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Cistanche Tubulosa의 노화 및 고급 당화 최종 산물의 비침습적 바이오마커로서의 자가형광

Apr 11, 2023

논의

이전에는 노화의 바이오마커로서 노화 색소인 리포푸신을 모니터링하는 데 자가형광이 사용되었습니다.4,13. 우리는 빨간색을 관찰했지만플로리다이전 연구에서 볼 수 있듯이 리포푸신을 나타내는 형광9, 파란색플로리다형광은 M165 FC를 사용하여 벌레를 조사했을 때 삶의 초기 단계에서 감지되었습니다.플로리다형광 실체현미경(Leica Microsystems, Tokyo, Japan)(데이터는 표시되지 않음). 본 연구의 목적은 파란색 자가형광이 개별 벌레의 노화를 추적하는 데 더 민감한 마커 역할을 할 수 있는지 조사하는 것이었습니다.

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그만큼플로리다개별 벌레에서 측정된 형광은 나이가 들면서 증가했습니다. 더 적은 벌레플로리다부족할수록 기대 수명이 길어집니다. 따라서 파란색플로리다형광은 노화를 추적하기 위한 대체 바이오마커를 제공할 수 있습니다. 그러나 Pincus et al. 이후에 사망한 벌레(24시간 이내)를 보고했습니다.플로리다키누레닌의 생합성으로 인해 손실됨; 그 연구원들은 이 푸른 빛을"죽음플로리다형광". 보도에 따르면 사망플로리다형광 재플로리다키누레닌 경로에 의해 생성된 안트라닐산의 글리코실화 형태에 의한 방출 요법; 자동차플로리다uorescing 물질은 lysosome-like gut granules에서 검출됩니다.31. 이 푸른 빛은 Coburn et al. 에서 관찰C. 엘레강스사망 전후 몇 시간 동안, 치명적인 부상을 입은 어린 벌레와 나이가 들면서 자연사하는 벌레 모두에서 그런 현상이 나타났다고 합니다. 실제로, 우리는종류-1kynureninase 활성이 결여된 변이체는 야생형보다 자가형광이 적었다. 그러나 우리의 결과는 파란색의 일부가플로리다형광은 죽음보다는 노화와 관련이 있습니다. 특히, Fig.3b, 노화 벌레는 파란색이 증가했습니다.플로리다사망 전 2일 이내에 얻은 데이터를 제외하더라도 형광. 게다가 벌레는 여전히플로리다상태와 상관없이 노화에 따라 더 많이 감소합니다.키누-1유전자. 줄인플로리다의 형광키누-1따라서 돌연변이는 손실로 인한 것입니다죽음의 부족보다는 kynurenines에 의한 AGE 합성의 가속플로리다형광32.


특정 AGE 화합물은플로리다형광등27. 우리는 파란색이플로리다형광에는 사망에 기인한 것과는 별도로 해당 AGE의 방출이 포함될 수 있습니다.플로리다형광. 추출된 벌레 단백질을 체외에서 당과 함께 배양했을 때,플로리다형광 강도와 AGE 수준은 시간이 지남에 따라 증가했습니다. 리보스를 포함하는 배지에서 배양된 벌레플로리다대조군 동물보다 더 많은 양이 리보스를 보충하지 않고 자란다.키누-1변이했다. 대조적으로, AGEs 생산의 알려진 억제제인 ​​리팜피신이 있는 상태에서 배양된 벌레는 감소된 수준의 청색을 나타냈습니다.플로리다형광. 실제로, 형광 현미경 검사 결과 13-1일 된 벌레가 3-1일된 젊은 성인보다 더 많은 청색광을 방출하는 것으로 나타났습니다. 항-CML 또는 항-펜토시딘 항체를 사용한 면역염색은 파란색과 유사한 분포 패턴으로 광범위하게 퍼지는 AGE의 존재를 보여주지 못했습니다.플로리다형광. 그만큼플로리다형광은 다른 풍부한플로리다vespertine A, LM-1 및 argpyrimidine과 같은 형광 AGE33,34.


난포낭에 난황을 제공하기 위해,C. 엘레강스자웅동체는 자신의 장내 바이오매스를 소비하여 나중에 장 위축과 이소성 난황 침착을 초래합니다. 비텔로게닌(노른자 단백질)은 이전에 보고된 바와 같이 늙은 벌레(젊은 동물에 비해)에서 2배 더 높은 수준으로 존재했습니다.35, 그리고 6 배 더 큰 전시플로리다시험관 내 당화 후 형광. 이 데이터는 vitellogenins 자체가 12-배 증가플로리다이론적으로 젊은 성인에 비해 오래된 벌레의 형광. 웨스턴 블로팅은 항-CML 항체와 반응하는 주요 밴드가 난황 단백질임을 보여주었다. 이 발견은 vitellogenin의 무거운 당화를 발견한 Nakamura et al.의 이전 보고서와 일치합니다.36, Golegaonkar 등은 리팜피신 처리 선충에서 vitellogenin-2, vitellogenin-6 및 신장 인자 1 알파의 당화 감소를 감지했습니다.30. 알려진 바에 따르면, 비텔로게닌은 항산화제 역할을 하며 꿀벌 여왕벌의 장수에 기여합니다.37. ~ 안에C. 엘레강스, 비텔로게닌은 스트레스 저항성에 중요한 역할을 합니다 38. 산화방지제는 그 자체로 쉽게 산화될 수 있기 때문에 당화 비텔로게닌의 축적은 산화적 손상으로부터의 보호를 손상시켜 기대 수명과 파란색의 강도 사이에 반비례 관계를 초래할 수 있습니다플로리다본 연구에서 관찰된 형광. 그러나 Sornda et al. 수명은 YP115/YP88(vitellogenin-6)에 의해 매개되는 산화 스트레스 저항성과 관련이 없다고 최근 보고되었습니다.39. 그 연구원들은 vitellogenins 1에서 파생된 vitellogenin YP170의 축적을 제안했습니다.–5, 장 위축 및 수명 감소를 유발하는 반면, YP115/YP88의 축적은 장 위축을 지연시키고 수명을 연장할 수 있습니다. 따라서 vitellogenin-6의 당화 및 그에 따른 기능 장애는 노화에 기여할 수 있습니다. 신장 요인이 있지만플로리다시험관 내 당화 후 3배 더 강력하게 감소한 이 단백질의 양은 어린 벌레와 늙은 벌레 사이에서 비슷했습니다. 따라서 향상된 자가형광에 대한 이 인자의 기여도는 비텔로제닌에 기인하는 것보다 작을 수 있습니다.

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시탕슈하기 위한 모델로 일반적으로 사용되어 왔다.공부하다노화 및 노화 방지 개입. 우리는 장수 효과를 조사하기 위한 모델로 웜의 사용을 제안했습니다.유산균의8. (현재 연구에서) 파란색플로리다선충의 형광은 AGEs 축적의 가능한 지표입니다.시탕슈 hermaphrodites는 AGEs 생산 억제를 통해 작용하는 노화 방지 개입의 유용성을 조사하기 위한 모델 역할을 할 수 있습니다. 대조적으로, 자가형광은 vitellogenin이 부족해야 하기 때문에 수컷 벌레에 대한 노화의 바이오마커가 될 것 같지 않습니다.

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그림 5 kynu-1 돌연변이의 청색 형광, 이는 사멸 형광을 방출하지 않아야 합니다. ㅏ7-day-old 및 13-day-old의 형광 강도(ex 340/em 430)키누-1돌연변이(n = 각 37개); 오래된 웜은 여전히 ​​더 많이 방출합니다.플로리다그럼에도 불구하고 젊은 벌레보다 형광키누-1돌연변이. 그러나, 기호 없음피피Mann에 의한 자가형광 값에서 캔트 차이가 감지되었습니다.–휘트니U 시험.b 7-더 푸른색을 방출하는 리보스로 유지된 하루 된 벌레플로리다그럼에도 불구하고 형광종류-1돌연변이. 파란색플로리다의 형광C. 엘레강스리보오스로 성장(n = 24) 또는 소르비톨(n = 18) 당이 없는 대조군 벌레(n = 20). autofluorescence 값은 nonparametric Steel을 사용하여 비교되었습니다.–드와스 방법(**p < 0.01). c 생존 곡선C. 엘레강스리보오스로 성장(n = 62) 또는 소르비톨(n = 84) 당이 없는 대조군 벌레(n = 64). 웜은 0일에 3일이었습니다. 선충 생존율은 Kaplan에 의해 계산되었습니다.–Meier 방법 및 생존 차이는 로그 순위 테스트(**p < 0.01).


행동 양식

선충류시탕슈 Bristol 균주 N2 및 그 파생 돌연변이 균주는 미네소타 대학의 Caenorhabditis Genetics Center에서 친절하게 제공되었습니다. 이 연구에 사용된 돌연변이는 CB1370이었습니다.다프-2 (e1370)및 CB1003키누-1 (e1003). 선충은 표준 기술 40에 따라 NGM에서 유지되고 번식되었습니다. 앞서 설명한 바와 같이 차아염소산나트륨/수산화나트륨 용액에 노출된 후 성충에서 벌레 알을 회수했습니다. L1-단계 벌레의 156 ×g 1분 동안 상청액을 제거하고 남은 유충을 펩톤이 함유되지 않은 mNGM(modified NGM) 플레이트로 옮겼습니다.대장균균주 OP50(OP50). 균주는 mNGM 한천 플레이트에서 25도에서 성장했습니다.다프-2L4 단계까지 20도에서 성장한 균주. 모든 분석은 25도에서 알을 낳기 시작한 어린 성충으로 시작되었습니다. 선충에 대한 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다.박테리아 균주OP50는 선충의 국제적으로 확립된 먹이로 사용되었습니다. Tryptone soya agar (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan)를 사용하여 OP50을 배양하였다. 박테리아(습윤 중량 100mg)를 0.5mL의 M9 완충액에 현탁시켰다; 달리 명시되지 않는 한 박테리아 현탁액의 50-µL 부분 표본을 직경 5.5-cm 플레이트의 mNGM에 뿌렸습니다.


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자가형광의 다변량 분석

각각 100명의 성인 인구가 3일령과 17일령에 회복되었고,3회 세척 후 M9 완충액 3 µL에 농축 후 냉동보관~에–사용할 때까지 80도. 추출하기 전에 3 µL의 용해 완충액(50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5), 150mM NaCl, 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 1% 트리톤 X-100, 1mM 페닐메틸술포닐플로리다불화물(PMSF) 및
2% 2-mercaptoethanol) 및 4µL의 15% SDS를 각 튜브에 분배했습니다. 그런 다음 샘플을파이동결-해동 주기를 반복하여 단백질을 방출합니다. 축광 스펙트럼은플로리다형광분광광도계(Hitachi FL{{0}})와 데이터 해석 소프트웨어(FL Solutions 버전 2.0). 선충 현탁액의 형광 특성은

여기 방출 매트릭스(EEM)를 사용하여 분석플로리다형광 분광법. 다변량 분석(다중 단일 파장 여기파장 방출 및 동기 스캐닝플로리다uorometry) 단일 스캔 여기 및 동기식으로 구성된 EEM 플롯을 산출했습니다.형광각 계열의 스펙트럼을 그렸습니다.



노화 벌레의 형광 스펙트럼

벌레 (3–생후 13일) 2를 포함하는 성장배지에서 회수하였다.'-데옥시-5-플로리다uorouridine (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japan). 이것화합물은 자손의 배아 발달을 차단하여 자손에 의한 오염을 방지합니다. 개별 노화 벌레는튜브, 세척다섯3 µL의 M9 버퍼에 농축하여–사용할 때까지 80도. 추출 전, 100µL의 용해 버퍼(50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5), 150mM NaCl, 10mM 디티오트레이톨(DTT), 1mM PMSF 및 1μL 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma, St. Louis, MO, USA)로 구성됨) 각 튜브. 그런 다음 샘플을 Mini Cordless Grinder(Funakoshi, Tokyo, Japan)를 사용하여 분쇄하여 출시했습니다.
단백질. Pierce를 이용하여 단백질 함량을 정량적으로 측정하였다.™ 660nm 단백질 분석 시약(Thermo Fisher Scientific Meridian,Waltham, MA, USA) 및 NanoDrop OneC 장비(Thermo Fisher Scientific). 그만큼형광스펙트럼은 각 30-µL 샘플(1.5μ총 단백질의 g) 다중 모드 격자 사용

SF6 데이터 처리 소프트웨어가 있는 마이크로플레이트 리더 모델 SH-9000Lab(Corona Electric, 이바라키, 일본). 각 측정은 세 번 수행되었습니다.


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개별 살아있는 벌레의 자가형광 측정(wrap-drop 방법)

무작위로 선택된 벌레를 M9 버퍼로 세척한 다음개별 웜을 Saran Wrap cling의 M9 버퍼 1.0 µL에 넣었습니다.파이lm(Asahi Kasei, Tokyo, Japan)은 384-웰 블랙 플레이트 위에 펼쳐져 있습니다.(STEM, 도쿄, 일본). a를 사용하여 각 웰에 작은 중공을 형성했습니다.복제기(Watson, Kobe, Japan). 이 수정은 각 벌레의 연령에 따른 자가형광의 변화를 추적할 수 있도록 측정 후 벌레를 안전하게 회수하는 것이었습니다. 집착파이시중에서 판매되는 다른 것보다 자동 형광이 적기 때문에 lm을 선택했습니다.파이작품

그러나 블랭크(M9 버퍼만) 데이터는 세 번 확인했습니다.각 웰을 고려하여파동우물에서 우물로. 최소검출한계 및 정량화 가능한 한도는 각 일자별 블랭크 데이터를 기준으로 다음과 같이 결정하였다.μ (공백의 의미)...을 더한3.29σ (표준 편차) 및μ...을 더한√2 × 10σ, 각각. 각 벌레의 몸에서 자가형광

다중 모드 격자 마이크로플레이트 판독기로 캡처되었습니다. 후에측정, 각 웜은 4.0-cm에서 개별적으로 유지되었습니다.OP50(2 mg/10μL M9 버퍼) 25도. 각분석은 최소 20마리의 웜에서 수행되었으며 두 번 반복되었습니다.


수명 측정

지렁이는 OP50으로 덮인 mNGM 플레이트에서 13일까지 25도에서 유지되었습니다. 에 의해 평가 후형광검정, 각 30 벌레는OP50으로 덮인 별도의 새로운 mNGM 플레이트로 옮겼습니다. 플레이트를 25도에서 배양하고 살아있는 벌레와 죽은 벌레를 24시간마다 채점했습니다. 웜 피커로 부드러운 터치에 반응하지 않으면 웜이 죽은 것으로 간주됩니다.

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체외 당화 후의 AGE

단백질 추출은 이전에 설명한대로 수행되었습니다. 3일 된 벌레를 인공 당화에 사용했습니다. 단백질 샘플(2mg/mL)500mM 포도당, 100mM 리보스 또는 500mM 과당과 함께 배양되었습니다.(파이최종 농도). 모든 샘플은 0 동안 37도에서 배양되었습니다.–4 주. 분취량(50μL) 폴리스티렌 플레이트의 웰에 분배하였다.
(Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan)에 넣고 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 후에샘플 용액을 제거하고 플레이트를 PBS-T로 세척하였다.(인산완충식염수(PBS), 0.05% Tween 20); 250μ3% 탈지유 L각 웰에 첨가하고 플레이트를 37도에서 2시간 동안 배양하였다. 각그런 다음 PBS-T로 세척하고 100μ안티 AGE(anti-CML)의 L
단클론 항체(Clone No. 6D12, Trans Genic, Fukuoka, Japan; 75 ng/mL)을 각 웰에 분주하고; 그런 다음 플레이트를 실내에서 배양했습니다.1시간 동안 온도. PBS-T로 세척 후, 100μ과산화효소 결합의 L염소 항-마우스 IgG 항체(Rockland Immunochemicals, Inc., Limerick, PA, USA; 1:150,000)를 각 웰에 분주하고,
플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T로 세척 후, 100μ작동 용액의 L(테트라메틸벤지딘(TMB) 염색 용액: 과산화물 용액= 1:1; ELISA POD 기판 TMB 키트, 대중적,Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)을 각 웰에 분주하고, 플레이트를 암소에서 실온에서

100의 추가μ웰당 1 mol/L 황산의 L. 각각의 흡광도450nm(서브: 650nm)에서 웰을 마이크로플레이트 판독기로 즉시 측정했습니다. ELISA는 각 테스트 조건에 대해 세 번 수행되었습니다.


노화 벌레에 대한 Western blotting

샘플은 4X 볼트로 처리되었습니다.™ LDS 샘플 버퍼(Thermo Fisher Scienti피피c) 및 10× 볼트™ 샘플 환원제(Thermo Fisher Scienti피피c) 1.5를 포함하는 각 샘플μg의 총 단백질을 Bolt에서 실행했습니다.™ 4–12% Bis-Tris Plus 젤(Thermo Fisher Scienti피피씨). 그런 다음 단백질을 젤에서 폴리비닐리덴으로 옮겼습니다.플로리다uoride 멤브레인(ATTO, Tokyo, Japan) 및 PBS- 0.1% Tween 20에서 5% 탈지유로 1시간 동안 차단했습니다. 막을 항-AGE(항-CML) 단클론 항체(Clone No. 6D12 at 1:1000)와 함께 4도에서 밤새 배양하고 PBS-T로 세척한 다음 실온에서 1시간 동안 배양하였다. h와 퍼옥시다제 결합 염소 항-마우스 IgG 항체(1:25,000). PBS-T로 세척한 후 멤브레인을 ECL 프라임 웨스턴 블로팅 검출 시약(GE Healthcare UK, Little Chalfont, England)과 함께 배양하고 ChemiDoc Touch Imaging System(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 또는 ImageQuant를 사용하여 스캔했습니다. LAS 500(GE 헬스케어 UK). 그런 다음 멤브레인을 PBS-T로 세척하고 Western BLoT Stripping Buffer(Takara, Shiga, Japan)와 함께 실온에서 30분 동안 배양한 후 PBS-T로 다시 세척했습니다. 밤새 4도에서 항-비텔로게닌 항체 YP115 및 YP170(각각 1:10,000)에 의해 멤브레인을 재프로빙했습니다.42, PBS-T로 세척하고 퍼옥시다아제(1:2000)(Proteintech, Rosemont, IL, USA)와 접합된 염소 항-랫트 IgG 항체와 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 로딩 제어를 위해 항-액틴 항체(Clone No. C4; Merck KGaA, Darmstadt, Germany) 및 퍼옥시다제-접합된 항-마우스 항체(GE Healthcare UK)를 사용하여 막을 재탐침하였다. 각 레인의 비텔로게닌(YP170 및 YP115) 및 CML 밴드의 밀도를 각 레인의 액틴 밴드 밀도에 대해 정규화했습니다. ImageQuant TL 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 밴드 밀도를 분석했습니다. 각 분석은 두 번 수행되었습니다.


생체 내 AGEs에 대한 리보스 및 리팜피신의 효과

3일 된 벌레를 400mM 리보스를 포함하는 mNGM에서 배양했습니다.또는 400mM 소르비톨은 고 리보스의 삼투압과 일치합니다. 벌레 먹이는 열(100도, 10분)로 죽인 OP50으로 제공하여 박테리아가 설탕을 발효시키는 것을 방지했습니다. 자손에 의한 오염을 방지하기 위해, 지렁이가 완전히 오염될 때까지 4일 동안 매일 신선한 판으로 옮겼습니다.

완성된산란(생후 7일). 리보스의 영향을 평가하기 위해 생존 분석을 수행하고 자가형광을 측정했습니다. 벌레는웜 피커로 부드러운 터치에 반응하지 않으면 죽은 것으로 간주됩니다. 판의 벽에 달라붙어 죽은 벌레는 분석에 포함하지 않고 검열하였다. 별도의 실험에서,50μM을 포함하는 MGM(결정적인농도) 리팜피신(용해DMSO)를 사용하였다. 각 분석은 두 번 반복되었습니다.


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그림 6. 비텔로게닌(Vit)과 신장 인자(EF)의 자가형광. ㅏ분광광도법(ex 325/em 350–600) 비텔로게닌 및14일 동안 리보스에 의한 시험관 내 당화 전후 신장 인자: gly-Vit 및 gly-EF는 당화된 비텔로게닌 및 당화 신장요인, 각각. 리보플러avin(Rib)이 대표로 표시됩니다.증권 시세 표시기형광 화합물. 비교를 위해 17-일된 벌레(야생형 N2)의 추출물이 표시됩니다(C. 엘레강스). b vitellogenin의 in vitro 당화와 ribose에 의한 elongation factor는 autofluorescence의 증가를 가져 왔습니다.
시간이 지남에 따라.c 다양한 연령대의 벌레(야생형 N2) 개체군에서 추출한 샘플에서 AGE 및 비텔로게닌의 웨스턴 블롯팅 분석. 블롯은 동일한 젤에서 파생되었으며 순서대로 각 항체로 처리되었습니다.d 정량화서양의 비텔로게닌과 AGE농도계를 이용한 블로팅. 실험은 두 번 반복되었으며, 대표적인 실험의 데이터가 표시됩니다. 빨간색 선과 점선은 모두 AGEs의 접힘 변화를 나타내고 검은색 선은 난황소의 양을 나타냅니다. 닫힌 원과 십자 표시는 각각 YP170과 YP115에 일치하는 밴드 데이터용입니다.


오래된 웜 특정 단백질의 식별

3- 및 17-일된 선충의 추출물에 대한 질량 분석Protein Pilot 버전 4.0을 사용하여 AB SCIEX 5800 LC-MALDI-TOF 질량 분석기(Newark, NJ, USA)에서 수행되었습니다. 두 행렬 모두트립신에 의해 소화되고 매트릭스 용액(7 mg/L의 - 시아노-4-하이드록시신남산 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA), 70%
(v/v) 아세토니트릴(ACN)). 그만큼사람분리에 사용된 속도는 300ML/min,2% ACN(용매 A)의 {{0}}.1%(v/v) TFA 및 80%의 0.1%(v/v) TFA의 선형 구배를 사용하여 분리를 달성했습니다. 퍼센트 ACN(용매 B)) 다음 비율로: A/B= 100/0–50/50(60분), A/B= 50/50–0/100(20분), A/B= 0/100(10분). MALDI-TOF 질량 시스템을 사용하여 펩티드 질량을 얻었습니다.지문. 펩타이드 매칭 및단백질 검색은 Swiss-Prot 버전 57.0 데이터베이스에 대해 수행되었습니다.


추출된 단백질을 50 mM ammonium bicarbonate에 녹였다.(AmBic)은 0.1 ~ 1 µg/µL 사이의 단백질 농도를 생성합니다. 단백질의 용해도를 최대화하기 위해 계산된 물의 부피Rapigest (Waters Corporation, Milford, MA, USA)를 첨가하여 수율을 얻었다.파이0.1의 최종 농도–소화 전 샘플의 0.2% Rapigest. 샘플
10분 동안 진탕하면서 40도에서 가열하고; 그때 내용은원심분리하고, 생성된 펠릿을 10mM DTT를 함유하는 AmBic에 현탁시켰다. 샘플을 80도에서 15분 동안 가열하고 실온에서 펠릿화하였다. 50mM에서 200mM 요오도아세트아미드(IAM)의 분취량AmBic을 각 샘플에 첨가하여결정적인IAM 집중

20mM(2배 몰 과량의 DTT 존재 시); 혼합물은알킬화 반응이 진행되도록 실온에서 30분 동안 암실에서 배양하였다. 50mM AmBic의 트립신을 각 용액과 1:50으로 혼합했습니다(트립신: 단백질 농도). 샘플을 진탕하면서 37도에서 적어도 4시간 또는 하룻밤 동안 소화시켰다. 수행원원심분리, TFA 및 ACN을 첨가하여 산출결정적인0.5의 농도–1.0% TFA 및 2% ACN. 샘플을 60도에서 2시간 동안 흔들었다. 22,200 ×에서 원심분리 후g 5분 동안, 상등액은오토샘플러 바이알에 피펫팅합니다. 단백질은 미리 트립신으로 분해ESI-Q-TOF 시스템(Impact II Bruker Daltonics)에 결합된 Ultimate3000RSnanoLC 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 역상 액체 크로마토그래피로 분석합니다. 효모 알코올 탈수소효소(ADH1_YEAST) 단백질은 내부 표준으로 샘플에 첨가되었습니다.스파이킹을 수행하여 약 50fmol의 양을 제공했습니다.열에 표준.


체외 당화 후 자가형광

PBS 용액({0}}.053 μM)의 비텔로게닌은 Biosense Laboratories AS(Bergen, NORWAY)에서 구입했습니다. 연신율 용액(1.17μM)은 Abnova Corporation(대만 타이페이시)에서 구입했습니다. 이들 용액을 37도에서 23일 동안 0.1mM 리보오스로 당화시켰다. 리보플러avin은 Sigma(Tokyo, Japan)에서 구입하여 0.1mM에서 PBS에 용해했습니다. 각 용액은 동일한 조건에서 형광 분광광도계로 측정하였다.

면역형광어린 벌레와 늙은 벌레에 의해연령 동기화된 CB1003에 OP50을 먹인 후 25도에서 배양했습니다. 생후 3일 및 13-일된 성인은 Bouin을 사용하여 투과성화되었습니다.'s 튜브 고정 프로토콜43.


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그림 7 3-일 및 13-일 kynu-1 돌연변이의 형광 이미지. a–c3일 된 벌레와d–f 13-열 1에 원본 이미지가 있는 하루 된 벌레. 죽음의 영향을 배제하기 위해플로리다벌레가 생기기 2일 전부터 시작되는 형광' 죽음, 돌연변이키누-1사용되었습니다. 자가형광은 2열과 3열의 이미지에서 볼 수 있습니다. 3열의 사진은 2열 이미지의 표시된 영역(직사각형)에서 확대되었습니다. 오래된 벌레(13-일) 자동형광시그니피피어린 벌레(3-일령)보다 훨씬 높습니다. 각 눈금 막대는 50을 나타냅니다.μm. g 정량화파란색의형광ImageJ 및 ImageQuant TL 소프트웨어 사용. 각 막대는 평균값을 나타냅니다.플로리다1mm당 형광 강도2 아홉 벌레. **는 통계적으로 유의미함을 나타냅니다.피피3-일 된 웜과 13-일 된 웜 사이에 차이가 없습니다.p 값 < 0.01. 오차 막대는 SE를 나타냅니다.

샘플은결정된부인에서's 정착액메탄올/ -메르캅토에탄올실온에서 30분 동안. 큐티클을 깨기 위해 벌레를 넣었습니다.이소프로판올에 저장–80도에서 10분, 실온에서 30분 더 배양합니다. 그만큼정착액용액을 제거하고BTB 용액(25mM 붕산염 완충액, 0.5% Triton X-100, 2%
-머캅토에탄올) 실온에서 1시간 동안; BTB에서의 인큐베이션은총 3회 반복. 그런 다음 벌레를 BTB에서 BT(25mM 붕산염 완충액, 0.5% Triton X-100)로 ​​옮기고 항체 완충액(1× PBS, 0.5% Triton X-100, 0.1mM EDTA, {{10}}.1% 소 혈청 알부민(BSA), 0.05% 아지드화나트륨, pH 7.2) 실온에서

1시간, 10% 염소 혈청을 함유한 항체 완충액으로 차단(Cosmo Bio, Tokyo, Japan) 밤새 4도에서. 1차 항체는 마우스 단클론 항-AGE(항-CML) 항체(Clone No. 6D12; 1:125) 및 항-펜토시딘 항체(Clone No. PEN-12, Trans Genic; 1:5)로 구성되었습니다. 0). 2차 항체는 Alexa Fluor 555- 접합 염소 항-마우스 항체(Abcam, Cambridge, England, 1:100)로 구성되었습니다. 모든 항체 희석은 0.5% BSA를 포함하는 항체 버퍼를 사용하여 수행되었습니다. VECTASHIELD 안티페이드 장착 매체(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 샘플을 유리 슬라이드에 장착했습니다.



형광 현미경

위에서 설명한 대로 유리 슬라이드에 장착된 3- 또는 13-일 된 성충의 형광 이미지는 거꾸로 된플로리다형광10× 대물렌즈(CFI Plan Fluor DL)가 장착된 현미경(BZ-X700; Keyence)10×/0.30). 자동플러붉은 벌레의 형광형광알렉사에서Fluor 555는 BZ-X DAPI(여기 파장(Ex), 360 ±20 nm; 방출 파장(Em), 460 ± 25 nm) 및 TRITC(Ex, 545 ±12.5nm; 전각, 605 ± 35nm)필터, 각각. 단면 이미지는1차원 슬릿 유형으로 절편 모드로 캡처한너비 32, Z 스택 피치 0.7μ40-에 대해 mμm 두께의 샘플. 파란색을 정량화하려면형광,형광이미지로 측정한 강도
Quant TL 소프트웨어(GE Healthcare)는 1mm당 밀도 값으로 정규화되었습니다.2 벌레의's 프로젝션 영역. 신체 크기는 National Institutes of Health에서 개발한 Adobe Photoshop Elements 및 ImageJ 소프트웨어로 결정되었습니다. 이 시스템에서 웜의 영역's 투영자동으로 추정되어 신체 크기의 지표로 사용되었습니다.



통계 분석

Spearman을 사용하여 기대 수명의 상관 관계를 계산했습니다.'s 순위 상관 계수. 시험관 내 당화 후 자가형광 수준을 2-인자 요인 ANOVA 및 Scheffe를 사용하여 비교했습니다.'s F 시험. 그만큼시험관 내 당화 후 ELISA 값은 다중 비교를 위한 단일 요인 ANOVA 및 Dunnett 테스트를 사용하여 비교되었습니다. 선충 생존Kaplan에 의해 계산되었습니다.–Meier 방법 및 생존 차이는 로그 순위 테스트를 사용하여 유의성을 테스트했습니다. 리팜피신 처리 및 노화에 따른 자가형광 값다프-2그리고키누-1돌연변이는 Student를 사용하여 각각에 대해 비교되었습니다.'s t 테스트, 반복 측정 2인자 ANOVA 및 Mann–휘트니U 시험. N2에 대한 리보스 처리 후 자가형광 값 또는키누-1nonparametric Steel을 사용하여 돌연변이를 비교했습니다.–드와스 방법. autofluorescence microscopy의 밀도는 Student를 사용하여 비교되었습니다.'s t-테스트. 유의성이 관찰된 경우 데이터는 분류되었습니다.피피에드 *p < 0.05 and **p < 0.01. All 통계 분석은애드인 소프트웨어...을 더한Statcel 3(OMS, 도쿄, 일본) 및 Windows용 JSTAT(일본 도쿄 난코도).


보고 요약

연구 설계에 대한 자세한 내용은 Nature Research에서 확인할 수 있습니다.이 문서에 연결된 보고 요약입니다.


데이터 가용성

현재 연구 중에 생성된 데이터 세트는 해당합당한 요청이 있는 경우 작성자에게 요청합니다.



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