans 또는 murine AhR로 형질감염되었을 때 증가된 AhR 활성을 나타내었지만 jul45 대립형질 또는 LBD 돌연변이가 있는 대립형질로 형질감염된 경우에는 증가하지 않았습니다(그림 6G, H).

전반적으로 CeAhR 활성화는 초기에 산화 스트레스로부터 보호하지만, 감소된 발현은 노화를 방지하고 커큐민의 유익한 노화 방지 효과를 매개합니다(그림 7). 따라서 커큐민은 상황 및 시간 의존적인 방식으로 산화환원 TF 활성화의 균형을 유지하고 항산화 효과를 통해 직접적으로 및/또는 Nrf2/SKN-1(또는 기타 TF)의 활성화를 통해 AhR 억제를 촉진할 수 있습니다. 커큐민의 항노화 작용을 매개합니다.

그림 6. 커큐민과 산화촉진제는 AHR-1 활성에 반대 효과를 나타냅니다. (AC) ju145 점 돌연변이(ju145) 및 AHA{10}} 및 XRE 유도성 루시페라제 상자 그림은 3-5실험 데이터를 보여줍니다.* p-값<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

그림 7. 프로 및 항산화제에 대한 C.elegan의 반응에서 AHR{1}} 신호 전달 경로의 제안된 모델. "정상" 조건(중간 패널)에서 AHR-1은 세포 내 ROS에 의해 활성화됩니다. 이것은 세포질 AHR-1에서 샤페론의 방출과 AHR-1의 후속 핵 전위로 이어집니다. 핵에서 AHR-1은 AHR 핵 전위(AHA{ {7}}) 표적 유전자의 XRE에 결합하여 세포 내 ROS 수준을 감소시킵니다. 이러한 조건에서 hr-1 기능이 손실되면 수명이 늘어납니다. 항산화제가 있는 경우(왼쪽 패널), 세포 내 ROS 농도가 낮아서 세포질에 존재하는 AHR{9}}이 보조 인자에 의해 결합됩니다. 기초 AHR{10}} 활동을 억제하면 수명이 연장됩니다. 산화촉진제가 존재하는 경우(오른쪽 패널) AHR{12}}은 과도한 ROS에 의해 활성화되어 핵 전위, AHR{13}}AHA{14}} 이종이량체 형성 및 표적 유전자 전사. ahr{15}} KO에서 AHR{16}} 유도 표적 유전자를 통한 ROS의 해독 감소는 ROS의 축적을 유도하고 ahr{17}} KO에 취약하게 만듭니다.

4. 토론

AhR은 원래 환경 독성 물질 또는 내인성 리간드의 결합에 따라 유도된 생체 이물 반응 활성에 대해 포유동물에서 발견되었지만 리간드 결합에 의존하지 않는 조절인자도 존재하지만 훨씬 덜 조사됩니다. C.elegans는 CeAhR이 프로토타입 AhR 리간드에 결합하지 않기 때문에 고전적인 생체외 반응과 독립적으로 AhR 활동을 조사하기 위한 독특한 모델 유기체를 나타냅니다[35,39]. 이 모델을 사용하여 노화 과정에서 AhR의 진화적으로 보존된 기능을 확인하고[14] 포유류의 일부 AhR 조절자(예: 박테리아, Bal, UVB)가 AHR-1을 통해 노화 매개변수에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 문맥 의존적 방식[25]. 여기에서 우리는 식이성 폴리페놀 커큐민에 의해 종 전반에 걸쳐 AhR 조절 노화 기능에 대한 보다 기계적인 조사를 통해 이전 연구 결과를 따랐습니다. 생체 내, 시험관 내 및 실리코 분석을 결합한 결과 새롭고 복잡한 시나리오가 밝혀졌습니다. 커큐민은 적어도 부분적으로는 AhR 의존적 방식으로 선충류와 인간의 1차 EC에서 노화 방지 기능을 촉진하지만 두 종에서의 항산화 효과는 다음과 같습니다. AhR 독립적이지만 주로 Nrf2/SKN{11}} 종속 메커니즘에 있습니다.

우리는 커큐민이 AHR{0}}의존 방식으로 C.elegans의 생리학적 노화를 지연시킨다는 것을 처음으로 보여주었습니다. curcumin의 가능한 다운스트림 ahr{1}}의존 이펙터를 찾기 위해 우리는 표적화되고 편향되지 않은 접근 방식을 사용했으며 커큐민 치료 시 차등적으로 조절되는 유전자의 대부분이 AHR{2}}의존 방식으로 조절된다는 것을 발견했습니다. 또한, 이들 유전자 중 다수는 AHR{3}}이 고갈되고 curcumin 처리된 동물에서 유사한 발현 패턴을 나타내어 curcumin이 AHR{5}} 활성 억제를 통해 수명 연장을 촉진하고 있음을 시사합니다. 놀랍게도, 표적 분석이나 전사 분석 모두 컵과 같은 고전적인 AhR 표적 유전자에 대한 주요 역할을 나타내지 않았으며, 대신 뉴런에서 과소발현되는 것으로 밝혀졌습니다(Larigot et al., 이 연구와 함께 제출됨). 흥미롭게도, 이러한 발견은 전체 동물 transcriptomics가 cps 유전자를 통해 이 특정 경우에 AhR의 신경 세포 특이적 효과를 가릴 수 있음을 나타낼 수 있습니다. 우리는 차등적으로 발현되는 유전자 중 많은 부분이 내장과 같은 II상 해독 효소에 속한다는 사실을 발견했습니다. 이 효소는 ahr 고갈(및 AhR KO 마우스의 뇌에서)에 의해 증가되었습니다. 수명 연장을 중재하는 커큐민 치료. 대신 커큐민 처리와 ahr{12}} 고갈은 다른 기전을 통해 또 다른 II상 해독 효소인 GST{15}}의 발현을 증가시켰습니다. 전자는 Nrf2/에 의존하고 후자는 주로 Nrf2/ SKN{17}}, C.elegans의 산화 스트레스 시 GST{18}}를 유도하는 고전적인 산화환원 TF[103]. 또한 커큐민은 C.elegans(GST{22}} 발현) 및 인간의 1차 EC(Sod2 발현 및 이동 능력)에서 Nrf2/SKN{21}}의존적 반응을 유도하지만, SKN{24}}독립적인 방식입니다. C.elegans에서 커큐민은 매우 아픈 피부{25}}(zu67) 돌연변이[104]에서 수명을 연장할 수 없는 반면 GST{28}}는 EGF 신호 전달에 의해 SKN{29}}독립적인 방식으로 유도될 수 있습니다. [94] 포유류에서 EGF 경로와 AhR 사이의 누화가 보고되었다[105].

흥미롭게도 야생형 균주와는 반대로 헌팅턴병과 파킨슨병에 대한 선충 모델에서 각각 AHR{1}커큐민이 건강 범위에 미치는 영향을 관찰했습니다. 이 균주에서 커큐민 처리는 단백질 응집체의 수를 AHR{2}} 결핍과 동일한 정도로 증가시켰으며, 이는 단백질 응집체 자체의 보호 효과 및/또는 단백질 응집체에 대해 보호하는 경로의 커큐민 활성화를 나타냅니다. 시간-1 소모. 단백질 응집에 대한 커큐민의 영향은 논란의 여지가 있습니다. 커큐민은 섬유소 형성을 억제할 뿐만 아니라 아밀로이드 생성 단백질의 전섬유성/올리고머 종과 결합하여 응집을 가속화하고 전반적인 신경독성을 감소시키는 것으로 나타났습니다[106]. 참고로, 심혈관 노화[66,107]의 특징도 보호하는 카페인은 A 응집체를 감소시키지 않고 보호 Nrf2/SKN{10}의존 경로[108]를 활성화하여 A 유도 마비를 예방합니다. C.elegans 질병 모델에서 커큐민 또는 모든 고갈에 의해 유도된 보호 효과가 올리고머/원섬유전 종을 독성이 덜한 응집체로 제거하는 것을 촉진하는 메커니즘에 의해 매개되는지 여부를 평가하는 것이 중요합니다. 단백질 독성으로부터 동시에 보호할 수 있는 Nrf2/SKN{15}}과 같은 다른 메커니즘의 활성화. 참고로 해독 효소는 XRE와 ARE(항산화 반응 요소)를 모두 포함할 수 있으며 Nrf2/ARE와 AhR/XRE 조절 신호 사이의 상호 작용이 설명되었습니다[109]. 따라서 커큐민이 Nrf2와 AhR 조절 신호 간의 균형을 통해 다양한 유익한 노화 방지 효과를 촉진하는 방법을 명확히 하는 것은 흥미로울 것입니다.

우리의 결합된 접근 방식은 curcumin이 AHR{0}} 활동을 억제한다는 것을 보여주었습니다. 포유동물에서 커큐민의 AhR 억제 효과는 직접적인 LBD 결합[110] 또는 AhR을 인산화하는 단백질 키나제 C의 억제[79]에 의해 매개되는 것으로 제안되었습니다. 또 다른 연구에서는 AhR의 전사 활성이 세포의 산화환원 상태와 염색질 구조에 의존하며, 둘 다 커큐민의 영향을 받는 것으로 나타났습니다[111]. AHR-1은 TCDD에 결합하지 않지만 시험관 내에서 XRE에는 결합하지만[36] AHR-1을 조절하는 다방향족 탄화수소 또는 기타 포유류 AhR 리간드의 잠재력을 다루는 체계적인 연구는 주로 다음과 같은 이유로 누락되었습니다. 그것을 평가할 적절한 도구가 부족합니다. 우리의 연구는 이 격차를 메우고 루시페라제 분석(Larigot et al.; 이 연구와 함께 제출됨)과 결합된 AHR{8}}을 발현하는 Cos7 세포를 활용하고 C. elegans LBD의 인실리코 모델링을 통해 커큐민이 AHR을 억제한다는 사실이 밝혀졌습니다. -1 활동이지만 직접 LBD 바인딩에 의한 것은 아닙니다. 우리 연구에 사용된 시험관 내 분석은 CeAhR이 고전적인 생체 신호를 통해 활성화되지 않는다는 것을 확인했습니다. 그러나 이것은 PON1에서 발견되는 폴리페놀(퀘르세틴) 반응성 XRE와 같이 CYP1A1에서 발견되는 "고전적인" XRE 이외의 DNA 서열에 대한 AhR 결합으로 인한 활성을 나타내지 않을 것입니다[112,113]. 인간 1차 EC의 면역염색은 또한 AhR 과발현 세포에서 이동 능력의 촉진 효과와 함께 커큐민이 AhR 활성을 억제한다는 것을 나타낼 수 있는 AhR 핵 전위를 유도하는 커큐민에 반대합니다.

우리는 AhR 결합에 의존하기 보다는 커큐민의 억제 효과가 항산화 능력을 포함한다고 제안합니다. 이는 실제로 Nrf2/SKN-1의 활성화와 관련되거나 의존할 수 있습니다. 포유류의 AhR은 LBD와 무관한 산화 변형을 통해 ROS에 의해 활성화되지만[85], 우리의 데이터는 산화촉진제 로테논에 의한 AHR{4}} 활성의 유도가 LBD를 필요로 함을 보여줍니다. ROS 매개 AhR 활성화의 간접적인 메커니즘은 강력한 AhR 리간드 FICZ[114]의 형성입니다. 그러나 FICZ는 우리의 in silico 모델에 따르면 AHR-1 LBD에 맞지 않는 큰 평면 분자입니다. AHR-1 활성이 ROS에 의해 촉진되고 curcumin에 의해 억제되는 정확한 기전(직접 ROS 퀜칭을 통해 또는 Nrf2 또는 기타 항산화제 조절 유전자의 활성화를 통해 간접적으로)은 아직 확립되지 않았지만 이것은 우리의 연구에 의해 강력하게 뒷받침됩니다. 결과: AHR{11}}은 로테논에 의해 활성화되고, ahr{12}} 돌연변이는 더 많은 mtROS, 감소된 미토콘드리아 막 전위를 나타내며 H, O, juglone 및 UVB 및 BaP [25] , 둘 다 ROS를 생성합니다[115,116]. 이러한 맥락에서, ahr{16}} 돌연변이가 미토호르메시스의 기능과 유사한 미토콘드리아 기능의 가벼운 변화를 나타낸다는 점에 주목하는 것은 흥미로울 것입니다[117. 이는 모든{18}} 고갈(및 AHR을 억제하여 가능한 커큐민{19}})이 다른 미토콘드리아에서 유사하게 조절되는 해독 유전자를 통해 C.elegan의 수명을 연장하는 것으로 알려진 가벼운 미토콘드리아 스트레스를 통해 건강 수명을 촉진할 수 있음을 시사합니다. {20}} 돌연변이 [118,119]. 또한 Nrf2/SKN{24}}과 미토콘드리아가 커큐민 치료 시 AHR{25}} 활성을 조절하는 역할을 하는지 여부는 아직 검증되지 않은 흥미로운 가능성입니다.

전반적으로 생체 내 연구를 위해 선충 C.elegans가 제공하는 여러 기능을 활용하여 AhR의 조상 기능은 생체 내 반응보다 항산화제와 관련된 2상 효소의 조절에 있을 수 있다고 제안합니다. 높은 수준의 ROS에 의해 유발되는 해로운 효과와는 반대로, AhR 결핍에 의해 촉진되는 유익한 효과는 Nrf2/SKN-1에도 의존하는 약한 미토콘드리아 스트레스 및/또는 약한 ROS 생성(미토호르메시스)에 의해 매개될 수 있습니다. 우리는 또한 커큐민과 AhR 사이의 상호작용에 대한 강력한 증거를 제공합니다. AhR 신호 전달의 커큐민 억제는 진화적으로 보존되며 AhR LBD에 대한 결합에 의해 매개되지 않고 오히려 커큐민의 ROS 소거 특성 또는 Nrf2/SKN-1의 활성화를 통해 매개됩니다. Nrf2 신호 경로는 실제로 다른 방식으로 커큐민에 의해 활성화될 수 있습니다[91]. 마지막으로, 우리의 데이터는 커큐민이 C.elegans(GST{12}} 발현 증가 및 산화 스트레스 저항성)와 인간의 1차 EC(Sod2 발현 및 이동 능력 증가) 모두에서 독립적인 방식으로 노화 방지 효과를 촉진한다는 것을 보여주었습니다. ), 이는 또한 polyQ 발현 동물의 건강 기간에 대한 커큐민의 추가 효과와 AHR{14}} 기능 상실을 설명할 수 있습니다.

5. 결론

결론적으로, in silico, vitro 및 in vivo 접근법의 독창적인 조합을 통해 우리는 CeAhR 활성화가 생애 초기에 산화 스트레스로부터 보호하는 반면 감소된 발현은 노화를 방지하고 curcumin의 유익한 노화 방지 효과를 매개한다는 것을 보여주었습니다(그림 7). . 따라서 커큐민은 노화 또는 노화와 같은 변화(AhR 증가 및 Nrf2/SKN 감소-1) 조건에서 해독/항산화 반응(AhR 억제 및 Nrf2 활성화)과 관련된 다양한 전사 인자의 활성 균형을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 연령 관련 장애. 우리의 작업은 유기체의 건강과 수명에 중요한 영향을 미치면서 이미 광대한 AhR의 다기능 및 상황별 활동에 복잡성을 한 단계 더 추가합니다. 또한, 포유류에서 확인될 가능성이 적은 AhR의 조상 기능을 발견하고 조사하기 위해 선충 시스템을 사용하여 추가 연구의 문을 엽니다.

이 기사는 항산화제 2022, 11, 613에서 발췌했습니다. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants