Caenorhabditis Elegans의 노화 및 고급 당화 최종 산물의 비침습적 바이오마커로서의 자가형광
Apr 11, 2023
Caenorhabditis elegans에서 노화의 비침습성 바이오마커로서 자가형광의 유용성을 평가하기 위해 분광형광법을 사용하여 개별 선충의 자가형광을 측정했습니다. 각 벌레의 형광은 나이가 들면서 증가했습니다. 형광 강도가 낮은 동물은 기대 수명이 더 길었습니다. 벌레에서 추출한 단백질을 당과 함께 배양하면 시간이 지남에 따라 형광 강도와 최종 당화 생성물(AGEs)의 농도가 증가했습니다. Ribose는 시험관 내뿐만 아니라 생체 내에서도 이러한 변화를 강화했습니다. 당화 차단제인 리팜피신은 이러한 형광의 상승을 억제했습니다. 고해상도 질량 분석법은 오래된 벌레에 축적된 비텔로게닌과 당화 비텔로게닌이 순진한 비텔로게닌보다 6배 더 높은 형광을 방출한다는 것을 밝혔습니다.노화에 따른 형광 증가는 당화 물질에서 비롯됩니다.따라서 AGE의 유용한 비침습적 바이오마커 역할을 할 수 있습니다.시탕슈Anti-AGE 요인을 찾는 새로운 모델이 될 수 있습니다.AGE와 노화 사이의 관계를 연구합니다.
소개
인간의 평균 수명은 지난 반세기 동안 선진국에서 극적으로 연장되었습니다. 하지만,노화에 따른 진행성 손상은 생리적 기능에 해로운 영향을 미칩니다., 로 알려진노화, 그리고노화 관련 질병에서도 증가하고 있다장수의 비율. 확장"건강수명" 이제는 혼자 수명을 연장하는 것보다 필요합니다. 노화를 늦추고 건강 기간을 연장하는 개입이 필요합니다. Brenneret al. 도입예쁜꼬마선충, 박테리아를 먹고 사는 작은 자유 생활 토양 선충입니다.분화와 발달에 관한 분자유전학 연구.
그 후 이 벌레는 이 동물 때문에 노화 연구를 포함한 생물학적 연구를 위한 실험 시스템으로 광범위하게 사용되었습니다.'단순성, 투명성, 재배 용이성, 짧은 수명, 유전자 분석 적합성2. 벌레에서 노화는 운동 능력, 스트레스 저항, 인지 능력 및 인두 펌핑의 감쇠와 소위 나이 색소인 리포푸신의 축적으로 검사할 수 있습니다.3–5 .
항산화제 및 여러 약물을 포함한 다양한 화학 물질이 노화를 방지할 수 있는 후보 물질입니다.6,7. 또한 선충의 건강수명과 수명이 프로바이오틱스 박테리아를 먹음으로써 연장될 수 있다는 보고가 있었기 때문에8,9, 유익한 박테리아의 장수 효과는 여러 실험실에서 입증되었습니다.10–12. 장수효과는 생존곡선으로 살펴보았으나, 벌레를 대상으로 한 연구는 상대적으로 짧은 수명에도 불구하고 3주 이상의 시간이 소요된다.C. 엘레강스. 노화에 대한 개입의 효과를 평가하기 위해 편리하고 비침습적인 노화 지표가 개별 벌레와 (궁극적으로) 인간에서 최종 표적으로 미치는 영향을 추적하는 것이 바람직합니다.
소위 노화 색소인 리포푸신은 노화의 지표로 광범위하게 사용되어 왔습니다. 그러나 자가형광, 노화, 벌레의 수명 사이의 정확한 관계는 아직 명확하지 않습니다. Gerstbreinet al. 연령 색소가 선충 건강 수명의 유효한 보고자라고 보고했습니다.13, Coburn et al. 청색 형광(340/430 nm에 집중된 여기/방출 파장)이 사망 전후 몇 시간 동안 사망 마커 역할을 한다고 보고했습니다.C. 엘레강스14. 시간이 지남에 따라 노화 인구에서 관찰되는 청색 자가형광의 증가가 제안되었습니다.C. 엘레강스인구 자체의 고령화율이나 건강 상태가 아니라 샘플에서 사망했거나 거의 사망한 개인의 비율을 반영할 수 있습니다.15.
Advanced glycation end products (AGEs)는 과학적 관심을 끌었습니다.16 당뇨병의 경우뿐만 아니라 생리적 노화 중에도 많이 형성되어 산화 스트레스를 유발하기 때문입니다. AGE는 단백질, 지질 또는 핵산의 환원당과 아미노기 사이의 비효소적 반응에 의해 형성된 복합 화합물입니다. 그런 다음 마이야르 반응을 통해 쉬프 염기와 아마도리 제품이 형성되어 AGE가 생성됩니다. 당뇨병, 류마티스 관절염, 알츠하이머 환자에서 AGE 함량이 높습니다.'s 질병 및 기타 질병17–19. 당뇨병 환자에서 AGE 축적은 미세혈관 질환의 중증도와 밀접한 관련이 있으며 나이가 들면서 증가합니다. 그러나 AGE가 병인의 원인인지 아니면 2차 산물인지는 아직 밝혀지지 않았습니다. AGE는 또한 노화의 가능한 원인으로 간주됩니다.20,21, 연구 결과에서 제안한 바와 같이C. 엘레강스설탕 독성 모델22,23.
여러 AGE 화합물에 대한 특이성을 가진 항체를 사용하여 체계적인 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법이 개발되었습니다.24–26. 그러나 AGE 수준을 대략적으로 추정할 수 있는 비침습적 방법도 필요합니다. 여러 AGE가 보고되었기 때문에플로리다형광등 및 관련플로리다형광 강도는 신호를 나타냅니다.피피ELISA에 의해 측정된 수준과 캔트 상관관계27, 우리는 이것이플로리다형광은 AGEs의 상태와 노화를 추적하기 위한 대체 마커로 사용될 수 있습니다.C. 엘레강스모델.
관찰 여부를 확인하기 위해형광죽음을 반영할 뿐형광Coburn 등이 보고한 바에 따르면, 벌레는플로리다개별 벌레의 형광각 동물의 죽음을 타이밍. 또한,AGE 형성 억제제의 효과형광및 AGE 축적은 또한 의 유용성을 검증하기 위해 조사되었습니다.C. 엘레강스AGE 연구를 위한 모델 동물로.
결과
벌레의 노화 및 AGE의 바이오마커로서 추출된 단백질의 자가형광
추출된 단백질의 형광 분광광도계는 325°에서 여기가–365nm는 17-일 된 웜을 만들었습니다.플로리다400에서 가장 높은 배출량을 가진 uoresce–430 nm(피크 420 nm) 간격(Fig.1ㅏ). 더 블루플로리다형광은 젊은 성인기(3-day-day-5-day-day) 동안 비교적 낮았지만 시간이 지남에 따라 증가했습니다(7-day-day 동물에서)(그림.1비). 소위 노화 색소인 리포푸신은 붉은색을 띤다.플로리다형광 (530에서 여기–560nm, 585에서 방출–645nm)15; 이전 연구에서 이 마커는 노년기(13-일 이상) 웜에서 발견되었습니다.9.
자동 이후플로리다본 연구에서 발견된 형광은 조기에 나타나 시간이 지남에 따라 증가하는 청색 자동플로리다형광은 노화를 추적하기 위한 더 나은 바이오마커가 될 것으로 기대되었습니다. 여러 AGE 화합물이 자동 형광27인 것으로 알려져 있기 때문에 AGE 함량과 파란색 사이의 관계를 조사했습니다.플로리다N에 대한 항체가 있는 웨스턴 블롯팅에 의한 형광ε- 대표적인 AGE인 (카르복시메틸)라이신(CML)을 사용하였다. 블로팅은 현저한 밴드가 시간이 지남에 따라 증폭됨을 보여주었다(도 1).1c 및 보충 그림 1). 실제로, 영역의 정량화는 증가된 AGE를 나타내었다(도 1b).1d) CML이 자동은 아니지만플로리다형광등.
자동인지 확인하려면플로리다형광은 간접적으로Maillard 반응에 의해 형성되는 AGEs의 증가, 단백질벌레 균질액에서 추출한 균질을 포도당, 리보스 및 과당과 같은 환원당과 함께 최대 4주 동안 무균 배양했습니다. 그만큼플로리다단백질의 형광은 설탕이 있는 상태에서 시간이 지남에 따라 증가했지만, 단백질의 현저한 증가는 없었습니다.플로리다당 없이 수행된 반응에서의 형광(그림.2ㅏ). 벌레 단백질은플로리다시험관 내에서도 당화를 통해 형광을 발합니다. 세 가지 당 각각에 대해 수행된 반응 중에서 리보오스를 사용한 반응이 가장 많이 생성되었습니다.플로리다형광, 그 다음 두 개의 다른 당. 이것파이Schiff 염기 결합을 형성하기 위한 아미노 그룹과 각 단당류의 반응성은 고리가 아닌 열린(카르보닐) 구조에 존재하는 정도에 따라 달라진다는 Bunn과 Higgins의 보고서로 설명할 수 있습니다. hemiacetal 또는 hemiketal) 구조로 되어 있으며, 리보스(10.0), 과당(4.5), 포도당(0.6) 순으로 반응성 증가율이 증가하였다(×10−3 mm−1 h−1 ) 각각28.
그림 1 벌레 단백질 샘플의 형광 분광광도계 및 AGEs. 한3-일 및 17-일에 용해된 벌레의 자가형광의 여기 방출 매트릭스(EEM) 도표. 그만큼플로리다EEM 플롯에서 방출 파장의 형광 레벨은 컬러 히트맵으로 표시됩니다. 각각 3-일 및 17-일 된 100마리의 벌레(야생형 N2)를 3µL의 용해 완충액과 4µL의 15% SDS에서 용해했습니다. 단백질은 동결-해동 주기에 의해 방출되었고 광발광 스펙트럼은플로리다형광 분광광도계(Hitachi FL-4500). 용해된 선충의 형광 특성을 EEM을 사용하여 분석했습니다.플로리다형광 분광법. 325에서 여기–365nm는 17-일 된 웜을 만들었습니다.플로리다400에서 가장 높은 배출량을 가진 uoresce–일련의 430 nm 간격 해당 궤적플로리다형광 강도, 반면 3-일된 어린 벌레는 그렇지 않았습니다.플로리다uoresce. 다변량 분석(다중 파장 방출을 통한 단일 파장 여기 및 동기 주사플로리다형광측정법)은 단일 스캔 여기로 구성된 EEM 플롯을 산출했습니다.b 자동 수준플로리다형광(ex 340/em 360–600) 연령별 동물에서 추출한 벌레 단백질 샘플(3–13일). 벌레(야생형 N2)를 튜브에 수집하고 세척다섯시간, 그리고 각 튜브에서 lysed. 그런 다음 Mini Cordless Grinder (Funakoshi, Tokyo, Japan)를 사용하여 샘플을 분쇄하여 단백질을 방출했습니다. 방법에 기재된 바와 같이 단백질 함량을 정량적으로 측정하였다. ㅏ플로리다형광 스펙트럼은 각 30-µL 샘플(1.5μ총 단백질의 g) 다중 모드 격자 마이크로플레이트 판독기 모델 SH-9000Lab(Corona Electric, Ibaraki, Japan) 사용. 각 측정은 세 번 수행되었습니다.c 연령대가 다른 벌레(야생형 N2) 집단에서 추출한 샘플에서 AGE CML의 웨스턴 블롯팅 분석. 세 가지 재현 가능한 실험의 대표 사진이 표시됩니다. 블롯은 동일한 젤의 다른 부분에서 파생되었으며(보조 그림 1에 표시됨) 병렬로 처리되었습니다.d 정량화농도계를 사용하여 웨스턴 블롯에서 AGEs. 그림에서 직사각형 프레임으로 둘러싸인 밴드.1c는 정량화되었고, 세 가지 재현 가능한 실험의 데이터는 평균 ± SE로 표시됩니다.
각기.
의 증가 여부를 직접 평가하기 위해플로리다당의 존재 하에서의 형광은 AGE 형성으로 인한 것이었고, 대표적인 AGE 화합물 CML을 검출하기 위해 ELISA를 사용하였다. CML은 이러한 반응에서 증가했으며, 리보오스와 함께 배양된 샘플의 수준은 4주 동안 설탕 없이 배양된 대조군의 수준보다 거의 7배 더 높았습니다(그림 2).2비). 리보스에 비해 포도당 또는 과당으로 생성된 CML의 양은 대조군의 CML과 유사하게 적었습니다. 이것발견이전 보고서와 일치합니다.29.
생체 내 노화 및 AGE의 바이오마커로서의 자가형광
다음으로플로리다형광은 추출된 단백질뿐만 아니라 살아있는 벌레에서도 검출될 수 있었습니다. 다중 모드 격자 마이크로플레이트 리더를 사용하여 384-웰 플레이트에 펼쳐진 플라스틱 랩 필름에서 개별 벌레의 자가형광을 판독했을 때, 분광광도계 결과는 추출된 단백질의 결과와 유사했습니다(그림 1).3ㅏ). 파란색의 개별 강도플로리다형광은 시간이 지남에 따라 증가했습니다(그림.3b 및 보충 그림 2), 빨간색은 없지만플로리다이 방법으로 형광을 검출했습니다. 파란색 이후플로리다형광(340/430 또는 350/460 nm)은 이전에 사망과 관련이 있는 것으로 보고되었습니다.14,15, 동물실험 전 2일 이내의 데이터를 제외하여 분석하였다.'죽음. 그러나 파란색플로리다벌레의 형광은 시간이 지남에 따라 여전히 증가했습니다.플로리다따라서 형광은 사망과 부분적으로 독립적이어야 합니다.플로리다형광. 자가형광이 노화의 바이오마커가 될 수 있는지 테스트하기 위해 13-일 된 벌레에서 자가형광을 측정한 후 벌레가 몇 일 동안 생존할 수 있는지 조사했습니다. 각 벌레의 기대 수명은 자가형광의 강도와 반비례 관계에 있었습니다(그림 1).3c).
그만큼플로리다형광 강도는 리보오스로 성장한 벌레에서도 증가했습니다(그림 1).4ㅏ); 이 웜의 수명은 상당했습니다.피피컨트롤 웜보다 훨씬 짧습니다(그림.4비). 대조적으로, AGEs 차단제인 리팜피신을 함유한 배지에서 성장한 벌레는 덜 방출했습니다.플로리다리팜피신 없이 성장한 대조군 벌레와 비교한 형광(도 1b).4씨); 리팜피신의 장수 촉진 효과는 이전에 보고되었습니다.30. 뿐만 아니라,다프-2, 대표적인 pro-longevity 돌연변이는 야생형에 비해 자동 형광이 적었습니다 (그림 1).4d) 동안플로리다야생형의 형광 강도는 노화에 따라 증가했습니다.
의 일부플로리다형광은 동물의 죽음과 관련하여 생성된 화합물에서 파생된 것으로 예상됩니다. 더 블루플로리다형광은 Coburn et al. 에서 관찰C. 엘레강스사망 전후 몇 시간 동안; 청색광은 벌레가 죽은 직후에 형성되는 안트라닐산에서 나옵니다.14. 보도에 따르면 사망플로리다형광은 키누레닌 경로에 의해 생성된 안트라닐산의 글리코실화된 형태에 의해 방출됩니다.14. 규-1따라서 kynureninase가 결여된 돌연변이 벌레는 죽음을 일으키지 않을 것으로 예상되었습니다.플로리다형광. 그러나 이 돌연변이가 있는 경우에도 노화된 벌레는 여전히 더 많이 방출하는 것으로 나타났습니다.형광어린 벌레보다(Fig.5a) 리보오스가 보충된 선충 성장 배지(NGM)에서 자란 벌레는피피엄청나게 높게플로리다보충 리보스 없이 또는 대조 당 소르비톨로 성장한 것보다 형광5비). 리보오스로 유지되는 벌레의 수명은 분명히 다른 벌레보다 짧았습니다(그림 1).5c) 벌레에서 AGE의 노화 촉진 효과를 시사합니다.
자가형광 물질의 식별물질을 식별하기 위해플로리다노화된 동물에서 요구되는 경우, 추출된 단백질에 대해 LC MALDI 분석을 수행했습니다. 각 샘플에서 발견되는 6개의 가장 풍부한 단백질은 표에 나열되어 있습니다.1; 특히, vitellogenin과 elongation factor는 상위-45플로리다오래된 벌레에서 단백질을 분해합니다. 또한 고해상도 MS와 Mascot 계산 환경을 사용하여 3-일된 벌레보다 15-일된 벌레에 더 풍부한 단백질을 검색하고 180개의 단백질을 식별했습니다(보충 표 1–삼). 비텔로게닌이 다시 풍부해졌지만(젊은 성인보다 나이든 벌레에서 6배 더 높은 수준으로 나타남) 신장 요인의 수준은 두 그룹에서 비슷했습니다(보충 그림 3). 이러한 단백질이 당화되어 자가형광 AGE를 형성할 수 있는지 확인하기 위해 정제된 신장 인자와 비텔로게닌을 시험관 내에서 리보오스와 함께 배양했습니다. glycated vitellogenins에서 방출된 형광은 17-일 된 벌레에서 회수된 조 추출물에서 얻은 것과 유사한 스펙트럼을 나타냈습니다(그림 1).6ㅏ). 리보플라빈이 알려져 있지만플로리다결과적으로, 우리는 리보플라빈의 방출 파장이벌레 추출물의 그것. glycated vitellogenin과 elongation factor의 FL 형광은 in vitro에서 23일까지 non-glycated protein의 6배와 3배(각각)였다(Fig.6b).
항-CML 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된 AGEs는 생체 내에서 3-일 된 벌레에서 13-일 된 벌레로 시간이 지남에 따라 증가했습니다(그림 2).1씨). 항-비텔로게닌 항체를 사용한 동시 웨스턴 블롯팅에 의해 우리는 항-CML 신호가 비텔로게닌과 동일한 크기의 밴드임을 발견했습니다(그림 1).6씨). 이 기간 동안 vitellogenins YP170과 YP115가 나이가 들면서 축적되었지만 AGE 신호의 강도는 vitellogenin YP170의 양 증가보다 더 높게 강화되었습니다(그림 1).6디). 형광 현미경으로 13-일된 벌레(그림7d–f, 열 2 및 3) 방출된 신호피피생후 3-젊은 성인보다 훨씬 더 강렬한 청색광(그림7a–c, 열 2 및 3; 무화과.7g); 생식선도 더 밝아 보였습니다(그림.7d–f, 열 1 및 2). CML은 대표적인 AGE이지만 CML 자체는 형광이 아닙니다. 또 다른 AGE인 펜토시딘은 형광성인 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 항-CML 또는 항-펜토시딘 항체를 사용하지 않는 면역염색은 늙은 벌레와 어린 벌레 사이에 현저한 차이를 제공했습니다(데이터는 표시되지 않음). 그러나 Anti-CML은 조직 전체에 확산 확산을 보인 반면 anti-pentosidine은 거의 나타내지 않았습니다.
