박테리아 외부 막 소포는 Arabidopsis의 전사 이동을 면역 체계 활성화로 유도하여 Planta의 병원체 성장을 억제합니다.
Nov 21, 2023
추상적인
그람 음성균은 세포 주변에 구형 수포를 형성하고 나중에 박테리아 세포벽에서 분리되어 세포밖 소포를 형성합니다. OMV(외막 소포)로 알려진 이러한 나노 규모 구조는 감염과 질병을 촉진하는 것으로 나타났으며 포유류와 식물 숙주 모두에서 일반적인 면역 출력을 유도할 수 있습니다. 식물이 OMV에 노출된 후 겪는 광범위한 전사 변화를 더 잘 이해하기 위해 우리는 Arabidopsis thaliana(Arabidopsis) 묘목을 그람 음성 식물 병원성 박테리아 Xanthomonas campestris pv에서 정제된 OMV로 처리했습니다. campestris를 연구하고 챌린지 후 2시간, 6시간, 24시간 후에 OMV와 모의 처리된 식물에 대한 RNA-seq 분석을 수행했습니다. 가장 두드러진 전사 변화는 테스트된 처음 두 시점에서 발생했으며, 이는 차등적으로 발현된 유전자의 수와 평균 배수 변화에 의해 반영됩니다. OMV는 다양한 면역 수용체를 포함한 다수의 면역 관련 경로를 상향 조절하여 면역 체계 활성화를 향한 주요 전사 전환을 유도합니다. OMV 및 정제된 유발인자에 대한 애기장대의 반응을 비교하면 OMV가 단일 유발인자와 유사한 일련의 유전자 및 경로를 유도하는 것으로 나타났습니다. 그러나 다른 유발인자가 아닌 OMV에 의해 활성화된 경로가 감지되었습니다. 애기장대 식물을 OMV로 전처리한 후 박테리아 병원체로 감염시키면 병원균 성장이 크게 감소했습니다. 식물 신장 인자 수용체(EFR), 플라겔린 수용체(FLS2) 또는 브라시노스테로이드에 민감하지 않은 1 관련 키나제(BAK1) 공동 수용체의 돌연변이는 OMV의 면역 프라이밍 효과에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 종합적으로 이러한 결과는 OMV가 애기장대에서 광범위한 전사 이동을 유도하여 다중 면역 경로의 상향 조절을 유도하고 이러한 전사 변화가 박테리아 감염에 대한 저항성을 촉진할 수 있음을 보여줍니다.
키워드
Arabidopsis thaliana, 세균 감염, 세포외 소포, OMV, 외막 소포, 식물 면역, RNA-seq, Xanthomonas campestris pv. 캠프스트리스
남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능
1. 소개
식물은 조직에서 번성하고 정상적인 성장을 방해하는 해로운 미생물에 끊임없이 직면합니다. 효율적인 방어 대응은 침입하는 미생물을 신속하고 정확하게 탐지하고 식별하는 데 크게 좌우됩니다. 이를 위해 식물은 병원균 침입을 모니터링하기 위해 광범위한 감시 시스템을 활용합니다(Cook et al., 2015). 식물 감시 시스템의 첫 번째 라인, 즉 식물과 미생물이 상호작용하는 첫 번째 세포 경계면은 세포간 공간인 아포플라스트(apoplast)인 것으로 추측됩니다. 그곳에서 침입하는 미생물에 대한 인식은 막에 결합되어 세포외에 노출된 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 매개됩니다(Boutrot & Zipfel, 2017; Couto & Zipfel, 2016). PRR은 많은 미생물 사이에 널리 존재하고 보존되며 미생물 또는 병원체 관련 분자 패턴(MAMP)으로 알려진 미생물 결정인자를 인식합니다(Ranf et al., 2016). 미생물은 빠른 속도로 돌연변이를 일으키기 때문에 진화적으로 유용한 면역 수용체는 심각한 체력 비용으로 인해 쉽게 폐기되거나 돌연변이될 수 없는 중요한 미생물 구성 요소의 고도로 보존된 영역을 감지하도록 적응됩니다. 예를 들어, 박테리아 플라젤린은 병원체를 포함한 많은 미생물의 생리학에서 중요한 요소이며 현재 가장 잘 연구된 MAMP 중 하나입니다(Felix et al., 1999; Zipfel et al., 2004). 동족 식물 면역 수용체 플라젤린 감지 2(FLS2)에 의한 플라젤린 또는 합성 에피토프 flg22(편모 빌딩 블록의 N-말단에 고도로 보존된 22개 아미노산으로 구성됨, 플라젤린)의 인식은 주요 전사 변화를 초래합니다. , 감염을 중단시키는 효과적인 면역 반응이 뒤따릅니다(Chinchilla et al., 2007; Gómez-Gómez & Boller, 2000). 알려진 많은 MAMP는 미생물의 세포벽과 연관되어 있습니다. 예를 들어, 곰팡이 키틴(Fesel & Zuccaro, 2016), 박테리아성 펩티도글리칸(PG)(Erbs et al., 2008; Gust et al., 2007), 박테리아 지질다당류(LPS)(Dow et al., 2000; Silipo et al. ., 2005), 플라겔린(Boutrot & Zipfel, 2017; Felix et al., 1999) 등이 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 세포벽 관련 구성 요소가 planta의 동족 면역 수용체와 어떻게 상호 작용하는지 명확하지 않습니다. 이것이 세포 사멸 및/또는 세포벽 분해로 인해 발생하는지 아니면 편모와 같은 구성 요소의 활성 방출을 통해 발생하는지 여부는 추가 조사가 필요한 주제입니다(Bahar, 2020).
그람 음성 박테리아에 의한 세포벽 단편의 활성 방출의 예는 외막에서 주변 환경으로 수포가 생기고 꼬집어지는 세포외 소포(EV)의 분리입니다(Kulp & Kuehn 2010; Théry et al., 2018 ). 이러한 박테리아 EV는 일반적으로 외막 소포(OMV)라고 하며, 앞으로는 이 명명법을 준수할 것입니다(Schwechheimer & Kuehn, 2015). OMV 방출 과정은 숙주 군집화 과정을 포함하여 다양한 환경 조건에서 지속적으로 발생합니다(Gurung et al., 2011; Ionescu et al., 2014; Jin et al., 2011). OMV는 외막(OM) 단백질, LPS 및 지질과 같은 필수 외막 분자 외에도 단백질, 세포벽 분해 효소, 다당류 및 핵산과 같은 다양한 분자 배열로 구성된 주변 세포질 유체를 캡슐화합니다(Kuehn & 케스티, 2005). OMV는 숙주 군집화 중에 방출되고 그 화물은 MAMP로 구성되므로 OMV가 동족 면역 수용체에 근접하게 유도 분자를 전달하는 면역 유도자의 운반체 역할을 한다고 추측하기 쉽습니다(Bahar, 2020; Katsir & Bahar, 2017). 실제로 OMV는 숙주에게 제시될 때 포유류와 식물의 면역 체계를 모두 유도하는 것으로 나타났습니다(Bahar et al., 2016; Ellis & Kuehn, 2010; Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). 포유동물 세포에서는 OMV의 LPS와 단백질 성분이 모두 면역 유발물질로 작용하는 반면(Ellis et al., 2010), 식물에서는 어떤 OMV 분자가 주요 면역 유발물질인지는 아직 명확하지 않습니다.
숙주 면역 반응을 조절하는 것 외에도 OMV는 독성 인자를 갖고 있으며 다양한 과정에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에는 세포 간 통신(Deatheragea & Cooksona, 2012; Mashburn & Whiteley, 2005; Raposo & Stahl, 2019), 표적 세포에 독소 전달(Ellis & Kuehn, 2010; Kadurugamuwa & Beveridge, 1996), 생물막 형성(Schooling & Beveridge, 2006), 항균 화합물의 억제(Manning & Kuehn, 2011), 스트레스에 대한 반응(MacDonald & Kuehn, 2013), 수평적 유전자 전달(Fulsundar et al., 2014; Velimirov & Ranftler, 2018) 및 병독성(Ellis & Kuehn, 2010; Kunsmann et al., 2015). 이러한 사례의 대부분은 포유류 박테리아 병원체에 대한 연구에서 나온 것이지만, 식물 병원성 박테리아에 대한 최근 연구에서도 OMV가 박테리아 병독성과 식물 군체 형성을 촉진한다는 사실이 뒷받침됩니다. Ionescuet al. (Ionescu et al., 2014)은 목질관 혈관 형성 동안 식물 병원체 Xylella fastidiosa에 의한 OMV 생산이 식물의 물 전도성 요소(목질부)에 대한 박테리아 부착을 억제하여 고착 형태와 이동 형태 사이의 균형을 기울인다는 것을 보여주었습니다. 병원체는 이동형으로 이동합니다. 이 형태는 목부에서 세포 분산을 촉진하여 식물의 더 빠른 쇠퇴를 초래하는 것으로 여겨집니다(Ionescu et al., 2014). 두 가지 다른 연구에서는 II형 분비 리파제/에스테라제, 자일라나제, III형 분비 이펙터와 같은 독성 인자가 OMV와 관련하여 분비되는 것으로 나타났습니다(Chowdhury & Jagannadham, 2013; Sidhu et al., 2008; Solé et al. ., 2015) OMV가 세균 독성에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. OMV의 분자적 복잡성과 숙주 내 이중 기능(면역 유도 및 독성 촉진)으로 인해 OMV 공격에 대한 애기장대(Arabidopsis) 식물의 더 넓은 전사 반응을 연구하고 이러한 전사 변화가 있는지 테스트하게 됩니다. 후속 세균 감염에 대한 저항성 또는 감수성을 유발할 수 있습니다.
2 재료 및 방법
2.1 식물 재료 및 성장 조건
Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) 야생형 Col-0 계통과 bak-(Schlesinger et al., 2011) 및 Fallsever(Nekrasov et al., 2009) 돌연변이 계통이 이 연구에 사용되었습니다. 애기장대 종자를 표면 멸균하고 설명된 대로 Murashige 및 Skoog(MS) 한천 플레이트에 뿌렸습니다(Bahar et al., 2016). 플레이트를 2~4일 동안 4°C의 암소에 보관한 다음 5~8일 동안 발아를 위해 22°C로 옮겼습니다. 유사한 크기의 발아 묘목을 1%(w:v)의 자당(Duchefa Biochemie)을 포함하는 1ml의 MS 배지가 포함된 24-웰 플레이트(웰당 묘목 2개)로 옮기고 에서 추가로 8~10일 동안 재배했습니다. 아래에 설명된 바와 같이 추출기로 챌린지하기 전과 동일한 조건입니다. 프라이밍 분석을 위해, 애기장대 야생형 Col-0 계통과 돌연변이 계통(앞으로 떨어지고 뒤로 떨어지는)의 종자를 위에서 설명한 대로 발아시킨 후 혼합물이 들어 있는 7 x 7 x 6 cm 화분(1 묘목/포트)에 이식했습니다. soil Green #7611(Evenari, Ashdod, Israel)을 사용하고 22~24˚C에서 9.5시간 광주기에서 재배했습니다. 식물은
2.2 세균 외막 소포 정제
Xanthomonas campestris pv.의 글리세롤 주식. campestris(Xcc) 33913을 Nutrient Agar(Difco, NA, Becton, Dickinson, and Company) 플레이트에 도말하고 28˚C에서 2~5일 동안 성장시켰습니다. 단일 콜로니를 수집하여 10 ug/ml 세팔렉신 수화물(Cp, Sigma-Aldrich)을 함유한 3-mL YEB(효모 추출물 국물) 스타터를 접종하는 데 사용했습니다. 스타터는 185–200rpm으로 진탕하면서 28°C에서 밤새 성장한 후 2-L 플라스크에 항생제(위 설명 참조)가 포함된 PSB(펩톤 수크로스 국물) 배지 500ml를 접종하는 데 사용되었습니다. ~1:1000(v:v)의 비율로. 위에서 설명한 대로 배양물을 0.6~0.8의 OD600으로 성장시킨 후 박테리아 세포를 회전시키고 OMV를 설명한 대로 상등액에서 추출했습니다(Mordukhovich & Bahar, 2017). 그런 다음 조 OMV 제제를 Optiprep 구배 원심분리에 적용하여 설명된 대로 정제된 OMV를 얻었습니다(Bahar et al., 2016; Mordukhovich & Bahar, 2017). 각 OMV 배치를 1.5-L 박테리아 배양물로부터 정제하고 최종적으로 PBS(pH 7.3) 1ml에 재현탁시켰습니다. 정제된 OMV는 즉시 사용하거나 사용 전 최대 7일 동안 4°C에서 보관했습니다. OMV 크기 분포는 동적 광산란 장치(Zetasizer Nano ZS, Malvern Panalytical, Worcestershire, UK)를 사용하여 측정되었으며 평균 직경은 121.7 ± 55.43 nm(SD)였습니다. 입자 농도는 유사하게 측정되었으며 아래 각 실험 설명에 제공됩니다.
cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.
2.3 OMV를 이용한 애기장대 묘목 챌린지
OMV 챌린지에 대한 Arabidopsis의 전사 반응을 조사하기 위해 위에서 설명한 대로 24-웰 플레이트에서 자란 Col-0 묘목을 사용했습니다. OMV 챌린지 전날, MS 배지를 플레이트에서 빼내고 250ul의 멸균 dH2O로 교체하고 플레이트를 밤새 벤치에 두었습니다. 다음날 아침, 20ul의 정제된 OMV(웰당 1.44 x 109 입자에 해당하는 ml당 30ug) 또는 모의 멸균 dH2O를 각 웰에 첨가했습니다. 챌린지 후 2, 6, 24시간 후에 묘목을 수집하고 종이에 건조시킨 후 2-mL Eppendorf Safe-Lock 튜브(독일 함부르크)에서 액체 질소로 급속 냉동시켰습니다. 각 시점에서 OMV 처리 웰 4개와 모의 처리 웰 4개가 수집되었으며, 이는 각 시점에서 각 처리에 대한 4개의 생물학적 복제물을 나타냅니다.
2.4 RNA 정제
제조업체의 지침에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 Arabidopsis 묘목에서 RNA를 추출했습니다. 제조사의 지시에 따라 Turbo DNA-free Kit (Ambion, Thermo Fisher Scientific) 및 RNA Clean-Up and Concentration Kit (Norgen Biotek)을 사용하여 RNA를 추가로 정제했습니다. 정제된 RNA 샘플은 TapeStation 2200 기계(Agilent Technologies), RNA 스크린 테이프 및 RNA 스크린을 사용하여 농도 및 품질 분석을 거쳤습니다.
2.5 RNA 라이브러리 구축 및 서열분석
각 처리 및 시점별로 가장 순도가 높은 시료 2개를 선정하여 분석하였다. PolyA 캡처 기능이 있는 TruSeq mRNA 라이브러리(Illumina)는 Weizmann Institute of Science(이스라엘 레호보트)의 Crown Institute of Genomics에서 선택된 RNA 샘플로부터 준비되었습니다. 각 샘플에 태그를 지정하고 샘플에서 풀을 준비했습니다. 그런 다음 이 풀을 두 개의 NGS 레인 내부에 로드하고 Illumina HiSeq 시퀀싱 기계에서 고출력 실행 모드, 단일 읽기(SR) 60(v4)으로 실행했습니다.
2.6 시퀀싱 읽기 초기 처리
The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was >
2.7 유전자 온톨로지와 유전자 설명
GO(Gene Ontologies)는 TAIR의 GO Annotations(//www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp)를 사용하여 검색되었습니다. 유전자 모델에 따른 유전자 설명은 TAIR의 유전자 설명 검색(http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/genes/)을 사용하여 얻었습니다. GO 농축은 Arabidopsis 게놈 유전자좌(TAIR10)를 참조로 사용하여 AgriGO 웹 도구(//bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php)를 사용하여 계산되었습니다.
2.8 정량적 PCR 및 RNA-seq 검증
RNA-seq 데이터를 검증하기 위해, 설명된 대로(Bahar et al. , 2016). 전체적으로, OMV 또는 모의 처리된 묘목의 RNA에 대한 4개의 생물학적 복제물을 사용하여 RNA-seq 데이터세트의 17개 DEG를 테스트했습니다. 테스트된 유전자의 상대적 발현은 설명된 대로(Bahar et al., 2016) 7500 Fast 실시간 PCR 기계(Applied Biosystems)를 사용하여 유비퀴틴 발현과 비교되었습니다.
2.9 MAMP와 OMV에 대한 애기장대 전사 반응 비교
우리의 OMV로 유도된 데이터 세트는 flg22(Denoux et al., 2008) elf26(Zipfel et al., 2006), PGN(Willmann et al., 2011), OG(Davidsson et al. , 2017) 및 LPS(Livaja et al., 2008). 데이터 비교를 위해 GO 용어 강화가 수행되었으며 유도된 GO는 위에서 설명한 대로 Venn 다이어그램으로 시각화되었습니다.
2.10 애기장대 프라이밍 실험
Pseudomonas syringae pv.에 감염된 Arabidopsis에 대한 Xcc OMV의 프라이밍 효과를 테스트합니다. 토마토 DC3000(Pst)에서 Zipfel 외 연구진이 설명한 절차를 따랐습니다. (2004). 간단히 말해서, 위에서 설명한 대로 자란 6~8주 된 애기장대 식물의 잎에 50~100ul의 정제된 Xcc OMV(30ug/ml, 3.6-7.2 × 109 입자에 해당)가 침투되었습니다. 잎당), 1 μM flg22 또는 바늘 없는 주사기를 사용하는 물. 각 처리에 대해 5개의 잎/식물과 3개의 식물 복제물이 사용되었습니다. Pst 접종원은 King's B 배지 플레이트(20 g/L peptone, 1.5 g/L MgSO4 x7H2O, 10 ml/L 글리세롤 및 15 g/L agar)에서 28˚C에서 2~3일 동안 박테리아를 배양하여 준비했습니다. 그런 다음 콜로니를 물로 재현탁하고 접종원 농도를 105 CFU/ml로 조정합니다. Pst 접종원은 프라이밍 후 24시간에 바늘 없는 주사기를 사용하여 프라이밍된 잎에 침투되었습니다(대략 100ul가 각 잎에 침투되었습니다). 박테리아 성장은 접종 후 0시(접종 후 1시간) 및 접종 후 2일(dpi)에 접종된 잎을 수집하고 무게를 측정한 후 1ml의 10mM MgCl2에 침용하고 King's 배지에 10-배 연속 희석액을 도말하여 결정했습니다. B 한천 플레이트. 각 플레이트의 CFU 수는 2일 후에 결정되었으며 잎 g당 계산되었습니다.
그림 1 챌린지 후 2, 6, 24번째 OMV에 대한 애기장대 전사 반응. 챌린지 후 2, 6, 24시간에 OMV 또는 모의에 대한 애기장대 묘목 전사 반응의 주성분 분석(A) 및 샘플 상관 행렬(B)
2.11 체외 박테리아 성장 분석
시험관 내에서 Pst 성장에 대한 정제된 Xcc OMV의 효과를 평가하기 위해 Pststarters를 King's B 액체 배지에서 28˚C에서 24시간 동안 배양한 다음 각각 12ml의 King's B 배지를 포함하는 세 가지 다른 배양물에 접종하는 데 사용했습니다. }}1:100 비율의 mL 팔콘 튜브. 박테리아 배양물을 30 ug/ml OMV(1:50 또는 1:100, 각각 ml당 1.44 x 109 또는 7.2 x 108 입자에 해당) 또는 PBS를 대조군으로 사용하여 보정하고 28˚C에서 20시간 동안 배양했습니다. 박테리아 성장은 분광광도계(Amersham Biosciences)를 사용하여 600nm의 광학 밀도(OD)에서 22시간에 걸쳐 측정되었습니다.
3개의 결과
3.1 RNA-seq 분석을 통해 OMV 공격에 반응하여 차별적으로 발현되는 대규모 애기장대 유전자 세트가 밝혀졌습니다.
OMV 공격 후 애기장대의 전사 변화를 연구하기 위해 우리는 애기장대 묘목을 박테리아 병원체인 Xanthomonas campestris pv에서 정제된 OMV로 처리했습니다. campestris 33913(Xcc)을 사용하고 챌린지 후 2, 6, 24시간(hpc)에 식물 RNA를 수집했습니다. 그런 다음 OMV 및 모의 처리 샘플의 RNA를 재료 및 방법에 설명된 대로 서열 분석하고 분석했습니다. 주요 상관관계(그림 1A)와 샘플 상관관계 매트릭스 분석(그림 1B)은 각 치료 클러스터에서 생물학적 복제가 서로 밀접하게 연관되어 있음을 보여주며, 이는 생물학적 복제 간의 전반적인 전사 반응 유사성을 나타냅니다. 2 및 6 hpc 클러스터에서 OMV 처리된 샘플은 함께 클러스터되었으며, 이는 OMV 처리가 샘플링 시간보다 전사 반응에 더 큰 영향을 미쳤음을 나타냅니다(그림 1B). 반면, OMV 처리된 샘플은 24 hpc에서 각각의 모의 처리와 함께 클러스터되며, 이는 이 시점에서 OMV에 의해 유도된 전사 변화가 감소하고 모의 처리된 식물의 전사 변화와 유사함을 나타냅니다.
cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.
테스트된 각 시점에서 OMV 처리된 묘목을 모의 처리된 묘목과 비교하고 차별적으로 발현된 유전자(DEG)를 추출했습니다. 모든 시점을 합친 결과, 총 984개와 175개의 유전자가 각각 유의하게(Logfold 변화 > 1 또는 ← 1, p 값 및 FDR < 0.05) 상향 또는 하향 조절된 것으로 나타났습니다. OMV 챌린지에 대한 응답입니다(그림 2A, 보충 표 S1). 유전자 발현 Log Fold-change(LogFC) 범위는 최대 9.08(AT1G26410, 6 hpc)이며, 이는 초과 500-배 변화에 해당하며 -5.73(AT3G17520, 24 hpc)까지입니다. DEG의 가장 높은 수는 2 및 6 hpc에서 발견되었으며, 여기서 총 647 및 876 DEG가 각각 확인되었습니다(상향 및 하향 조절 결합). 24hpc에서 121°가 발견되었습니다. OMV 챌린지 후 2시간 및 6시간에 상향 조절된 유전자의 50% 이상이 그들 사이에 공유되었습니다(그림 2B). 시간적 유전자 발현 변화를 조사하기 위해 모든 시점(37개 유전자)에서 발견된 모든 상향 조절된 DEG를 추출하고 시간에 따른 배수 변화를 비교했습니다(그림 2C). 이들 유전자의 배수 변화 발현은 다양한 시점에 따라 상당히 달랐습니다(일원 분산 분석; F2,108=8.1633, p= 0.0005). Tukey Kramer HSD 테스트를 사용한 사후 비교에서는 LogFC가 2(M=3.45, SD=1.72) 및 6 hpc(M=3.87, SD) 모두인 것으로 나타났습니다.=1.98)은 24 hpc(M=2.32, SD=1.31)(p=0.0145 및 p=0)보다 상당히 높았습니다. .0005)(그림 2D). 6hpc의 평균 LogFC 발현은 2hpc보다 높았으나 통계적으로 다르지 않았습니다(p= 0.5413). 따라서 테스트한 세 가지 시점의 DEG 수와 전체 유전자 LogFC를 고려할 때 OMV 챌린지 후 2시간과 6시간에 가장 중요한 전사 변화가 발생했다는 결론을 내릴 수 있습니다. RNA-seq 결과의 타당성을 조사하기 위해 특정 프라이머를 사용한 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 상향 조절된 17개 유전자의 발현을 결정했습니다. 테스트된 유전자 중 14개는 RNA-seq 분석에서와 동일한 패턴을 나타냈으며 모의 유전자에 비해 상당히 상향 조절되었습니다. 테스트된 유전자 중 3개는 상대적인 발현이 더 높았지만 이 방법으로 모의와 크게 다르지 않았습니다(공급 그림 S1).
그림 2 Arabidopsis는 OMV 공격에 반응하여 차별적으로 발현된 유전자를 나타냅니다. (A) 2에서 차별적으로 발현된 유전자(DEG)(상향 또는 하향 조절, LogFC > 1 또는 ← 1, p-값 및 FDR < 0.05)의 총 수, 6, 챌린지 후 24시간. (B) 서로 다른 시점에서 DEG 간의 중첩(왼쪽, 상향 조절, 오른쪽, 하향 조절). (C) 세 가지 시점 모두에서 발견된 상향 조절된 유전자를 LogFC 발현 그래프에 플롯하여 시간에 따른 유전자 발현을 보여줍니다. (D) 다양한 시점에서 모든 DEG의 LogFC 평균. 서로 다른 문자는 Tukey-Kramer HSD 테스트에 의한 p < 0.05의 통계적 차이를 나타냅니다.
3.2 애기장대는 OMV에 반응하여 면역체계 활성화 쪽으로 전사 이동을 합니다.
OMV 챌린지에 크게 영향을 받는 Arabidopsis 경로를 식별하기 위해 AgriGO 웹 도구를 사용했습니다(Du et al., 2{4}}10; Tian et al., 2017). 우리는 OMV 챌린지에 대한 응답으로 결합된 모든 시점에서 각각 333개와 55개의 유의미한(FDR < 0.05) 상향 및 하향 조절 유전자 온톨로지(GO) 용어를 식별했습니다. 상향 조절된 GO의 거의 25%는 자극에 대한 식물 반응과 관련이 있었습니다(그림 3A). '자극에 대한 반응' 범주 내에서 가장 지배적인 GO 용어는 스트레스 반응, 생물학적 자극, 화학 물질 및 내인성 자극과 관련이 있습니다(그림 3B; 보충 표 S2). AgriGO 도구는 또한 '트랜스퍼라제 활성', 키나제 활성', '전사 인자 활성', '이온 및 금속 이온 결합', '탄수화물 결합', '단백질 결합', '촉매 활성'을 포함하여 크게 상향 조절된 103개의 분자 기능을 식별했습니다. , '아데닐 뉴클레오티드 결합', '막횡단 수용체 활성' 및 기타 결합 기능(공급 표 S2). 중요한 용어의 세포 위치는 핵, 액포 및 막내막 시스템을 포함하여 세포의 여러 구획에 있었지만 가장 두드러지게 세포 주변과 연관되어 있으며 '원질막', '세포외 영역', '세포벽' 및 '세포벽'이 포함되었습니다. 'apoplast' 온톨로지(공급 표 S2). 반면에 상당히 하향 조절된 GO에는 '독소 이화작용 및 대사 과정', '물 및 물 부족에 대한 반응', '지질 수송 및 국소화' 등의 용어가 포함되었습니다(공급 표 S2). 생물학적 자극에 대한 반응과 관련된 GO는 하향 조절된 유전자가 풍부하지 않았습니다. 크게 하향 조절된 분자 기능에는 '산화환원효소 활성', '헴 결합', '철 이온 결합', '지질 결합', '산소 결합' 및 기타 산소 관련 기능과 같은 많은 산화환원 용어가 포함되었습니다(공급 표 S2). . 하향 조절된 용어는 세포외 영역에도 위치했습니다. 가장 높은 표현을 가진 GO 용어 DEG가 속하는지 확인하기 위해 LogFC가 4보다 높거나 -4보다 작은 유전자를 선택하여 원래 DEG 목록을 필터링했습니다(16-배 차이에 해당). . 우리는 이러한 기준을 충족하는 117개의 유전자를 식별했으며, 그 중 115개는 모든 시점에서 상향 조절되었고 2개는 하향 조절되었습니다. LogFC가 -4 미만인 하향 조절된 유전자의 수가 적기 때문에 크게 억제된 GO는 확인되지 않았습니다. 한편, 상당히 상향 조절된 72개의 GO가 확인되었으며, 그 중 가장 중요한 것은 '외부 생물 자극에 대한 반응', '다른 유기체에 대한 반응', '산소 수준에 대한 세포 반응', '방어 반응'과 관련이 있습니다. , '스트레스에 대한 반응' 및 더 많은 면역 관련 GO(그림 3C).
그림 3 Xcc OMV 챌린지에 대한 응답으로 강화된 Arabidopsis 유전자 온톨로지(GO) 용어. 상향 조절된 생물학적 과정(A) 및 자극에 대한 반응(B) GO 용어의 카테고리 분포를 원형 차트로 표현합니다. (C) OMV 챌린지에 대한 반응으로 LogFC가 4보다 큰 애기장대 유전자 목록. DEG의 전체 데이터 세트에서 유전자를 필터링하고 AgriGo 웹 도구를 사용하여 풍부한 GO 용어를 식별하는 데 사용했습니다. FDR 컷오프 < 0.05
3.2 OMV 공격으로 인해 면역 수용체가 상향 조절되었습니다.
MAMP 감지 및 MAMP에 대한 식물 반응은 주로 병원체 인식 및 효율적인 감염 완화를 중재하는 막 결합 PRR에 의해 매개됩니다. PRR은 일반적으로 수용체 키나제(RK)와 수용체 유사 단백질(RLP)의 두 그룹으로 분류됩니다(Boutrot & Zipfel, 2017). OMV에 반응하여 차등적으로 발현된 PRR을 확인하기 위해 우리는 DEG 세트를 이전에 확립된 Arabidopsis RK(Kemmerling et al., 2011; Mott et al., 2016) 및 RLP(Wang et al., 2008) 목록과 비교했습니다. 우리는 데이터 세트에서 결합된 모든 시점에서 각각 33개 및 10개의 상향 조절된 RK 및 RLP를 확인했습니다(표 1). 하향 조절된 175개 유전자 목록에서는 RK 또는 RLP가 발견되지 않았습니다. Kemmerlinget al. (2011)은 flg22 및 NLP(괴사 및 에틸렌 유도 펩타이드 1-유사 단백질)와 같은 MAMP 또는 병원체 처리에 의해 발현이 크게 유도된 49개 RK의 목록을 정의했습니다. 우리는 이 목록을 실험에서 상향 조정된 RLK와 비교한 결과 Kemmerling et al.이 정의한 RK의 45%가 있음을 발견했습니다. (2011)도 OMV에 대한 반응으로 유도되었습니다. 그중에서도 주목할만한 것은 FRK1, SOBIR1, SERK4, RLK/IKU2, PSKR1, HAESA, EFR, BIR 및 IOS1입니다(표 1). RK 그룹 중에서 FRK1은 LogFC가 각각 7.11과 5.2로 2hpc와 6hpc에서 가장 높은 발현을 보인 반면, 모든 RK의 평균 LogFC는 2hpc와 6hpc에서 각각 2.11과 2.13이었습니다. 막 결합 RK 및 RLP는 대부분 침입하는 미생물의 세포외 감지를 중재하는 반면, 뉴클레오티드 결합 부위-류신 풍부 반복(LRR) 수용체(NLR)는 세포내 면역 수용체입니다. 우리는 2 및 6 hpc에서 OMV-챌린지에 반응하여 상향 조절된 7개의 서로 다른 NLR 유전자를 발견했으며, 24 hpc에서는 아무 것도 발견되지 않았습니다(NLR 목록은 TAIR에서 추출되었으며, 102개 유전자)(표 1).
남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능
3.3 OMV는 여러 WRKY 전사 인자의 발현을 유도합니다
WRKY 전사 인자(TF)는 MAMP 유발 면역(MTI) 및 효과기 유발 면역(ETI) 반응 모두에 참여하는 식물 면역 반응에서 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다(Birkenbihl et al., 2018; Rushton et al., 2010 ). OMV 챌린지는 2 및 6 HPC에서만 20개의 서로 다른 WRKY TF(TAIR에서 추출한 목록, 70개 유전자)의 상향 조절을 가져왔습니다(표 1). WRKY TF는 하향 조절된 유전자 세트에 없었습니다. OMV 챌린지에 의해 영향을 받는 또 다른 TF 계열은 MYB 도메인 함유 단백질(Tsuda & Somssich, 2015)이며, 이는 생물학적 및 비생물적 스트레스를 포함한 여러 과정에 관여하는 것으로 알려져 있습니다(Ambawat et al., 2013). 전체적으로 OMV 챌린지에 반응하여 9개의 서로 다른 MYB TF(TAIR에서 추출한 목록, 211개 유전자)가 차등적으로 발현되었으며, 5개는 상향 조절되었고 4개는 하향 조절되었습니다(표 1). 검출된 차별적으로 발현된 TF의 추가 클래스가 표 1에 나열되어 있습니다.
3.4 OMV에 대한 애기장대 전사 반응과 정제된 MAMP에 대한 반응 비교
정제된 유도자에 대한 애기장대 반응과 조잡하고 분자적으로 복잡한 구조인 OMV의 차이점을 알아보기 위해 우리는 RNA-seq 데이터를 flg22를 포함한 알려진 MAMP에 대한 애기장대 반응의 기존 전사체 데이터와 비교했습니다(Denoux et al., 2008) elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN(Willmann et al., 2011), OG(Davidsson et al., 2017) 및 LPS(Livaja et al., 2008). 강화된 GO는 위에서 설명한 대로(공급 표 S3) 위에서 언급한 데이터 세트에서 추출되었으며 OMV 챌린지에 따라 강화된 GO와 비교되었습니다. 일반적으로 OMV에 의해 유도된 Arabidopsis GO 용어는 단일, 단백질성 및 비단백질성 MAMP에 의해 유도된 것과 유사했으며, 각각 flg22, elf26 및 PGN에 의해 유도된 GO와 OMV 유도 GO의 56, 51 및 47%를 공유했습니다. 반면, OMV 유도 GO와 각각 24% 및 33%를 공유하는 LPS 및 OG에서 유도된 GO의 낮은 중첩이 나타났습니다(그림 4A). 특히, LPS 유발 면역 반응의 특징인 발병 관련 1(PR1) 유전자(At2g14610)(Silipo et al., 2005, 2008)는 테스트한 모든 시점에서 OMV 유발 유전자 목록에 없었습니다. 41개의 GO는 여기에서 테스트된 다른 MAMP가 아닌 OMV에 의해 유도된 것으로 나타났습니다(그림 4B). 이 목록에는 '아포토시스', '약물에 대한 반응', '약물 수송 및 '다중 약물 수송', '리파제 활성'과 관련된 GO가 포함되어 있습니다(공급 표 S3, 별표와 굵은 글꼴로 표시).
3.5 OMV는 세균 감염에 대한 애기장대 저항성을 유도합니다.
여기와 이전(Bahar et al., 2{26}}16), 우리는 Arabidopsis 면역 체계가 OMV 공격에 의해 유도된다는 증거를 제시했습니다. 이러한 OMV 매개 면역 유도가 효과적인 면역 반응으로 전환되는지 조사하기 위해 우리는 애기장대 식물을 OMV로 전처리한 후 박테리아 접종하는 planta 박테리아 성장 테스트(Zipfel et al., 2004)를 사용했습니다. Pseudomonas syringae pv.가 10-배 이상 크게 감소했습니다. 토마토 DC3000(Pst) CFU/g 잎은 접종 2일 후 모의 전처리와 비교하여 OMV 및 flg{6}} 전처리된 식물 모두에서 관찰되었습니다(그림 5A). Pst의 시험관 내 성장은 배지에 OMV를 첨가해도 부정적인 영향을 받지 않았으며, 이는 planta에서 감소된 Pst 성장이 OMV의 프라이밍 효과와 관련이 있고 박테리아에 대한 OMV의 직접적인 영향이 아님을 시사합니다(공급 그림 S2). Pst에 대한 OMV 유발 저항이 FLS2, EFR 또는 BAK1에 의해 매개되는지 여부를 테스트하기 위해 Col-0, bak- 돌연변이 및 이중 돌연변이 계통이 efr에 해당하는 실험을 반복했습니다. 두 돌연변이 계통 모두에서 OMV 전처리는 모의 처리 식물과 비교하여 Pst CFU/g 잎의 상당한 감소를 가져왔습니다(그림 5B-C). 예상대로, flg22로 처리된 fls efr 및 bak-돌연변이 계통은 flg22에 반응하지 않는 것으로 알려져 있으므로 처리되지 않은 식물과 유사한 Pst 역가를 나타냈습니다. Col-0의 병원체 역가의 상대적 감소와 프라이밍된 식물의 면역 수용체 돌연변이 계통을 비교하기 위해 우리는 3개의 독립적인 실험에서 OMV 및 모의 처리 식물의 Pst 역가 차이를 계산했습니다(Supp .그림 S3). OMV 전처리된 등나무에서 Pst 역가의 평균 감소는 Col{25}} 식물에서 관찰된 것보다 작았습니다(bak 및 Col{30}}에 대해 각각 0.89 대 1.14 Log CFU/gr 잎 감소, 1- 분산 분석 방식; F2,4=4.3781, p=0.0523). fls efr 돌연변이 라인(fls efr 및 Col-0에 대해 각각 1.26 대 1.32 Log CFU 감소, 일원 분산 분석: F1,4=0.0352, p)에서는 유사한 감소가 나타나지 않았습니다.=0.5698)(그림 5D-E).
표 1 애기장대 묘목에서 OMV 유발 RK/RLP 및 면역 관련 전사 인자
표 1 (계속)
표 1 (계속)
4 토론
박테리아 외막 소포(OMV)는 박테리아 외막에서 유래한 복잡한 나노구조이며 수백 개의 단백질과 기타 세포벽 구성 요소로 구성됩니다. 이전에는 Arabidopsis 식물이 ROS 폭발, 면역 표지 유전자 발현 및 중간 알칼리화와 같은 일반적인 면역 반응을 활성화하여 OMV 공격에 반응하는 것으로 나타났습니다(Bahar et al., 2016). 이 연구에서 우리는 세균성 OMV에 대한 Arabidopsis의 광범위한 전사 반응과 후속 감염에 미치는 영향을 조사했습니다. 본 연구에서 수행된 RNA-seq 데이터 분석의 가장 중요한 결론은 애기장대 면역 체계가 Xanthomonas campestris pv.campestris(Xcc) OMV에 노출된 후 준비가 되어 있다는 것입니다. 이 결론은 뚜렷하고 보완적인 분석에 의해 뒷받침됩니다. 첫째, Xcc OMV에 노출된 식물의 유전자 온톨로지(GO) 농축은 OMV가 Arabidopsis에 의해 스트레스 요인으로 인식된다는 것을 분명히 보여줍니다. 식물 반응의 세포 위치는 주로 도전 물질인 OMV에 대한 외부 세포 인식을 암시하는 세포 주변과 연관되어 있습니다. 이는 알려진 많은 MAMP와 유사하게 OMV와 그 구성 요소가 세포외 수용체에 의해 감지된다는 개념을 뒷받침합니다. 둘째, 우리는 OMV 문제에 대응하여 대규모의 RK 및 RLP 제품군이 상향 조정되었음을 확인했습니다. 이들 수용체 중 다수는 병원체 인식을 중재하는 것으로 알려져 있거나 이전에 식물 면역 반응과 연관되어 있는 것으로 나타났습니다. FLG22-유도 수용체 유사 키나제 1(FRK1)은 가장 고도로 유도된 수용체였습니다. Xcc OMV 단백질체학 분석에서 플라젤린을 검출할 수 없었기 때문에 이는 흥미로웠습니다(데이터는 표시되지 않음). FRK1은 다른 면역 유발인자에 의해서도 유도되는 것으로 알려져 있지만, 왜 FRK1의 발현이 여기에서 상향 조절된 나머지 RK보다 훨씬 높은지는 흥미롭습니다. 반면, 신장 인자 수용체(EFR) 발현은 2시간 시점에만 상당히 상향 조절되었으며, EF-Tu가 Xcc OMV에서 발견되었음에도 불구하고 LogFC는 1.12였습니다(Bahar et al., 2016 ). 우리는 또한 OMV 공격에 반응하여 상향 조절된 몇 가지 NLR 유전자를 발견했으며, 그 중 절반은 질병 저항성 단백질로 주석이 달렸지만 식물 면역에서의 기능은 설명되지 않았습니다. NLR이 OMV 인식에 직접적으로 관여한다는 가설은 없지만 flg22, elf18 및 LPS와 같은 정제된 MAMP에 대한 반응으로 관찰된 것처럼 NLR이 OMV 분자를 감지하는 RK/RLP의 하류에서 유도될 수 있습니다(Denoux et al., 2008 Livaja 외, 2008; Zipfel 외, 2006). 셋째, 많은 면역 관련 전사 인자인 WRKY, MYB 등이 OMV에 의해 크게 상향 조절되었습니다(Bjornson et al., 2021). 우리 연구에서 OMV에 대한 주요 전사 변화는 처음 두 시점(2 및 6 hpc)에서 발생했습니다. 이는 상당히 많은 수의 차별적으로 발현된 유전자(DEG)와 2 및 6 hpc에서 상당히 높은 로그 접힘 변화(LogFC)로 설명됩니다. 그럼에도 불구하고 24hpc에서 발견된 총 121개의 DEG 중 거의 절반(52개)이 2 또는 6hpc에서는 발견되지 않았습니다. 이는 24hpc에 있는 DEG의 절반이 후기 조절 유전자이며, 그 발현이 6hpc보다 늦게 상향 또는 하향 조절되었음을 시사합니다. 실제로, 유도자 도전에 따른 다양한 발현 역학을 갖는 애기장대 유전자는 이전에 확인되었습니다(Bjornson et al., 2021).
그림 4 OMV와 단일 정제된 MAMP에 대한 반응으로 강화된 유전자 온톨로지(GO) 용어의 비교. AgriGo 웹 도구를 사용하여 강화된 GO를 추출하는 데 MAMP 챌린지(elf26, flg22, OGs, PGN 및 LPS, 참고 자료의 재료 및 방법 섹션 참조)에 대한 응답으로 Arabidopsis 발현 데이터 세트를 사용했습니다. 각 MAMP의 강화된 GO 세트는 Venny(A 및 지원 표 S3)를 사용하는 OMV에 대한 응답으로 강화된 GO 목록과 비교되었습니다. OMV 데이터 세트에서만 강화된 GO 용어는 FDR 값을 기준으로 정렬되어 (B)에 표시됩니다.
우리 연구에서 OMV에 대한 주요 전사 변화는 처음 두 시점(2 및 6 hpc)에서 발생했습니다. 이는 상당히 많은 수의 차별적으로 발현된 유전자(DEG)와 2 및 6 hpc에서 상당히 높은 로그 배수 변화(LogFC)로 설명됩니다. 그럼에도 불구하고 24hpc에서 발견된 총 121개의 DEG 중 거의 절반(52개)이 2 또는 6hpc에서는 발견되지 않았습니다. 이는 24hpc에 있는 DEG의 절반이 후기 조절 유전자이며, 그 발현이 6hpc보다 늦게 상향 또는 하향 조절되었음을 시사합니다. 실제로, 유도자 도전에 따른 다양한 발현 역학을 갖는 애기장대 유전자는 이전에 확인되었습니다(Bjornson et al., 2021). 우리가 여기서 본 빠르고 대부분 일시적인 유전자 발현 패턴은 MAMP에 대한 Arabidopsis의 시간적 반응을 테스트한 다른 연구와 일치합니다. 예를 들어, Denoux et al. (2008) 및 Bjornson et al. (2021)은 다양한 MAMP에 대한 반응으로 Arabidopsis의 전사 변화가 몇 분에서 몇 시간 내에 발생하며 대부분의 경우 DEG는 식물 공격 후 24시간 이내에 기본 수준으로 돌아간다는 것을 보여주었습니다. 정제된 MAMP 또는 OMV와 같은 무생물 샘플로 공격을 받을 때 상호 작용이 역동적이고 지속적으로 진행되는 식물과 병원체 간의 상호 작용과는 달리, 적어도 전사 수준에서는 식물이 반응할 것으로 예상할 수 있습니다. 일시적이고 며칠 동안 지속되지 않습니다. 지난 30년 동안 집중적인 연구를 통해 미생물 인식을 담당하는 다양한 식물 면역 수용체가 밝혀졌습니다. 이러한 수용체 중 다수는 단일 미생물 특징을 감지할 수 있는 능력을 갖고 있으며 병원체 인식, 면역 체계 신호 전달, 모델 및 작물의 반응을 더 잘 이해하기 위해 자세히 연구되고 있습니다. 그러나 식물은 다양한 출처의 다양한 미생물 특성에 동시에 노출되어 면역 인식 및 반응이 복잡해집니다. 우리는 더 자연스럽고 복잡한 미생물 구조를 나타내지만 미생물 자체에서는 어느 정도 복잡성이 제거된 OMV와 비교하여 단일 정제된 MAMP에 대한 Arabidopsis의 전사 반응의 차이를 조사하는 데 관심이 있었습니다. OMV는 독성 인자, 분해 효소, 독소 및 planta에서 박테리아 성장에 기능적 역할을 할 수 있는 기타 생체 분자를 가지고 있으므로 OMV 챌린지가 합성 MAMP에 의해 유도되지 않는 독특한 GO를 유도하는지 테스트하는 것은 흥미로웠습니다.
그림 5 OMV로 애기장대 잎을 전처리하면 후속 세균 감염에 대한 저항성이 유도됩니다. Col-0 식물(A)을 대조군으로 OMV, 물(모의) 또는 flg22로 전처리하고 24시간 후에 바늘 없는 주사기 침투를 사용하여 Pst DC3000의 105 CFU/ml 현탁액을 접종했습니다. . 접종된 잎의 Pst DC3000 세포 역가는 연속 희석 도금을 통해 접종 48시간 후에 결정되었습니다. Arabidopsis Col-0 및 fls efr(B) 또는 bak(C) 식물을 (A)에 설명된 것과 유사한 실험으로 테스트했습니다. Col-0 및 Col-0 및 Back(E)에서 OMV 전처리(처리되지 않은 식물과 비교) 후 평균 Log Pst DC3000 CFU/gr 감소를 비교했습니다. 각 막대는 3개의 독립적인 실험에서 얻은 평균 Log Pst DC3000 CFU/gr 감소를 나타냅니다(독립적인 실험의 데이터는 그림 S3 참조). 차이는 통계적으로 유의하지 않았습니다(양측 학생 t-검정. p 값은 그래프 막대 위에 표시됨). 실험 A, B 및 C는 유사한 결과를 가지고 최소 3회 수행되었습니다(각 실험에서 처리당 3개의 식물/복제본). 별표(**)는 모의와 비교하여 유의미한 차이를 나타냅니다(Dunnet의 테스트 p < 0.001).
전사체 비교를 위해 우리는 유사한 실험 조건, 즉 식물과 유사한 시점의 연구에서 데이터를 수집했습니다. OMV와 flg22, elf26 및 PGN에 대한 애기장대 반응에서 GO 농축의 상당한 중복이 나타났습니다. 병원체 감지 시 활성화되는 많은 방어 경로가 특정 유발인자나 그 출처에 관계없이 유사하다는 것이 알려져 있으므로 이는 예상치 못한 일이 아닙니다(Bjornson et al., 2021; Zipfel et al., 2006). 그럼에도 불구하고 일부 고유한 GO는 우리가 조사한 다른 MAMP가 아닌 OMV에 의해 상향 조정되는 것으로 나타났습니다. 이들 중에는 '리파제 활성' 및 '글리코실 결합에 작용하는 가수분해효소 활성'과 같은 세포벽 분해와 관련된 GO가 있는데, 이는 식물 방어 시스템이 OMV 분해를 목표로 하고 있음을 나타낼 수 있습니다. 흥미롭게도 약물 수송과 관련된 세 가지 GO도 OMV 챌린지에 의해 고유하게 상향 조절되는 것으로 밝혀졌습니다. 이는 식물이 아마도 OMV 매개 전달에 의해 세포로 전달되는 독성 화합물에 직면하고 있음을 나타낼 수 있습니다. 면역 유도 펩타이드 및 PGN에 대한 애기장대의 반응과 달리, 우리는 OMV OG 및 LPS에 대한 애기장대의 반응 사이에 상대적으로 거의 겹치는 것을 관찰하지 못했습니다. 특히 LPS와의 이러한 작은 중복은 포유류 세포에서 LPS가 OMV에 의해 유도된 숙주 면역 반응에 대한 강력한 기여자로 잘 알려져 있다는 점을 고려하면 다소 놀랍습니다(Ellis et al., 2010). 또한 LPS 면역 특징인 PR1(Silipo et al., 2005)의 상향 조절을 찾을 수 없다는 사실은 LPS가 박테리아 OMV와 식물 면역 상호 작용의 주요 유도자가 아니라는 것을 암시할 수 있습니다. 그러나 이에 대해서는 좀 더 철저하게 조사해야 할 문제로 남아 있습니다. OMV는 포유류와 식물 숙주 모두의 세균 집락화에 기여하고 일부 경우에는 세균 독성에 기여하는 것으로 나타났습니다. 반면, OMV는 숙주 면역 체계를 활성화하여 양날의 검으로 작용하여 한편으로는 박테리아 생존과 병독성을 촉진하고, 다른 한편으로는 숙주 감시 시스템에 먹이를 주고 다른 한편으로는 숙주 면역을 활성화합니다(McMillan & Kuehn, 2021 ). 우리의 프라이밍 분석은 OMV 챌린지가 Pseudomonas syringae pv.의 상당한 억제를 초래한다는 것을 보여주었습니다. planta에서 토마토 DC3000(Pst) 성장은 합성 MAMP에서 나타나는 프라이밍 효과와 유사합니다(Jung et al., 2009). 따라서 이 경우 접종된 조직에 OMV를 사전 투여하면 박테리아의 식민지화를 촉진하지 않고 오히려 식물이 병원체 성장을 억제하는 효과적인 면역 반응을 유도하도록 준비했습니다. 이 결과는 우리의 전사 데이터 및 이전 연구와 일치하며 OMV가 Arabidopsis에서 강력하고 효과적인 면역 반응을 유도한다는 개념을 뒷받침합니다. 최근 두 연구에 따르면 병원성 또는 공생 슈도모나스 종의 OMV로 애기장대를 전처리하면 후속 Pst 감염이 억제되는 것으로 나타났습니다(Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). 이러한 결과는 테스트된 조건에서 OMV 침투가 병원체 감염을 촉진하지 않는다는 것을 누적적으로 나타냅니다. 이전 연구에서 우리는 여러 면역 수용체 돌연변이가 Xcc OMV에 대한 WT 반응성을 유지한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 돌연변이에는 단백질성(FLS2, EFR, RLPReMAX) 또는 비단백질성 MAMP(LYM1/LYM3)를 인식하는 알려진 PRR이 포함되었습니다(Bahar et al., 2016). 흥미롭게도 Janda et al. (2021)은 애기장대(독감)의 FLS2 수용체 돌연변이 계통이 Pst의 OMV로 공격을 받았을 때 FRK1 발현이 변하지 않았고 모의 처리된 식물과 유사했다고 보고했는데, 이는 FLS2가 Pst OMV에 대한 반응을 매개한다는 것을 시사합니다. 플라젤린은 Xcc 33913 OMV보다 Pst OMV 제제에 더 풍부할 수 있으므로 플라젤린 수용체의 제거는 Xcc OMV보다 Pst에 대한 식물 반응에 더 뚜렷한 영향을 미쳤습니다.
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서로 다른 식물 면역 분석법은 서로 다른 결과를 낳을 수 있으며, 이로 인해 모순되는 결론이 나올 수 있다는 것이 밝혀졌습니다. 예를 들어, 잎 디스크 ROS 버스트 분석에서 OMV에 대한 Arabidopsis의 반응은 EFR 수용체에 의존적이지만 Arabidopsis 모종을 사용한 면역 마커 유전자 발현 분석에서는 돌연변이 계통이 OMV에 대해 다음과 같이 반응한다는 것을 보여주었습니다. WT. McMillanet al. (2021)은 OMV에 적용된 다양한 물리적 처리가 묘목 성장 억제와 같은 특정 활동을 폐지했음을 보여주었습니다. 그러나 식물 프라이밍과 같은 다른 면역 출력은 변경되지 않았습니다. 따라서 다양한 분석법을 결합하여 다양한 면역 출력을 테스트하여 주어진 유발인자에 대한 식물 면역 반응에 대한 최대한 광범위한 관점을 얻는 것이 중요합니다. 알려진 PRR 및 공동 수용체 중 일부의 관련성을 추가로 조사하기 위해 식물 프라이밍 분석을 사용하여 낙상 및 bak 돌연변이 계통을 테스트했습니다. 우리의 결과는 Arabidopsis 이중 돌연변이 계통 낙하가 WT 식물과 마찬가지로 Xcc OMV에 의해 유사하게 준비되어 플라젤린 및 EF-Tu 이외의 MAMP가 Xcc 33913 OMV에도 존재한다는 개념을 뒷받침한다는 것을 보여줍니다. 면역 표지 유전자 발현 분석을 기반으로 우리는 이전에 BAK1 공동 수용체가 OMV 인식 및/또는 반응에 관여한다고 제안했습니다(Bahar et al., 2016). 본 연구에서 우리는 프라이밍 분석을 사용하여 이 제안을 재검토했습니다. 여기서, bak 돌연변이 계통은 OMV 전처리에 의해 프라이밍되었지만 WT Col-0 식물보다 약간 낮은 수준이었습니다. 이 마진은 통계적으로 유의미하지는 않지만 이중 fls 에버 돌연변이 계통에서 볼 수 있는 것보다 컸습니다. 이 결과는 면역 프라이밍 실험에서 bak 돌연변이 계통이 WT 식물로서 OMV에 반응한다는 것을 보여준 최근 연구와도 일치합니다(Tran et al., 2021). 전반적으로 이는 BAK1이 OMV 인식에 관여하는 반면 다른 면역 인식 및 신호 전달 경로는 OMV에 의해 준비되어 효과적인 면역 반응과 병원체 성장 억제로 이어진다는 것을 암시할 수 있습니다. OMV에 반응하는 공동 수용체 BAK1 및 SOBIR1의 참여(Bahar et al., 2016)로 인해 우리는 PRR과 같은 여러 면역 수용체가 OMV 인식에 관여한다고 가정하게 되었습니다. 그러나 최근 연구에 따르면 OMV에 의한 식물 면역 활성화는 MAMP와 독립적일 수 있으며 OMV 통합에 의해 유도된 식물 원형질막의 물리화학적 변화로 인해 발생할 수 있다고 제안되었습니다(Tran et al., 2021). 이는 아직 더 다루어져야 할 흥미로운 가설이다. 흥미롭게도 McMillan et al. (2021)은 단백질분해효소 K로 처리된 OMV가 면역 프라이밍 능력을 유지했다고 보고했는데, 이는 이 활동이 OMV 단백질성 화물과 무관할 수 있음을 나타냅니다. 이 결과는 Tran et al.의 MAMP 독립적 면역 활성화 가설을 뒷받침할 수 있습니다. (2021), LPS 및 PGN과 같은 OMV에 존재하는 다른 비단백질성 MAMP는 MTI를 활성화할 수 있습니다(Bahar et al., 2016; McMillan et al., 2021). 또한, 단백질분해효소 K로 처리된 OMV는 묘목 성장 억제를 유도하는 능력을 유지했는데, 이는 성장 억제가 OMV의 단백질성 화물에 의존한다는 것을 나타냅니다(McMillan et al., 2021). 전체적으로, 이러한 결과는 OMV에 대한 식물 반응의 복잡성과 특정 경로에서 특정 유발 인자의 관련성을 테스트하기 위해 다양한 출력을 사용하는 것의 중요성을 더욱 강조합니다.
2021년에 이 연구(동시에 수행되었을 가능성이 있음)를 포함한 4개의 독립적인 연구에서는 박테리아 OMV가 식물 면역 체계를 조절하고 병원체 감염에 대한 효과적인 반응을 유도한다고 보고했습니다(Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021; Tran et al., 2021). 이러한 흥미로운 결과는 아직 배울 것이 많은 식물-미생물 상호 작용에서 OMV를 새롭고 중요한 역할로 자리매김하고 있습니다. 이 연구에서 우리는 Xcc OMV에 대한 Arabidopsis의 전사 반응에 대한 더 넓은 관점을 제공합니다. OMV에 대한 식물 인식과 관련된 구성 요소와 메커니즘을 더 깊이 이해하려면 보완적인 연구 접근 방식이 필요합니다.
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