박테리아 소포는 TLR4-TRIF 축을 통해 대식세포의 바이러스 복제를 차단합니다.
Sep 27, 2023
추상적인
그람 음성 박테리아는 자연적으로 의사소통과 병인의 중요한 중재자인 나노 크기의 외막 소포(OMV)를 분비합니다. 숙주 세포에 의한 OMV 흡수는 운반된 PAMP를 통해 TLR 신호를 활성화합니다. 중요한 상주 면역 세포인 폐포 대식세포는 흡입된 미생물 및 입자에 대한 첫 번째 방어선을 구성하는 공기 조직 경계면에 위치합니다. 현재까지 폐포 대식세포와 병원성 박테리아의 OMV 사이의 상호 작용에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. OMV에 대한 면역 반응과 기본 메커니즘은 아직 파악하기 어렵습니다. 여기에서 우리는 박테리아 소포(Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Streptococcus pneumoniae)에 대한 1차 인간 대식세포의 반응을 조사하고 테스트된 모든 소포에서 비슷한 NF-κB 활성화를 관찰했습니다. 대조적으로, 우리는 Klebsiella, E.coli 및 Salmonella OMV에 대해서만 인플루엔자 A 바이러스 복제를 차단하는 장기간의 STAT1 인산화 및 강력한 Mx1 유도를 통한 차등 유형 I IFN 신호 전달을 설명합니다. OMV에 의한 항바이러스 효과는 내독소가 없는 Clear coli OMV와 Polymyxin 처리 OMV의 경우 덜 두드러졌습니다. LPS 자극은 이러한 항바이러스 상태를 모방할 수 없는 반면 TRIF 녹아웃은 이를 폐지했습니다. 중요하게도, OMV로 처리된 대식세포의 상등액은 폐포 상피 세포(AEC)에서 항바이러스 반응을 유도했는데, 이는 OMV로 유도된 세포간 의사소통을 암시합니다. 마지막으로, 일차 인간 폐 조직을 이용한 생체 외 감염 모델에서 결과가 검증되었습니다. 결론적으로 Klebsiella, E.coli 및 Salmonella OMV는 TLR{11}}TRIF 신호를 통해 대식세포에서 항바이러스 면역을 유도하여 대식세포, AEC 및 폐 조직에서 바이러스 복제를 감소시킵니다. 이러한 그람 음성 박테리아는 OMV를 통해 폐에 항바이러스 면역을 유도하며, 이는 박테리아 및 바이러스 동시 감염 결과에 잠재적으로 결정적이고 엄청난 영향을 미칩니다.
시스탄체 식물의 면역 체계 증가
키워드
세포외소포, 외막소포, 세균 및 바이러스 동시감염, 폐렴, 대식세포, 폐포상피세포, 항바이러스 선천면역
소개
외막 소포(OMV)는 직경이 최대 300 nm에 달하는 그람 음성 박테리아에 의해 자연적으로 방출됩니다. 그람 양성 박테리아는 막 소포(MV)를 똑같이 방출할 수 있습니다. 생물 발생의 결과로 이러한 지질 이중층 막 구조는 주변 세포질 내용물 외에도 지질, 단백질, 그리고 그람 음성 박테리아의 경우 지질다당류(LPS)와 같은 박테리아(외부) 막의 주요 구성 요소를 포함합니다. [1]. 박테리아 의사소통에서의 역할 외에도 OMV는 병원성 효과 및 독성 인자(예: 헬리코박터 파일로리의 VacA, 이질균의 시가 독소 또는 장출혈성 대장균의 ClyA)의 수송과 관련되어 있습니다[2]. 이러한 OMV는 상피 세포와 면역 반응을 조작하는 것으로 나타났습니다. OMV 표면에 박테리아 내독소가 존재하면 다른 운반된 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)과 함께 면역 세포에 대한 강력한 자극제가 됩니다. 이는 여전히 해당 수용체에 의해 인식될 수 있기 때문입니다[3]. 선천성 면역 세포에서 Tolllike 수용체(TLR)와 Nod 유사 수용체의 결합은 호중구 동원 또는 상피 세포층의 밀착 연접 파괴를 포함하여 염증 유발 및 면역 조절 사이토카인의 방출을 유발할 수 있습니다[4]. 폐에 존재하는 중요한 상주 면역 세포 유형 중 하나는 폐포의 공기 조직 경계면에 존재하는 폐포 대식세포(AM)입니다. 흡입된 입자의 섭취를 통해 AM은 식세포작용과 분해를 통해 미생물과 입자에 대한 첫 번째 방어선을 나타냅니다. 병원체가 발견되면 대식세포는 적응 면역 세포에 항원을 제시하고 염증성 사이토카인을 방출합니다. 이로써 이들은 I형 및 II형 폐포 상피 세포(AEC) 및 기타 면역 세포에 작용할 수 있습니다(추가 파일 1: 그림 S1A). AM은 여러 PAMP에 의해 활성화되어 다양한 면역 수용체를 통해 세포 내 신호 전달 및 별개의 유전자 발현 패턴을 유도할 수 있으며[5, 6], 이는 MyD88 또는 TRIF 신호 전달로 이어지며, 두 신호 모두 서로 다른 유전자 하위 집합을 유도합니다(추가 파일 1 : 그림 S1B). 더욱이, 이들은 폐 항상성 및 발병기전의 다른 기능을 수행하여 폐 면역의 중앙 신호 허브 및 조정자가 됩니다. 인플루엔자 바이러스는 Orthomyxoviridae 계열에 속하며 경증에서 중증까지 상부 및 하부 호흡기 감염을 유발합니다. 대부분의 계절성 인플루엔자 바이러스 감염은 저절로 낫지만, 일부 환자에서는 폐렴과 급성 호흡 곤란 증후군이 발생하여 전 세계적으로 연간 최대 650명000이 사망하는 것으로 추정됩니다[7]. 인플루엔자 A 바이러스(IAV)는 주로 기도 상피 세포를 감염시키고 그 안에서 복제됩니다. 바이러스 감염은 패턴 인식 수용체(PRR) 활성화 및 여러 전사 인자, 즉 핵 인자 카파 B(NF-κB) 및 인터페론 조절 인자(IRF)-3/7을 통한 신호 전달로 이어지며, 이는 유형 I 및 III을 유도합니다. 인터페론(IFN) 생산. 이러한 두드러진 IFN 반응은 결과적으로 자가분비 및 측분비 방식으로 세포의 "항바이러스 상태"를 유도합니다[8]. 또한 감염 시 여러 가지 다른 사이토카인과 케모카인이 분비됩니다. 엄격하게 조절되는 이 숙주 방어 사이토카인 네트워크는 감염 부위에 면역 세포 집단을 모집하고 선천적 및 적응적 면역 반응을 조율합니다[9]. 그러나 IAV는 또한 AM을 감염시킬 수 있으므로 급성 감염 중에 AM의 수가 급격히 줄어들므로 감염을 해결하기 위해 재설정이 필요합니다. 선천성 면역 세포의 활성화와 전염증성 사이토카인의 분비는 추가적인 선천성 세포의 모집을 유도하여 감염을 제어하고 조직 복구를 시작합니다[10, 11]. 여기에서는 박테리아 세포외 소포에 대한 대식세포의 반응과 후속 IAV 감염에 미치는 영향을 분석합니다.
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재료 및 방법
화학물질 및 항체
Ham's F12 배지는 GE Healthcare Europe(Freiburg, Germany)에서 구입했습니다. RPMI-1640, DMEM, GlutaMAX, Penicillin/Streptomycin 및 FCS는 Life Technologies(Darmstadt, Germany)에서 구입했습니다. PBS는 Capricorn Scientific GmbH(독일 Ebsdorfergrund)에서 인수되었습니다. Opti-MEM은 Thermo Fisher Scientific(독일 프랑크푸르트)에서 구입했습니다. Phorbol 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)는 Sigma-Aldrich Chemie(독일 뮌헨)에서 공급되었습니다. LPS (Salmonella Minnesota R595, TLR 등급)는 Enzo Life Sciences (Lausen, Switzerland)에서 구입했습니다. Pam3CSK4는 Invivogen(San Diego, USA)에서 구입했습니다. JAK 억제제 Ruxolitinib은 Biozol Diagnostics Vertrieb GmbH(Eching, Germany)에서 구입했습니다. Polymyxin B는 Merck Millipore(Billerica, USA)에서 구입했습니다. 항체는 Abcam(Cambridge, UK)에서 얻었습니다: Mx1(ab95926), 인플루엔자 핵단백질(9G8); 세포 신호 전달(영국 케임브리지): phospho-IRF-3(Ser396)(4D4G), phospho-TBK-1(Ser172)(D52C2), TBK-1(61223S), phospho- STAT1(Tyr)(58D6), STAT1(D1K9Y), 마우스 항토끼(L27A9), IRAK-1(4359S), phospho-p38(Tr180/Tyr182)(9211S), p38(9212S); Thermo Fisher Scientific: 염소 항생쥐(488의 경우 Alexa); ProteinTech: 항-IRF-3(66670-1) 또는 Santa Cruz Biotechnology(독일 하이델베르크): -actin(C4), 항-마우스(mIgGκBPHRP, sc-516102). 다른 모든 적용 화학 물질은 분석 등급이었으며 상업적 소스에서 구입했습니다.
세균 배양 및 OMV/MV 준비
L. 뉴모필라(L. pneumophila) 균주 Corby 야생형은 이전에 설명한 대로 처리되었습니다[12]. K. pneumoniae(#700721/MGH78578), E.coli(#25922), S. enterica serovar Typhimurium(#14028)은 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 입수했습니다. ClearColi™ BL21은 BioCat GmbH(독일 하이델베르그)에서 생산되었습니다. S. pneumoniae D39 Δcps는 Sven Hammerschmidt가 친절하게 제공했습니다. 박테리아를 한천 플레이트(MacConkey: Kp, Ec, Sal; LB: 투명 대장균; 혈액 한천 플레이트: Sp)에서 밤새 성장시킨 후 액체 배지(LB: Kp, Ec, Sal, Clear coli; THY: Sp)를 접종하는 데 사용했습니다. . 박테리아는 지속적인 흔들림(MaxQ 6000, Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Germany; Sp 제외) 하에서 37도에서 후기 대수 단계까지 성장했습니다. 그런 다음 박테리아 배양물을 3회 회전시켰습니다(4,500xg, 15분, 4도; Multifuge X3R, Thermo Fisher Scientific). 나머지 박테리아는 0.22μm 구멍을 통한 멸균 여과로 제거되었습니다. 상등액을 100 kDa 분자량 차단 필터(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)로 농축하고 소포를 초원심분리 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 정제했습니다. 초원심분리를 위해, 상등액을 100,000×g, 3시간, 4도에서 초원심분리하였다. 얻은 OMV/MV 펠릿을 멸균 PBS로 세척한 후 초원심분리를 반복하고 소포 펠렛을 멸균 PBS에 용해시켰다. 단백질 함량은 제조사의 지침(Thermo Fisher Scientific)에 따라 Pierce BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였고, 자극 실험에는 동일한 양의 단백질을 사용했습니다. SEC의 경우 상등액을 500μL로 농축하고 원래/70nm Gen 2 컬럼(IZON Science LTD, Lyon, France)에 로드하고 제조업체의 프로토콜에 따라 10mL PBS로 사전 세척했습니다. 멸균 PBS를 사용하여 소포를 용출하고 500 μL의 분획을 수집했습니다. 소포는 나노 유동 세포 계측법 (nFCM, NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK)에 의해 결정된 분획 7-12에서 용출되었습니다. 풀링된 소포 함유 분획은 분자량 차단 필터(Merck KGaA)를 사용하여 200-400 μL로 농축되었습니다. 모든 제제의 소포 농도는 nFCM에 의해 결정되었으며 동일한 양의 소포가 자극 실험에 사용되었습니다. 두 가지 정제 방법의 OMV/MV 제조는 -20도에서 분취하여 플레이팅하고 보관하여 박테리아 오염 여부를 확인했습니다.
NFC (영어)
nFCM의 경우, 488 nm 레이저가 장착된 나노 분석기(NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK)는 정의된 농도의 200 nm 폴리스티렌 비드(NanoFCM Co.)로 보정되었습니다. 2.08×10^8 입자/ml이며 입자 농도에 대한 기준으로도 사용됩니다. 또한, 4가지 다른 크기의 단분산 실리카 비드(NanoFCM Co.)를 소포의 크기를 보정하기 위한 크기 참조 표준으로 사용했습니다. 새로 필터링된(0.1μm) 1xPBS를 배경 신호로 분석하고 다른 측정값에서 뺍니다. 각 분포 히스토그램 또는 도트 플롯은 1kPa의 샘플 압력으로 1분간 수집된 데이터에서 파생되었습니다. OMV 샘플을 필터링된(0.1 µm) 1x PBS로 희석하여 입자 수가 최적 범위인 2,500–12,000 이벤트로 생성되었습니다. nFCM 소프트웨어(NF Profession V1.08)를 사용하여 입자 농도 및 크기 분포를 계산했습니다.
투과전자현미경(TEM)
탄소 코팅된 구리 그리드(400 메쉬)는 글로우 방전(PELCO easiGlow, Ted Pella, USA)에 의해 친수화되었습니다. 5 μL의 샘플을 친수화된 그리드에 적용하고 이중 증류수로 짧은 세척 단계를 거친 후 2%(w/v) 우라닐 아세테이트로 염색했습니다. 샘플은 120 kV의 가속 전압을 사용하는 JEOL JEM-2100 투과 전자 현미경으로 분석되었습니다. 이미지는 F214 FastScan CCD 카메라(TVIPS, Gauting, Germany)를 사용하여 획득했습니다.
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세포 배양
인간 세포주(THP-1, A549, BEAS2B, Calu-3, HCC827)는 American Type Culture Collection에서 입수했습니다. Madin-Darby Canine Kidney II 세포(MDCK II)는 ECACC-Sigma-Aldrich(Darmstadt, Germany)에서 구입했습니다. THP-1 Dual™(듀얼) 및 THP-1 Dual™ TRIF-KO(TRIF-/-) 셀은 Invivogen Europe(프랑스 툴루즈)에서 구입했습니다. 세포 배양 조건에서 1mM 피루브산나트륨, 2mM 글루타민 및 10% 열불활성화 FCS가 보충된 Ham's F12, DMEM 또는 RPMI-1640에서 세포를 배양했습니다. THP-1 Dual™ 세포를 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 10% 열 불활성화 FCS, 100μg/mL Normocin™ 및 25mM HEPES 완충액이 보충된 RPMI-1640에서 배양했습니다. THP-1, Dual 및 TRIF-/- 세포는 24시간 동안 20nM PMA를 첨가하여 대식세포 유사 세포에서 분화되었습니다.
Mx1을 SparQ 벡터로 클로닝
Mx1의 코딩 서열은 제조업체의 지침에 따라 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs, Ipswich, USA)를 사용하여 Phusion PCR을 통해 THP-1 cDNA로부터 생성되었습니다. HA 코딩 서열을 역방향 프라이머(센스: 5'-atcggaTTCGAAATGGTTGTT TCCGAAGTGGGAC-3', 안티센스: 5'-tccgatGCGGCC GCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAA CCGGGGAACTGGGCAAG-3')에 융합시켜 HAtag를 추가했습니다. PCR 단편과 SparQ 벡터(Addgene, Watertown, USA)를 BstbI 및 NotI 제한 효소(Thermo Fisher Scientific)로 분해하고 T4 DNA Ligase(New England Biolabs)를 사용하여 SparQ 벡터에 결찰시켰습니다.
HEK293T 세포의 형질감염 및 렌티바이러스 생산
HEK293T 세포를 Mx1 및 GFP 서열에 대한 서열, 바이러스 패키징 벡터 psPAX2 및 Lipofectamine 2000(Thermo)을 포함하는 외피 플라스미드 pVSV-G(Addgene)를 포함하는 Opti-MEM에 희석된 SparQ 벡터로 형질감염시켰습니다. Fisher Scientific) 제조업체의 프로토콜에 따라. 렌티바이러스가 생산되었고 바이러스가 포함된 상등액을 72시간 동안 매일 수집했습니다. 0.45 µm 필터를 사용하여 상층액을 여과하고 THP{10}} 세포를 형질도입했습니다(아래 참조). Mx1 서열이 없는 빈 SparQ 벡터를 세포 형질도입에 사용하여 해당 대조 세포주(VC{12}}벡터 대조)를 생성했습니다.
THP-1 세포의 형질도입
THP{0}} 세포는 HEK293T 세포 배양의 여과된 상등액으로부터 렌티바이러스로 형질도입되었습니다(위 참조). 형질도입 효능을 향상시키기 위해 폴리브렌(4μg/mL, Sigma-Aldrich)을 첨가했습니다. 세포를 최대 6일 동안 배양했습니다. GFP 양성 세포를 유세포 분석법으로 분류했습니다.
BDM의 분리 및 차별화
건강한 공여자로부터의 인간 단핵구는 말초 혈액 단핵 세포로부터 자기 CD14 양성 선택에 의해 분리되었고, 이전에 기술된 바와 같이 1% 인간 AB혈청의 존재 하에 혈액 유래 대식세포(BDM)로 분화되었습니다[13].
대식세포의 OMV/MV 자극
일차 인간 대식세포 또는 분화된 THP{0}} 세포를 정제된 OMV/MV(초원심분리를 통해 정제된 소포의 경우 각각 1μg/mL, SEC 정제의 경우 MOV(다중수체) 1,000)와 함께 배양했습니다. 소포) 완전 배지에서 최대 20시간 동안. 소포 처리 1시간 전에 추가 억제제 적용을 수행했습니다. Te-자극된 대식세포는 단백질 또는 RNA 분리 또는 후속 감염 실험에 사용되었습니다. 얻은 사이토카인 함유 상등액을 ELISA 또는 LDH 분석에 사용하거나 멸균 여과하여 상피세포 자극에 사용하였다.
바이러스 정제 및 바이러스 적정
바이러스 정제 및 바이러스 적정은 이전에 설명한 대로 MDCK II 세포에서 수행되었습니다[14]. 바이러스 역가는 이전에 설명한 대로 플라크 분석으로 측정했습니다[15]. 간략하게, 융합성 MDCK II 세포를 연속 희석된 바이러스 또는 조직 상청액(FCS가 없는 MDCK II 배양 배지 내)으로 감염시켰다. 바이러스를 37도에서 1시간 동안 세포에 흡착시켰습니다. 10, 접종물을 새로운 배지(1 ug/mL TPCK 처리 트립신(IAV용) 및 1% Avicel® PH-101(Sigma-Aldrich)이 보충됨)으로 교체했습니다. MDCK II 세포는 크리스탈 바이올렛으로 염색되거나 바이러스에 감염된 세포는 1차 항체(1:2,000)(마우스 항인플루엔자 A 핵단백질, MCA400, Bio-Rad, 독일) 및 2차 항체( 1:4,000) (Goat Anti-Mouse IgGHRP, 170–6516, Bio-Rad, Germany)(플라크 분석용). 플라크는 수동으로 계산되었으며 mL당 플라크 형성 단위(pfu)로 표시되었습니다.
남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능
바이러스 감염
박테리아 소포 또는 사이토카인 함유 상등액으로 20시간 사전 자극한 후 세포를 IAV 또는 수포성 구내염 바이러스(VSV)로 감염시켰습니다. 대식세포는 H1N1(A/WSN/33) 또는 VSV에 감염된 반면, 상피 세포는 FCS가 없는 신선한 배지에서 H1N1(A/Hamburg/2009/PDM)에 감염되었습니다. 접종 1시간 후, 유리 바이러스를 제거하고 배지를 IAV용 TPCK-트립신 함유 배지 또는 VSV용 빈 배지로 교체했습니다. 다중 고리 복제가 가능하도록 세포를 최대 48시간 동안 배양했습니다.
인간 PCLS의 준비
폐 조직은 하노버 의과대학(MHH, 독일 하노버)에서 폐암으로 인해 엽 절제술을 받은 환자로부터 획득했습니다. 거시적 및 현미경적으로 질병이 없는 폐 부분의 조직만 실험에 사용되었습니다. 인간 정밀 절단 폐 절편(PCLS)은 이전에 설명한 대로 준비되었습니다[16]. 웰당 2개의 조직 슬라이스를 37도, 5% CO2의 침수 조건(1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12) 하에서 24-웰 플레이트에서 밤새 배양했습니다.
PCLS의 IAV 감염
PCLS는 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12에 희석된 L. pneumophila 또는 K. pneumoniae에서 정제된 OMV 1μg/mL로 37도, 5% CO2에서 20시간 동안 자극되었습니다. 배지를 제거하고 PCLS에 인플루엔자 바이러스 A/California/04/2009(H1N1pdm) 250μL에 25,000pfu/웰을 접종했습니다. PCLS를 35도에서 배양하고 접종 중에 15분마다 흔들어 균일한 바이러스 감염을 가능하게 했습니다. 그 후, 접종물을 버리고 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12로 대체했습니다. 48시간 동안 배양한 후, 바이러스 검출, LDH 방출 및 사이토카인 정량을 위해 상층액을 수집했습니다. 사이토카인 측정을 위한 샘플에는 0.2% 프로테아제 억제제 칵테일(P1860, Sigma-Aldrich, Germany, Germany)을 보충하고 분석할 때까지 80도에 보관했습니다. PCLS는 이전에 설명한 대로 RNA 정제 때까지 냉동하고 80도에서 보관했습니다[17].
LDH (LDH)
LDH 방출 분석은 Roche(독일 만하임)에서 구입한 Pierce™ LDH 세포독성 분석 키트 또는 CytotoxicityDetection KitPLUS(LDH)(Roche, Merck)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더인 Infinite F200Pro(Tecan, Männedorf, Switzerland)를 사용하여 측정되었습니다.
엘리사
사이토카인 CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10 및 IL-1은 제조업체의 지침에 따라 시판되는 ELISA 키트(R&D Systems, Wiesbaden, Germany)를 사용하여 무세포 상층액에서 정량화되었습니다. 지침.
QUANTI‑blue™ 분석
THP-1 Dual™ 및 해당 TRIF-/- 세포의 세포 배양 상청액에서 SEAP의 리포터 활성을 확인하기 위해 QUANTI-Blue™ 분석을 제조업체의 프로토콜에 따라 수행했습니다. 간략하게, OMV로 세포를 자극한 후 세포 배양 상층액을 수집했습니다. 먼저, QUANTI-Blue™ 용액과 세포 배양 상청액을 지방 바닥 96-웰 플레이트에 분주했습니다. 37도에서 150분 동안 인큐베이션한 후, 630nm에서의 광학 밀도를 마이크로플레이트 리더인 인피니티 F200Pro에서 측정했습니다.
QUANTI‑luc™ 분석
THP{0}} Dual™ 및 해당 TRIF-/- 세포의 세포 배양 상등액에서 Lucia 루시퍼라제의 리포터 활성을 확인하기 위해 QUANTI-Luc™ 분석을 제조업체의 프로토콜에 따라 수행했습니다. 간략하게, 세포 배양 상청액을 백색 지방 바닥 96- 웰 플레이트(BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Germany)에 분배했습니다. QUANTI-Luc™ 분석 용액을 첨가하고 마이크로플레이트 리더인 Infinite F200Pro에서 0.1초의 판독 시간으로 발광 측정을 즉시 수행했습니다.
웨스턴 블롯
단백질 발현 또는 인산화를 측정하기 위해 Western Blot을 이전에 설명한 대로 수행했습니다 [18].
RNA 준비 및 실시간 PCR
유전자 발현 분석을 위해 페놀-클로로포름 추출을 통해 RNA 분리를 수행하고 이전에 설명한 대로 역전사했습니다[12]. 그런 다음 Luna Universal qPCR Master Mix(New England BioLabs) 및 특정 프라이머 쌍을 사용하여 ViiA7(Thermo Fisher Scientific)에서 정량적 실시간 PCR을 수행했습니다. 2-ΔΔCT 방법[19]을 사용하여 x배 유도를 계산하고 결과를 해당 대조 세포에 대해 정규화했습니다. 18S: 정방향: 5′-GACTCTTTCGAGGCCCTGTA-3′, 개정: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3′ CXCL8: 정방향: 5′-ACTGAGAGTGATTGAGAG TGGAC-3′, 개정: 5′-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC{ {20}}' IFI44: fwd: 5'-TATCCAGACAGAGCAGCTACC-3', 개정: 5'-ATAGAGAAGGCTAAGCCGCTTC-3' IFIT1: fwd: 5'-ATGCAGGAAGAACATGACAACC-3', 개정: 5 ′-TCTGGACACTCCATTCTATAGCG-3′ IFNA1: fwd: 5′-ACAGGAGGACCTTGATGCTC-3′, 개정: 5′-TCTGCTGGATCATCAGCTCATGG-3′ IFNB: fwd: 5′-AACATGACCAACAAGTGTCTCC-3′ , 개정: 5′-TGTCCTTGAGGCAGTATTCAAG-3′ IL1B: 정방향: 5′-AGCTCGCCAGTGAAATGATGG-3′, 개정: 5′-CAGGTCCTGGAAGGAGCACTTC-3′ IL12B: 정방향: 5′-GCCCAGAGCAAGATGTGTCA{{ 58}}', 개정: 5'-CACCATTTCTCCAGGGGCAT-3' Mx1: fwd: 5'-GGGCTTTGGAATTCTGTGGC-3', 개정: 5'-CCTTGGAATGGTGGCTGGAT-3' NP: fwd: 5' -GAAATTTCAAACAGCTGCACAAAG -3′, 개정: 5′-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3′ RPS18: 정방향: 5'-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′, 개정: 5′-GATCACACGTTCCACCTCATC-3′
면역형광
THP{{0}} 세포는 20 nM PMA를 첨가하여 커버슬립에서 분화되었고 20시간 동안 OMV/MV와 함께 배양되었습니다. 이어서 세포를 H1N1(A/WSN/33; 감염 다중도(MOI) 0.1)에 4시간 동안 감염시켰다. 3% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정시킨 후, 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고 TBS 중 0.2% 트리톤 X-100로 투과화시켰습니다(10분, 실온). 차단(TBS 중 1% BSA/0.2% 트리톤 X-100) 후, 세포를 -NP 항체(1:250, 차단 용액 중)와 함께 배양했습니다. DAPI(1:2000)와 함께 2차 항체(1:1000)를 어둠 속에서 1시간 동안 배양했습니다. 장착된 커버슬립을 형광 현미경(AxioVision, Zeiss, Jena, Germany)으로 분석했습니다.
윤리적 성명
인간 폐 조직 절편을 사용한 실험은 하노버 의과대학 윤리 위원회(독일 하노버 MHH)의 승인을 받았으며 세계 의학 협회 윤리 강령(번호 2701-2015)을 준수합니다. 모든 환자 또는 가까운 친척은 연구를 위한 폐 조직 사용에 대해 서면 동의를 받았습니다. 모든 헌혈자는 사전 서면 동의를 받았습니다(윤리 승인 번호: 161/17).
그림 1. 인간 대식세포의 세균 소포와 반응의 특성. A 다양한 박테리아 상등액(Legionella pneumophila(Lp), Klebsiella pneumoniae(Kp), Escherichia coli(Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium(Sal) 및 Streptococcus pneumoniae(Sp))에서 크기 배제 크로마토그래피를 통해 유리 단백질에서 박테리아 세포외 소포를 분리합니다. ). 각 분획의 소포 농도는 nFCM(nano-flow cytometry)으로 측정하고 단백질은 BCA로 정량화했습니다. B 정제된 OMV/MV의 소포 크기 분포는 NFC에 의해 결정되었습니다. 정제된 OMV/MV의 C TEM 이미지. 스케일 바=50 nm. D-G BDM은 다른 박테리아의 OMV/MV(각각 1μg/mL)로 자극되거나 최대 48시간 동안 대조를 위해 처리되지 않은 상태로 두었습니다. D CXCL8 방출은 ELISA로 결정되었으며 ng/mL로 표시됩니다. IL1B(E) 및 IL12B(F)의 발현은 qPCR에 의해 결정되었으며, 결과는 RPS18에 대해 표준화되었으며 처리되지 않은 대조군 세포에 대해 묘사됩니다. G 세균 소포와 함께 1시간 배양한 후, IRAK-1, p38 및 TBK-1의 발현 및 인산화를 웨스턴 블롯으로 결정했습니다. 4개의 생물학적 독립적 복제의 대표적인 결과가 표시됩니다. 막대는 3개(B)에서 4개(D-F)의 독립적인 실험의 평균값 + SEM을 나타냅니다. 통계: 2-방향 ANOVA(DF); *피<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; ns=not significant; n=3–4
통계
데이터는 적어도 세 번의 생물학적으로 독립적인 실험에 대한 평균값 + SEM으로 표시됩니다. Prism 6.07(GraphPad, La Jolla, USA)을 사용했습니다. 짝을 이루지 않은 샘플에 대해 단방향 또는 양방향 ANOVA 테스트를 수행했습니다. 0.05 이하의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 달리 표시되지 않은 경우 해당 대조군(*)에 대해 테스트를 수행했습니다.
데이터 및 자료의 가용성
이 연구 중에 생성되거나 분석된 모든 데이터는 이 기사와 해당 보충 파일에 포함되어 있습니다.
결과
OMV/MV에 의한 대식세포의 전염증성 활성화
다양한 박테리아의 OMV/MV에 대한 인간 1차 혈액 유래 대식세포(BDM)의 선천적 면역 반응을 테스트하기 위해 Legionella pneumophila(Lp), Klebsiella pneumoniae(Kp), Escherichia coli(Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium(Sal)의 소포 ) 및 폐렴구균(Sp)을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 분리했습니다. 나노 유동 세포 계측법 (nFCM)에 의해 소포 수와 BCA에 의해 단백질의 존재에 대해 분획을 분석했습니다 (그림 1A). 분획 7-12의 소포를 모아서 실험에 사용했습니다. OMV/MV는 비슷한 크기 분포 프로파일을 갖고(그림 1B), 평균 크기가 다르지 않았으며(추가 파일 1: 그림 S2A), 동일하게 집중되었으며(추가 파일 1: 그림 S2B) 전송 전자로 시각화되었습니다. 현미경 (TEM; 그림 1C). BDM은 다양한 박테리아의 동일한 소포 농도에 해당하는 최대 48시간 동안 OMV/MV로 자극되었습니다(추가 파일 1: 그림 S2C). 소포와 BDM의 배양은 세포독성이 없었습니다(추가 파일 1: 그림 S2D). OMV/MV는 대식세포로부터 CXCL8 발현 및 방출을 광범위하게 유도한 반면(추가 파일 1: 그림 S3A 및 1D), IL1B 및 IL12B mRNA 유도는 시간과 종에 따라 달라졌습니다(그림 1E+F). IL-1의 방출은 박테리아 소포가 분리된 종에 따라 달라졌습니다(추가 파일 1: 그림 S3B). p38의 인산화는 1시간의 소포 배양 후 BDM에서 비슷했지만, 그람 음성 박테리아에 의한 IRAK-1 분해 및 TBK-1의 인산화에서 나온 OMV만 나타났고 그람 양성에서 나온 MV에서는 그렇지 않았습니다(그림 1G 및 추가 파일 1: S4A-D).
그림 2 박테리아 세포밖 소포체는 BDM에서 I형 인터페론 반응을 활성화합니다. BDM은 다른 박테리아의 OMV/MV(각각 1μg/mL)로 자극되거나 대조군으로 처리되지 않은 상태로 두었습니다. IRF-3의 인산화 및 발현은 OMV/MV 배양 1시간 후에 웨스턴 블롯으로 결정되었습니다. 3개의 생물학적으로 독립적인 복제의 대표적인 결과가 표시됩니다. IFNA1(B), IFNB(C), IFIT1(E) 및 IFI44(F)의 발현은 qPCR로 측정되었으며 결과는 RPS18에 대해 정규화되었으며 처리되지 않은 대조군 세포에 대해 표시됩니다. D STAT1의 인산화는 OMV/MV 자극 2시간 후 웨스턴 블롯에 의해 결정되었습니다. 4개의 생물학적 독립적 복제의 대표적인 결과가 표시됩니다. G STAT1의 인산화 및 Mx1의 발현은 세균 소포 자극 20시간 후 웨스턴 블롯에 의해 결정되었습니다. 4개의 생물학적 독립적 복제의 대표적인 결과가 표시됩니다. 막대는 4개의 독립적인 실험의 평균값 + SEM을 나타냅니다. 통계: 2-방향 ANOVA; *피<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=4
NF-κB 및 AP-1 및 해당 다운스트림 표적의 활성화 외에도 PRR 신호 전달은 IRF의 활성화로 이어질 수 있습니다. 따라서 IRF-3의 인산화가 결정되었습니다. Kp/Ec/SalOMVs는 BDM에서 IRF-3의 인산화를 증가시켰으며(그림 2A), 결과적으로 IFN I의 발현(그림 2B+C), STAT1의 하류 인산화(그림 2D 및 추가 파일 1: S4E) 및 인터페론 자극 유전자(ISG, IFIT1, IFI44 및 Mx1, 그림 2E-G)의 유도. 인산화 사건은 일반적으로 수명이 짧고 면역 신호 전달 계통을 켜고 끄는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로 STAT1의 인산화는 Kp/Ec/SalOMV를 추가한 지 20시간 후에 조사되었습니다(그림 2G 및 추가 파일 1: S4F+G). 실험은 OMV가 대식세포에서 전염증성 신호전달을 활성화할 뿐만 아니라 항바이러스 신호전달도 유도한다는 것을 보여주었습니다.
OMV 사전 배양은 대식세포의 IAV 복제를 변경합니다
Mx1은 IAV 복제를 억제하는 잘 알려진 항바이러스 인자이며[20], 이는 대식세포의 Kp/Ec/SalOMV 처리 시 발현됩니다. 따라서 우리는 OMV 전처리가 바이러스 복제를 변경한다는 가설을 세웠습니다. IAV 감염 실험은 mRNA 및 단백질 수준에서 Kp/Ec/SalOMV 처리 시 유사한 수준의 Mx1을 발현하고(추가 파일 1: 그림 S5A+B) STAT1의 인산화를 유도하는 THP-1 세포에서 설정되었습니다. 전체 STAT1 단백질은 안정적으로 유지되지만(추가 파일 1: 그림 S5C), H1N1 균주(A/WSN/33)는 대식세포에서 감염되고 복제됩니다[21]. LpOMV/SpMV로 THP-1 세포를 사전 자극하면 감염된 대조군(--)에 비해 감염 후 24시간(pi)에 IAV 복제가 증가한 반면, Mx1- 유도 OMV(Kp)로 사전 처리하면 /Ec/Sal)은 IAV 복제를 차단했습니다(그림 3A). TLR2/1 작용제 Pam3CSK4 전처리는 TLR2/1을 통해 신호를 보내는 것으로 알려진 LpOMV/SpMV에서 관찰된 효과를 모방할 수 있었지만[12, 22, 23], TLR4 작용제인 가용성 LPS는 Kp/Ec를 재현하지 못했습니다. /SalOMV 효과(추가 파일 1: 그림 S5D). 전처리 후 IAV 부하의 차이는 바이러스 핵단백질(NP)에 대한 면역형광 염색을 통해 관찰할 수도 있습니다(그림 3B). Kp/Ec/SalOMV 전처리는 IAV 복제를 차단했으며 NP 양성 영역은 크게 감소했습니다(그림 3C). 이는 LpOMV/SpMV 전처리 후에는 관찰할 수 없습니다. 관찰된 차단된 IAV 복제에 대해 Mx1 유도가 충분한지 조사하기 위해 Mx1은 OMV 사전 자극을 모방하기 위해 THP-1 대식세포에서 안정적으로 과발현(성별)되었습니다(추가 파일 1: 그림 S5E). Mx1oex 세포의 IAV 감염은 빈 벡터 제어(VC)(그림 3E)와 비교하여 면역형광 NP 양성 영역 4시간 pi(그림 3D)와 바이러스 복제 6시간 pi 감소를 가져왔습니다(그림 3E). OMV 사전 자극과 비교한 정도입니다(그림 3A). 결론적으로, Kp/Ec/SalOMV는 고전적인 염증 유발 방식으로 대식세포를 활성화하고 항바이러스 유전자를 유도하여 IFN-/수용체(IFNAR)의 활성화, STAT1의 하류 인산화 및 Mx1의 발현을 유도하여 IAV 복제를 직접적으로 방해할 수 있습니다. 그림 4A). 관찰된 항바이러스 반응 유도에 대한 JAK/STAT 신호 전달의 중요성을 확인하기 위해 소포 자극 전에 JAK 억제제(JAKi)를 적용했습니다. JAK 억제는 Kp/SalOMV에 의해 유발된 CXCL8 발현을 변화시키지 않았지만(그림 4B), mRNA의 Mx1(그림 4C)과 IAV 감염 시에도 단백질 수준을 크게 감소시켰습니다(그림 4D 및 추가 파일 1: S6A). 따라서 JAKi는 OMV 유발 바이러스 복제 차단을 역전시켰습니다(그림 4E).
그림 3 Mx1-유도 OMV는 THP-1 세포에서 인플루엔자 A 바이러스 복제를 차단합니다. 분화된 THP-1 세포에서 인플루엔자 A 바이러스 복제. 세포를 OMV/MV(각각 1μg/mL)로 전처리하거나 대조군(-)을 위해 처리하지 않은 채로 두었습니다. 20시간 전처리 후, 세포를 A/WSN/33(H1N1)(MOI 0.001)에 24시간 및 48시간 동안 감염시켰습니다. IAV 복제는 18S로 표준화된 IAV-NP에 대한 qPCR에 의해 결정되었습니다. 3~5개의 독립적인 실험의 평균값±SEM이 표시됩니다. B 분화된 THP-1 세포를 OMV/MV(각각 1μg/mL)로 전처리하거나 대조군(-)에 대해 처리하지 않은 채로 두었습니다. 20시간 사전 배양 후, 세포를 A/WSN/33(H1N1)(MOI 0.1)로 4시간 동안 감염시켰습니다. 고정 후 세포를 α-인플루엔자 NP 항체(노란색)와 DAPI(파란색)로 염색했습니다. 4개의 생물학적 독립적 실험의 대표적인 결과가 표시됩니다. C (B)의 NP 양성(NP+) 영역 정량화. 막대는 4개의 독립적인 실험 + SEM의 평균값을 나타냅니다. Mx1(Mx1oex)을 안정적으로 과발현하는 D THP{31}} 세포와 빈 벡터 제어(VC) 세포를 인플루엔자 바이러스 A/WSN/33(H1N1)(MOI 0.1)에 4시간 동안 감염시켰습니다. 인플루엔자 NP로 고정 및 면역형광 염색 후, NP+ 영역을 정량화하고 VC 세포를 기준으로 표시합니다. 막대는 4개의 독립적인 실험 + SEM의 평균값을 보여줍니다. E Mx1oex 및 VC 세포를 A/WSN/33(H1N1)(MOI 0.001)로 6시간 동안 감염시켰습니다. 바이러스 복제는 플라크 분석에 의해 결정되었으며 결과는 mL당 플라크 형성 단위(pfu)로 표시됩니다. 막대는 4개의 독립적인 실험의 평균값 + SEM을 나타냅니다. 통계: 2-방향 ANOVA(A), 1-방향 ANOVA(C), 짝을 이루지 않은 t-검정(D+E); *피<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=3–5
OMV에 대한 항바이러스 반응은 TLR4‑TRIF에 따라 다릅니다.
관련된 PRR을 확인하기 위해 상업용 면역 작용제를 단독으로 적용하거나 LPS와 함께 적용하여 OMV를 모방했습니다. 그러나 KpOMV에서는 미러링된 Mx1 유도가 관찰되지 않았으며(추가 파일 1: 그림 S7), 이는 리간드 구성 또는 PRR에 대한 공간 제시로 인해 OMV에 의한 대식세포의 차등적이고 장기간 활성화가 있음을 시사합니다. 관련된 면역 수용체는 NF-κB- 및 IRF 신호 전달에 대해 THP{3}} 리포터 세포에 의해 추가로 평가되었습니다(그림 5A). KpOMV 처리 시 THP-1 세포는 Mx1 단백질의 발현이 상당히 증가한 것으로 나타났으며(그림 5B 및 추가 파일 1: S6B), 이는 TRIF 결핍(TRIF-/-) THP-1 세포에서 손실되었습니다(그림 5B 및 추가 파일 1: S6B). 그림 5B 및 추가 파일 1: S6B). IRF 리포터에서도 동일한 현상이 관찰되었으며(그림 5C), NF-κB 리포터 활성화 및 CXCL8 유도는 자극 시 THP-1 및 TRIF-/- 세포 모두에서 높았습니다(그림 5D+E). STAT 의존적 IFIT1, IFI44 및 Mx1 유전자 발현은 THP-1 리포터 세포에서 KpOMV 자극 시 유도되었지만(그림 5E), 동일하게 자극된 TRIF-/- 세포에서는 크게 감소했습니다(그림 5E). 사전 자극 후 추가 IAV 감염으로 인해 바이러스 복제가 감소한 반면 TRIF 삭제는 IAV 복제를 구출했습니다 (그림 5F). KpOMV가 대식세포에서 일반적인 항바이러스 반응을 유도하는지 여부를 조사하기 위해 세포를 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 감염시켰는데, 이는 대조 세포에서는 복제되었지만 KpOMV 전처리된 세포에서는 차단되었으며 TRIF 결실로도 구제될 수 있었습니다(그림 2). 5G). TLR4를 통한 LPS 인식은 세포내이입 및 TRIF 활성화에 필수적이므로 OMV 표면의 LPS는 리포펩티드 항생제인 Polymyxin B(PB)에 의해 중화되어 Mx1 유도가 50% 감소했습니다(그림 6A+B 및 추가 파일 1). : S6C), 그러나 NF-κB 의존성 CXCL8 전사에는 유의미한 차이가 없습니다 (그림 6C). KpOMV+PB 사전 자극 시 바이러스 복제가 기본 수준으로 복구되었습니다(그림 6D). PB에 의한 LPS 인식 억제가 Mx1을 완전히 차단하기에는 불충분했기 때문에 내독소가 없는 투명 대장균(Cc)의 OMV를 분리하여 사전 자극에 사용했습니다. Cc는 변경된 지질 A를 발현하며 활성화된 TLR4/MD2 복합체를 유도할 수 없습니다[24]. CcOMV는 Mx1을 유도하지 않았으며(그림 6A+B 및 추가 파일 1: S6C) 대식세포에서 IAV 복제를 감소시키지 않았습니다(그림 6D). 차등 초원심분리를 통해 세포외 소포를 분리하면 소포와 함께 오염물질(예: 단백질 또는 박테리아 세포 부속물)도 함께 분리된다는 것이 잘 알려져 있습니다. MISEV2018 지침[25]에 따라 한외여과(UF)와 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 조합을 통해 분리된 OMV를 사용하여 주요 실험을 반복했습니다. UF-SEC 정제된 KpOMV로 THP-1 리포터 세포를 자극하면 Mx1(추가 파일 1: 그림 S8A) 및 IRF 리포터(그림 S8B)가 유도되는 반면 TRIF-/- 대식세포에서는 손실됩니다( 추가 파일 1: 그림 S8A+B). IAV 복제는 KpOMV 전처리된 세포에서 차단되었으며 TRIF 삭제 시 구조되었습니다(추가 파일 1: 그림 S8C). NF-κB 리포터 활성은 세포의 TRIF 상태에 관계없이 KpOMV에 의해 유도되었습니다(추가 파일 1: 그림 S8D).
그림 4 JAK 신호 전달의 억제는 대식세포에서 인플루엔자 A 바이러스 복제를 구출합니다. OMV는 대식세포에서 TRIF-IRF 신호를 활성화하고, 이는 차례로 IFN-발현을 유도하고 후속 IFNAR 신호를 통해 방출됩니다. IFNAR은 JAK/STAT를 통해 신호를 보내고 ISG의 발현을 유도하며 그 중 하나는 Mx1입니다. 이로 인해 IAV 복제가 차단됩니다. B–E THP-1 세포를 10 μM JAK 억제제(JAKi)와 함께 1시간 동안 사전 배양한 후 2{{22 }} 시간. B-C CXCL8(B) 및 Mx1(C) 발현은 qPCR에 의해 결정되었으며 결과는 RPS18로 정규화되고 처리되지 않은 대조군과 비교하여 표시됩니다. 막대는 3~4개의 독립적인 실험+SEM의 평균값을 보여줍니다. D+E OMV 전처리된 세포를 IAV(MOI 0.001)로 추가로 감염시켰습니다. D 웨스턴 블롯은 감염 후 0~3시간(pi)에 Mx1 단백질 발현을 보여줍니다. E 바이러스 복제는 감염 24시간 후 플라크 분석에 의해 결정되었습니다. 막대는 4개의 독립적인 실험 + SEM의 평균값을 보여줍니다. 통계: 1-방향 ANOVA(B+C+E); *피<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; *compared to DMSO control, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=4
그림 5 OMV는 TRIF를 통해 대식세포에서 항바이러스 신호전달을 유도합니다. THP-1 이중 리포터 세포는 NF-κB 경로 활성화 후 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 발현을 유도하고, IRF 경로 활성화 시 루시아 루시퍼라제의 발현 및 분비를 유도합니다. 추가로, TRIF(회색 막대)를 분화시킨 후 -/- 세포로 자극하여 어댑터 분자 TRIF가 안정적으로 녹아웃되도록 했습니다. (BF) THP-1 리포터 세포(=이중; 검은색 막대) 및 TRIF−/− 세포 KpOMV(1 µg/mL)를 20시간 동안 사용하거나 대조군을 위해 처리하지 않은 채로 둡니다. 표시된 시간 후에 상층액, RNA 및/또는 단백질을 수집했습니다. B Mx1 단백질 발현의 대표적인 웨스턴 블롯 이미지. C+D Lucia 리포터 활성(C) 및 SEAP 리포터 활성(D)을 세포 배양 상층액에서 결정했습니다. 동일한 상등액을 사용하여 두 기자의 활동을 확인했습니다. E STAT- 및 NF-κB-의존 표적 유전자(위에서 아래로: IFIT1, IFI44, Mx1, CXCL8)에 대한 상대 mRNA 발현은 qPCR에 의해 결정되었으며 결과는 RPS18에 대해 정규화되었으며 자극되지 않은 이중 대조군을 기준으로 표시됩니다. 접기 변경 사항은 log2 변환되었습니다. 세포를 24시간(F) 동안 A/WSN/33(H1N1)(MOI 0.1) 또는 12시간(G) 동안 VSV(MOI 0.1)에 추가로 감염시켰습니다. 바이러스 복제는 플라크 분석에 의해 결정되었습니다. 막대는 4개(C–F) ~ 5개(G)의 독립적인 실험 + SEM의 평균값을 보여줍니다. 통계: 2-방향 ANOVA(C–G); *피<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to unstimulated Dual control, # as depicted in the graph; ns=not signifcant; n=4–5
그림 6 OMV에 의해 유도된 Mx1 발현은 LPS 억제 후 손실됩니다. THP-1 세포를 OMV(1 µg/mL; Kp 또는 Clear coli(Cc)) 단독으로 또는 20 µg/mL Polymyxin B(PB)와 함께 20시간 동안 배양하거나 처리하지 않은 채로 두었습니다. 통제를 위해. Mx1 단백질 발현은 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의해 결정되었습니다. 세 가지 생물학적으로 독립적인 실험의 대표적인 결과가 표시됩니다. Mx1 B 및 CXCL8 C 발현은 qPCR에 의해 결정되었습니다. 막대는 4개의 독립적인 실험 + SEM의 평균값을 보여줍니다. D THP-1 세포를 OMV(1μg/mL; Kp 또는 Cc) 단독으로 또는 20μg/mL PB와 함께 20시간 동안 배양하거나 대조군을 위해 처리하지 않고 방치한 다음 A/WSN/33으로 추가로 감염시켰습니다. (H1N1) (MOI 0.001). 바이러스 복제는 감염 24시간 후 플라크 분석에 의해 결정되었습니다. 막대는 4개의 독립적인 실험 + SEM의 평균값을 보여줍니다. 통계: 1-way ANOVA B–D; *피<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; *compared to control, #compared to KpOMV; ns=not significant; n=3–4
OMV의 IAV 복제 억제 효과는 AEC로 이전 가능
대식세포는 폐에서 IAV 복제를 위한 주요 세포 유형이 아니며 IFN I도 측분비 작용을 하기 때문에 AEC에 대한 IAV 복제 효과의 전달 가능성이 테스트되었습니다. 왜냐하면 대식세포와 달리 이들 세포는 OMV/MV에 직접 반응하지 않기 때문입니다. 추가 파일 1: 그림 S9). KpOMV 처리된 대식세포의 상등액(SN)은 LpOMV-SN(그림 7A)과 달리 A549 세포에서 Mx1을 유도한 반면, CXCL8은 둘 다 후에 유도되었습니다(그림 7B). KpOMVSN은 대식세포 실험 및 Mx1 유도 패턴과 일치하는 바이러스 복제를 감소시켰습니다(그림 7C). JAK/STAT 신호에 대한 관찰된 IAV 제한 효과의 의존성을 확인하기 위해 KpOMV-SN을 JAKi와 결합하여 KpOMV-SN 처리 시 Mx1 유도를 차단하고(그림 7A) IAV 복제를 복원했습니다(그림 7C). 폐에서 면역 과정의 복잡한 조절을 모방하기 위해 인간 정밀 절단 폐 조각(PCLS)의 생체 외 IAV 감염이 설정되었습니다. Lp/KpOMV는 PCLS에 대해 세포독성이 없었으며(그림 8A) OMV 사전 자극과 IAV 감염의 조합으로 Mx1 유도(그림 8B) 및 CXCL10 방출(그림 8C)이 발생했습니다. LpOMV가 아닌 KpOMV는 PCLS에서 IAV 복제를 크게 감소시켰습니다(그림 8D). 관찰된 효과는 UV 비활성화 IAV 감염으로 인해 사라졌습니다(그림 8A-C). 우리의 연구 결과는 AM이 IFN I 유도를 통해 그람 음성 박테리아의 OMV에 반응하여 AM의 자가분비 방식과 AEC의 측분비 방식으로 항바이러스 반응을 유도하는 폐 염증 모델로 이어집니다. 시험관 내 및 생체 외 PCLS 모델 (그림 8E).
그림 7 OMV의 인플루엔자 A 바이러스 복제 억제 효과는 AEC로 이전 가능합니다. THP-1 세포를 LpOMV 또는 KpOMV와 함께 20시간 동안 배양하거나 대조군을 위해 처리하지 않은 채로 두었습니다. 상청액(SN)을 멸균 여과하고 20시간 동안 단독으로 또는 10 μM JAKi와 함께 A549 세포의 사전 자극에 사용했습니다. A+B Mx1(A) 및 CXCL8 B 발현은 감염 시점(0h pi)에서 qPCR에 의해 결정되었습니다. 막대는 처리되지 않은 대조 세포에 대해 표준화된 4개의 독립적인 실험 + SEM의 평균값을 보여줍니다. C 전처리된 A549 세포를 인플루엔자 바이러스 A/Hamburg/5/2009(H1N1pdm)(MOI 0.01)에 24시간 동안 추가로 감염시켰다. 바이러스 복제는 플라크 분석에 의해 결정되었습니다. 막대는 4개의 독립적인 실험 + SEM의 평균값입니다. 통계: 1-방향 ANOVA; **피<0.01, ****p<0.0001; * compared to control-SN; # compared to KpOMV-SN; n=4
논의
우리는 다른 박테리아의 소포가 후속 감염에서 IAV 복제를 제한할 수 있는 대식세포에서 차등 신호를 유도한다는 것을 발견했습니다. 문헌에 따르면, Lp, Kp, Ec 및 Sal에서 분리된 OMV와 Sp에서 분리된 MV의 크기는 비슷했습니다[26-28]. 박테리아 소포와 함께 배양된 대식세포는 세포독성을 나타내지 않았지만[29, 30], 전염증성 반응을 유도했습니다. 모든 소포는 p38 인산화를 유발하고 일차 인간 대식세포로부터 CXCL8 및 IL{7}}의 방출을 유발하는 반면, IFN I 유도 및 하류 신호 전달에는 차이가 있었습니다. 우리와 다른 사람들은 이미 TLR2를 통한 LpOMV 신호 [12, 22]와 SpMV가 대식세포에서 뚜렷한 활성화 패턴을 유도한다는 것을 보여주었습니다 [31]. LpOMV/SpMV는 기원 박테리아에 대해 설명된 바와 같이 전염증성 NF-κB 표적 유전자를 활성화했습니다[12, 22, 31]. 그러나 Kp/Ec/SalOMVs의 인식은 NF-κB 표적 유전자 외에도 하류 IFNB 발현을 통한 IRF{18}} 인산화 유도와 ISG 유도와 함께 STAT1의 장기간 인산화를 유발하여 활성을 주장합니다. IFNAR-JAK/STAT 신호. OMV는 표면에 LPS를 가지고 있지만 OMV의 염증 유발 능력은 순수한 LPS로는 흉내낼 수 없습니다. 우리와 다른 사람들은 동일한 양의 순수 LPS에 비해 대식세포가 OMV에 더 민감하다는 것을 관찰했습니다[32, 33]. OMV에는 강력한 면역 반응을 유도하는 데 필요한 면역 작용제가 모두 포함되어 있습니다[32]. 상업용 TLR 및 RIG-I 작용제 단독으로 또는 LPS와 함께 사용하면 효과를 모방할 수 없습니다. LPS가 탑재된 리포솜이 유리 LPS와 비교하여 대식세포에서 TRIF-IRF-3의 더 장기간 활성화를 유도한다는 것이 이전에 입증되었습니다[34]. TRIF-/- 대식세포를 사용하여 우리는 이 어댑터 분자에 대한 ISG 유도의 의존성을 보여주었습니다. 더욱이, 내독소가 없는 CcOMV 또는 LPSmasking PB와 결합된 OMV는 대식세포의 반응을 없애기에 충분했습니다. 이는 후속 세포내이입 및 TRIF 신호 전달과 함께 TLR4를 통한 OMV의 인식을 나타냅니다. 따라서 Kp/Ec/SalOMV는 TLR4를 통해 대식세포의 전염증 활성화를 유도하여 MyD88 신호 전달 및 NF-κB 의존성 유전자 발현뿐만 아니라 IFN I 반응을 통한 TRIF 신호 전달을 유도할 수 있었습니다. 이는 마우스에서 Neisseria meningitidis OMV의 면역원성에 TLR4와 TRIF가 함께 필요하다는 것을 보여주는 문헌과 일치합니다[35]. I형 IFN은 항바이러스 반응의 주요 조절자이므로 Kp/Ec/SalOMV의 인식이 IAV 복제에 영향을 미친다는 가설을 세웠습니다. 우리는 TRIF 활성화 OMV 전처리 후 대식세포가 IAV 및 VSV 복제를 효율적으로 차단하는 동시에 TRIF-/- 바이러스 복제를 구출한다는 것을 입증했습니다. IFNAR 신호 전달에 대한 효과를 정확히 찾아내기 위해 OMV와 결합된 JAK1/2 억제는 STAT{44}}의존 Mx1 유도를 성공적으로 차단하고 대식세포에서 바이러스 복제를 구출했습니다. KpOMV와 PB의 조합 또는 내독소가 없는 CcOMV의 적용은 항바이러스 유전자를 유도할 수 없기 때문에 대식세포의 IAV 복제를 감소시키지 못했습니다. 초원심분리에 의해 얻은 세포외 소포 제제에는 유리 단백질과 소포와 함께 박테리아 세포 부착물이 포함되어 있으므로 OMV 제제는 한외여과와 크기 배제 크로마토그래피의 조합을 통해 추가로 생성되었습니다[25].
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획득된 순수 소포 제제는 하류 Mx1 유도를 통해 TRIF-IRF 신호 전달을 동등하게 유도할 수 있었고 직접적인 소포 효과를 주장하는 바이러스 복제를 차단했습니다. ATM은 폐의 첫 번째 방어선이지만 인간 폐의 IAV 감염 및 복제의 대부분은 AEC에서 발생합니다 [36]. 따라서 AEC는 OMV로 자극을 받았지만 대식세포처럼 자극에 반응하지 않았습니다. 기관지 상피 세포주 BEAS2B만이 CXCL8 발현에 반응했지만 Mx1 유도가 부족했습니다. 우리는 대식세포에서 TLR4와 TRIF에 의존하는 항바이러스 유전자 발현을 보여줄 수 있기 때문에, 우리는 테스트된 4개의 상피 세포주가 대식세포와 비슷한 정도로 TLR4를 발현하지 않으며 TLR4 활성화 시 OMV를 세포내이입하지 못했다는 가설을 세웠습니다. 이는 분리된 인간 AEC가 쌍을 이루는 AM처럼 LPS에 반응하지 않는다는 것을 보여주는 문헌과 일치합니다[37]. OMV 사전 배양 시 항바이러스 상태를 IFN I에 연결하면서 OMV 자극 대식세포의 상등액을 사용하여 AEC를 사전 자극했습니다. KpOMV 자극 대식세포의 조건화된 배지는 직접적인 소포 자극과 달리 이들 세포에서 Mx1 발현을 유도하고 후속 감염 실험에서 IAV 복제를 감소시켰습니다. LpOMV 처리 대식세포의 상층액은 상피 세포에서 CXCL8을 유도했지만 Mx1 유도 및 바이러스 복제 변화를 일으키지 않았습니다. 조절된 배지에서 관찰된 효과를 IFN I에 기인하기 위해 상층액을 JAK1/2 억제제와 결합하여 Mx1 유도를 차단했으며 바이러스 복제에는 영향을 미치지 않았습니다. 인간 폐의 다양한 세포 유형의 상호 작용은 더 복잡하고 조절된 배지로 완전히 모방할 수 없기 때문에 우리는 숙주-병원체 상호 작용에 대한 연구에 널리 사용되어 온 인간 원위 폐 조직의 생존 가능한 부분에 대한 접근 방식을 확장했습니다. 인플루엔자 바이러스 및 세균 감염 [38-41]. 사용된 시험관 모델과 달리 생체 외 인간 폐 조직은 폐의 3차원 구조를 유지하고 폐에 상주하는 세포 유형 간의 생리학적 상호 작용을 허용하지만 추가로 모집된 면역 세포의 유입 가능성이 부족합니다. IAV를 사용한 KpOMV 자극 PCLS의 연속 감염은 전처리되지 않은 대조군에 비해 바이러스 부하를 감소시켰습니다. 시험관 내에서 테스트된 모든 AEC가 직접적인 세균 소포 자극에 반응하지 않았기 때문에 우리는 이 생체 외 모델에서 AM이 주요 반응 세포 유형이라고 가정합니다. AEC에서만 감염되고 복제되는 후속 감염을 위해 인플루엔자 분리균이 선택되었기 때문에 이는 AM에서 발생하여 AEC로 전달되는 측분비 항바이러스 효과라고 추정할 수 있습니다. 여기에서 얻은 데이터를 기반으로 우리는 다음 모델을 제안합니다(그림 8E): 그람 음성 박테리아의 OMV는 고전적인 염증 유발 방식으로 인간 대식세포를 활성화하고 성공적인 세포내이입 후 TLR4 및 TRIF를 통해 항바이러스적으로 대식세포를 프라이밍할 수 있습니다. 소포. IFN I 릴리스는 IFNAR 및 JAK/STAT 신호를 통해 대식세포 및/또는 AEC를 항바이러스제로 렌더링할 수 있습니다. 이들 세포의 후속 감염은 바이러스 부하의 Mx{31}}매개 감소를 유발합니다. 우리는 기본 인간 AM에 접근할 수 없었기 때문에 인간 BDM을 모델로 사용하여 실험을 수행했습니다. 이러한 대식세포의 다양한 발생 기원과 프라이밍을 고려할 때 AM은 BDM과 달리 약한 염증 유발 반응을 보였을 것으로 생각됩니다. 세균 소포는 이미 다양한 폐렴 유발 병원체에 대한 예방접종 전략에 사용되었습니다([42]에서 검토). 따라서 OMV는 숙주 박테리아에 대한 잠재적인 전신 예방접종 전략을 위한 도구일 뿐만 아니라 상주 선천 면역 세포를 활성화하여 바이러스 감염과 싸우기 위해 국소적으로 사용될 수도 있습니다. 이러한 체외 연구 결과가 다른 바이러스 병원체에 적용 가능한지 여부를 테스트하려면 향후 생체 내 연구가 필요합니다. 또한 생체 내에서 과장된 면역 반응을 피하기 위해 발생 가능성이 있는 내독소 반응을 비판적으로 모니터링해야 한다는 점에 유의할 필요가 있습니다. 제1형 IFN의 유도는 TLR7 작용제의 흡입이 첫 번째 투여 후 처음에는 잘 견뎠으나 TNF- 및 IFN I 반응이 증가하고 인플루엔자 유사 증상이 나타나는 건강한 개인에게 나타났기 때문에 엄격하게 제어되어야 합니다. , 두 번째 투여 후 [43]. 부작용을 방지하려면 균형 잡힌 면역 반응을 유도하고 우수한 적용 가능성을 달성하기 위해 유전자 변형 버전의 OMV가 필요할 수 있습니다. 종합하면, 우리는 OMV가 인간 대식세포에서 항바이러스 신호를 유도할 수 있는 방법과 이것이 IAV 복제를 방지하는 데 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 모델을 제시합니다.
그림 8 KpOMV는 인간의 정밀 절단 폐 절편에서 인플루엔자 A 바이러스 복제를 감소시킵니다. 인간 PCLS를 20시간 동안 1μg/mL OMV(Lp/Kp)와 함께 배양한 후 인플루엔자 A/California/04/2009(H1N1pdm)에 48시간 동안 추가로 감염시켰습니다. 바이러스의 UV 불활성화가 대조군 역할을 했습니다. 세포독성은 PCLS에서 방출된 LDH의 정량화에 의해 결정되었으며 전체 용해와 비교하여 %로 표시됩니다. B Mx1 발현은 qPCR에 의해 정량화되었으며 RPS18 및 처리되지 않은 대조군 PCLS와 비교하여 제시됩니다. C CXCL10 방출은 ELISA에 의해 결정되었으며 ng/mL로 표시됩니다. D 바이러스 복제는 플라크 분석에 의해 결정되었으며 pfu/mL로 표시됩니다. 막대는 3~5개의 생물학적 복제+SEM의 평균값을 보여줍니다. E 폐에서 OMV의 항바이러스 면역 유도를 위한 제안된 모델. 통계: 1-방향 ANOVA(AC), Friedman-test(D); *피<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; * compared to IAV infected, but not pre-treated PCLS, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=5
참고자료
1. Kulp A, Kuehn MJ. 분비된 세균 외막 소포의 생물학적 기능과 생물 발생. Annu Rev 미생물. 2010;64:163–84.
2. 엘리스 테네시, Kuehn MJ. 박테리아 외막 소포의 독성 및 면역 조절 역할. Microbiol Mol Biol Rev. 2010;74(1):81–94.
3. 지오다노 NP, Cian MB, Dalebroux ZD. 외막 지질 분비와 그람 음성균에 대한 선천적 면역 반응. 면역을 감염시킵니다. 2020. https://doi.org/10.1128/IAI.00920-19.
4. Mancini F, 외. OMV 백신과 면역 반응에서 TLR 작용제의 역할. Int J Mol Sci. 2020. https://doi.org/10.3390/ijms21124416.
5. Hu G, Christman JW. 사설: 폐 염증 및 해결의 폐포 대식세포. 프론트 면역. 2019;10:2275.
6. Grassin-Delyle S, 외. 인간 폐 대식세포에 의한 사이토카인 생산에서 톨 유사 수용체의 역할. J 선천적 면역. 2020;12(1):63–73.
7. 인플루엔자(계절성) 사실 자료. 2018; https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/influenza-(계절별)
8. Crotta S, 외. I형 및 III형 인터페론은 중복 증폭 루프를 구동하여 인플루엔자에 감염된 기도 상피에서 전사 시그니처를 유도합니다. PLoS Pathog. 2013;9(11): e1003773.
9. 발스 R, Hiemstra PS. 폐의 선천 면역: 상피 세포가 호흡기 병원체에 맞서 싸우는 방법. Eur Respir J. 2004;23(2):327–33.
10. Helft J, 외. 교차 제시 CD103+ 수지상 세포는 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 보호됩니다. J 클린 인베스트. 2012;122(11):4037–47.
11. Ghoneim HE, Thomas PG, McCullers JA. 인플루엔자 감염 중 폐포 대식세포가 고갈되면 박테리아 중복 감염이 촉진됩니다. J Immunol. 2013;191(3):1250–9.
12. 정 AL, 외. 레지오넬라 뉴모필라 유래 외막 소포는 대식세포에서 박테리아 복제를 촉진합니다. PLoS Pathog. 2016;12(4): e1005592.
13. Lindhauer NS, 외. 폐렴구균의 체외 감염 모델에서 Tribolium Castaneum defen-sin의 항균 활성. 독성. 2019;10(1):902–9.
14. Danov O 외. 담배 연기는 수지상 세포 집단, 상피 장벽 기능 및 H1N1 바이러스 감염에 대한 면역 반응에 영향을 미칩니다. 프론트 메드. 2020. https://doi.org/10.3389/fmed.2020.571003.
15. Matrosovich M, 외. 바이러스성 플라크 분석을 위한 새로운 저점도 오버레이 매체. 비롤 J. 2006;3:63. 16. 노이하우스 V, 그 외 여러분. 인간의 정밀 절단된 폐 절편에서 물질의 세포 독성 및 면역 조절 효과를 평가합니다. J Vis Exp. 2018. https://doi.org/10.3791/57042. 17. Niehof M, 외. 다양한 종의 정밀 절단 폐 절편(PCLS)에서 RNA 분리. BMC 해상도 노트. 2017;10(1):121.
18. 슐츠 C, 외. THP-1-유래 대식세포는 폐 상피 세포를 레지오넬라 뉴모필라(시스템 생물학 연구)에 대해 저반응성으로 만듭니다. Sci Rep. 2017;7(1):11988.
19. Livak KJ, Schmittgen TD. 실시간 정량 PCR과 2(-Delta Delta C(T)) 방법을 이용한 상대적인 유전자 발현 데이터 분석. 행동 양식. 2001;25(4):402-8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.
20. Haller O 외. Mx GTPase: 선천성 면역 기능을 갖춘 다이너민 유사 항바이러스 기계입니다. 동향 미생물. 2015;23(3):154–63. 21. 아나스타샤 M, 외. 인플루엔자 A/WSN/1933(H1N1) 바이러스의 NS1 단백질의 C 말단은 감염된 인간 대식세포 및 생쥐에서 항바이러스 반응을 조절합니다. J Gen Virol. 2015;96(8):2086-91.
22. Jager J, 외. 레지오넬라 뉴모필라 외막 소포와 진핵생물 막 시스템의 융합은 병원체 인자를 숙주 세포막에 전달하는 메커니즘입니다. 세포 미생물. 2015;17(5):607–20.
23. Lammers AJ, 외. 비장이 없는 폐렴구균성 폐렴에 대한 숙주 반응에서 TLR2의 역할. BMC 감염 Dis. 2012. https://doi. org/10.1186/1471-2334-12-139.
24. Mamat U, 외. 내독소가 없는 단백질 생산—ClearColi™ 기술. Nat 방법. 2013;10:916.
25. Théry C, 외. 세포외소포 연구를 위한 최소 정보 2018(MISEV2018): 국제세포외소포학회의 입장 성명 및 MISEV2014 지침 업데이트. J 엑스트라셀 소포. 2018;7(1):1535750. https://doi.org/10.1080/20013078.2018. 1535750. 26. Bonnington KE, Kuehn MJ. 외부 막 소포 생산은 환경 전환 중에 살모넬라 균의 lps 리모델링 및 외부 막 유지 관리를 촉진합니다. MBio. 2016. https://doi.org/10.1128/mBio. 01532-16.
27. Jasim R, 외. 한 쌍의 폴리믹신 감수성 및 저항성 클렙시엘라 뉴모니애 임상 분리주로부터의 외막 소포의 지질체 분석. Int J Mol Sci. 2018. https://doi.org/10.3390/ijms19082356.
28. Olaya-Abril A, 외. Streptococcus pneumoniae에 의해 생성된 보호 세포외막 유래 소포의 특성 규명. J 프로테오믹스. 2014;106:46–60.
29. Kuhn T, Koch M, Fuhrmann G. 프로바이오미메틱스(Probiomimetics) - 미세입자를 모방한 새로운 유산균은 위장 모델에서 항염증 및 장벽 보호 효과를 나타냅니다. 작은. 2020;16(40): e2003158.
30. 메하니 M, 외. 연쇄구균 세포외막 소포는 면역 세포에 의해 빠르게 내부화되어 사이토카인 방출을 변경합니다. 프론트 면역. 2020;11:80.
31. Volgers C, 외. 대식세포 감염 중 THP-1 대식세포와 호흡기 병원체에 의해 방출되는 막 소포의 면역조절 역할. BMC 마이크로바이올. 2017;17(1):216.
32. Ellis TN, Leiman SA, Kuehn MJ. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에서 자연적으로 생성된 외막 소포는 지질다당류와 단백질 성분의 결합된 감지를 통해 강력한 선천적 면역 반응을 유도합니다. 면역을 감염시킵니다. 2010;78(9):3822–31.
33. Alaniz RC, 외. 막 소포는 수지상 세포를 강력하게 활성화하고 B 및 T 세포 반응을 프라이밍하며 생체 내에서 보호 면역을 자극하는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 면역원성 복제물입니다. J Immunol. 2007;179(11):7692-701.
34. Watanabe S, Kumazawa Y, Inoue J. 리포좀 지질다당류는 CD14와 무관하게 TRIF 의존성 신호 전달 경로를 시작합니다. PLoS ONE. 2013;8(4): e60078.
35. Fransen F 외. Neisseria meningitidis 또는 Bordetella pertussis에 대한 백신으로 면역화한 후 면역 반응에 대한 TLR2 및 TLR4의 차별적 효과. PLoS ONE. 2010;5(12): e15692.
36. Travanty E 외. H1N1 인플루엔자 바이러스에 대한 인간 폐 일차 세포의 차별적 감수성. J 비롤. 2015;89(23):11935–44.
37. 무바라크 RA, 그 외 여러분. 한 쌍의 인간 일차 기도 상피 세포와 폐포 대식세포의 염증 유발 및 항염증 반응 비교. Respir Res. 2018;19(1):126.
38. 우 W, 외. 인간 폐 기관 배양 모델에서 H3N2 및 H1N1 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 선천적 면역 반응. 바이러스학. 2010;396(2):178–88.
39. 우 W, 외. 인플루엔자 A(H1N1)pdm09 바이러스는 인간 폐에서 RIG-I에 의해 시작된 선천적 항바이러스 반응을 억제합니다. PLoS ONE. 2012;7(11): e49856.
40. Delgado-Ortega M, 외. 신생아 돼지 기관 세포, 폐포 대식세포 및 정밀하게 절단된 폐 절편에서 H3N2 아형 돼지 인플루엔자 바이러스에 대한 선천적 면역 반응. 수의사 입술. 2014;45:42.
41. Kolbe U, 외. 쥐의 정밀 절단 폐 조각에서 녹농균 감염 시 초기 사이토카인 유도는 박테리아 생존 가능성을 감지하는 데 달려 있습니다. 프론트 면역. 2020. https://doi.org/10.3389/fmmu. 2020.598636.
42. 정 AL, 그 외 여러분. 폐렴에서 숙주와 세균 유래 세포밖 소포체의 임상적 역할. Adv Drug Deliv Rev. 2021. https://doi.org/10. 1016/j.addr.2021.05.021.
43. Delaney S 외. 선택적 TLR7 작용제인 AZD8848의 흡입 투여 후 사람의 내약성. BMJ 오픈 호흡 입술. 2016;3(1): e000113.
