당뇨병 Db/Db 마우스에서 당뇨병성 심근병증에 대한 Echinacoside의 유익한 효과

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시앙 장 & 하오 야롱

소개

당뇨병성 심근병증(DCM)은 당뇨병 환자에서 높은 이환율과 심혈관 질환 및 사망률의 높은 위험이 있는 당뇨병의 주요 합병증입니다.1 당뇨병 병력이 있는 환자에서 DCM의 발병률은 5년 이상 44.4 퍼센트, 8년 후에는 56퍼센트로 증가합니다.2,3 DCM은 허혈성 또는 고혈압성 심장 질환이 없는 당뇨병 환자에서 심근 섬유증 세포 사멸 및 미세혈관 병변으로 인한 심장 구조 및 기능 이상으로 나타나는 일종의 원발성 심근병증입니다. 심장 기원 쇼크 및 심부전의 돌연사로 인해 심장 부정맥을 유발할 수 있습니다.4 DCM의 복잡한 병인 및 진행된 단계의 진단으로 인해 효과적인 치료법이 존재하지 않습니다.5 고혈당은 DCM 병인의 개시 인자입니다. 장기간의 고혈당은 당뇨병 환자의 심근세포에서 포도당 및 지질 대사 장애를 초래하여 혈관 내피 세포 및 기타 조직에 손상을 일으키고 비대, 괴사, 세포자멸사 및 심근 간질 섬유증을 포함한 병리학적 변화를 촉진합니다.6,7 포도당 및 지질 대사 장애는 DCM의 병리학적 기전의 핵심입니다. 따라서 심근세포에서 에너지 대사의 효과적인 제어는 DCM의 중요한 치료 전략을 나타냅니다.

시스탄체 튜불로사 트리트먼트당뇨병성 심근병증

DCM의 심근 지질 축적은 심부전의 진행을 악화시킵니다. PPAR-은 세포 과산화효소, 미토콘드리아 및 마이크로솜의 지방산 산화 시스템에서 다양한 관련 유전자의 핵심 조절자이며 지질 대사 및 염증 및 면역 조절 동안 핵심 역할을 합니다.8 PPAR-은 미토콘드리아 및 peroxidase 지방산 베타 산화, carnitine palmitoyl transferase-I(CPT-I)를 통해 매개 염증 관련 유전자의 발현을 억제합니다. 간에서의 PPAR-발현은 비알코올성 지방간 질환이 있는 환자 또는 장기간 고지방 섭취 동물 모델에서 유의하게 낮습니다. 약화된 지질 대사로 인해 PPAR-녹아웃 마우스 모델에서 간 지방증을 촉진합니다.15 이러한 발견은 PPAR-이 지질 대사의 발병기전에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다.

Echinoside(ECH)는 줄기에서 분리된 천연 화합물입니다.세뇨관.ECH의 활성 화학물질은 페닐에타노이드로 항산화, 항피로, 항종양 및 항염증 효과를 나타내며 기억력, 신경 및 간 보호를 개선하고 면역 조절을 향상시킬 수 있습니다.16,17 연구에서 db/db 당뇨병 마우스에서 ECH가 인슐린 저항성을 개선하고 HDL 수준을 증가시키며 TG, TC 및 LDL 수준을 감소시킬 수 있다는 것이 발견되어 ECH가 당뇨병성 지질 대사를 효과적으로 개선할 수 있음을 나타냅니다.18 또한 Shimoda 등은 에키나코사이드가 간담도 스테롤 수송과 관련된 mRNA를 조절하여 지질 대사에 영향을 줄 수 있음

및 대사.19 이전 연구에서는 ECH가 db/db 마우스에서 신장 섬유증을 개선하기 위해 TGF- 및 그 다운스트림 유전자의 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다.20 이 연구에서 DCM 및 DCM에서 심근 세포 손상에 대한 ECH의 보호 효과를 더 이해하기 위해 잠재적인 분자 메커니즘을 탐색하기 위해 db/db 마우스를 DCM 질병 모델로 사용하고 심근세포에서 포도당 및 지질 대사 장애, 산화 스트레스 및 세포자멸사를 제어하는 단백질에 대한 ECH의 조절 메커니즘을 탐구했습니다. 우리의 목표는 DCM의 효과적인 치료를 위한 이론적 기초를 제공하는 것이었습니다.

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세뇨관

재료 및 방법

화학물질 및 시약

ECH 분말(HPLC로 검출된 순도 94%, 배치 번호 190906)(보충 그림 1)은 Shanghai Medical Science Company, Ltd.(중국 상하이)에서 입수했습니다. ECH를 물에 2 mg/mL로 용해시키고 암실에서 4도에서 보관하였다. ECH는 100–500 mg/kg·d의 용량으로 투여되었으며 유의하게 감소되었습니다.

혈당 및 개선된 혈중 지질 수준.18 ECH는 용량 의존적 저혈당 및 항고지혈증 효과를 나타냈다.

실험 동물 및 치료

동물 실험은 국립 보건원 지침(NIH Pub. No 85-23, 1996년 개정)에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 실험 동물 윤리 위원회와 우한 대학 인민 병원 동물 먹이 센터(중국 우한, 번호 20190517)의 승인을 받았습니다. 성체 수컷 C57BLKS/J db/db 마우스 및 db/m 마우스(SPF 등급)는 Nanjing University–Nanjing Biomedical Research Institute(Nanjing, People's Republic of China, 번호: SCXK(Sue) 2018-0001)에서 구입했습니다. 동물은 실온(20도), 상대 습도 50% -60%, 12-h light/하에 Renmin Hospital(중화인민공화국 우한)의 Animal Center 동물 센터에 가두었습니다. 다크 사이클. 적응 식이는 1시간 동안 수행되었으며 혈당강하제는 투여되지 않았습니다.

격리 후 db/db 마우스를 당뇨병 모델 그룹(db/db 그룹, n{0}}), ECH 치료 그룹(db/db + ECH 그룹, n=11 ) 또는 db/m 제어 그룹(db/m, n=9). 8주에 db/db 및 db/m 그룹의 마우스에는 10주 동안 0.05mL/10g 체중 식염수를 경구 투여한 반면, db/db + ECH 그룹의 마우스에는 300mg/(kg/d) 경구 투여했습니다.

10주 동안 체중에 따른 ECH. 세 그룹의 마우스의 체중을 매주 모니터링하고 섭식, 음주 및 활동을 평가했습니다. 마우스가 8시간 동안 금식하면 혈당 수치를 측정하기 위해 혈당 측정기와 시험지(Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA)를 사용하여 2주마다 꼬리 끝에서 혈액 샘플(~50ul)을 채취했습니다. . 중재 10주 후, 마우스를 2% 펜토바르비탈 나트륨(Shanghai Harvest company, Shanghai, People's Republic of China)(100mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취했습니다. 모세관 바늘 삽입 후 혈액을 채취하고 혈청을 신속하게 분리하여 분석을 위해 -80도에서 보관했습니다. 차가운 PBS로 심장을 관류하여 혈액을 제거한 후, 유리 PBS를 여과지로 제거했습니다. 심장 조직을 분리하여 무게를 측정하고 심장의 건조 중량을 측정했습니다. 마우스의 복부를 면도하고, 알코올(70%) 소독 후 복부를 개방하고, 복부의 피하 지방 조직을 신속하게 제거하고 젖은 무게를 잰다. 마우스의 경골을 분리하여 측정했습니다. 심장 비대는 경골 길이에 대한 심장 무게의 비율(HW/TL)(mg/mm)을 통해 평가되었습니다. 심장 조직은 4% 파라포름알데히드(Google biotechnology, 중국 우한)로 고정하고 심근 조직의 형태를 모니터링하기 위해 생검을 수행했습니다. 나머지 심장 조직을 1시간 동안 액체 질소에 넣고 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석 전에 -80도에서 보관했습니다.

심장초음파

초음파(VisualSonics, Toronto, ON, Canada)는 실험이 끝날 때 심초음파 측정을 위해 수행되었습니다. 30mg/kg의 4% 클로랄 수화물을 30분 동안 복강 내 주사하여 마우스를 마취하고21 가슴 부위를 노출하도록 면도하고 평평한 판에 고정했습니다. 좌심실 수축기 직경(DVD), 좌심실 확장기 직경(LVD), 좌심실 박출률(EF) 및 좌심실 단편 단축(FS)이 결정되었습니다.

대사 및 생화학적 매개변수

18주령에 혈액 샘플을 혈청 수집을 위해 4도에서 20분 동안 원심분리했습니다. 총자동화생화학분석기(ADVID2400, Tokyo, Japan)를 사용하여 총콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 유리지방산(FFA), 고밀도 지단백-콜레스테롤(HDL-c) 및 저밀도 혈청 내 지단백질-콜레스테롤(LDL-c).

CISTANCHE

항산화: cistanche tubulosa

산화 지수 및 항산화 수치

각 그룹의 신선한 좌심실 심근 조직(50mg)을 얻었다. 심근 세포의 SOD, GSH-px 및 MDA 수준은 상용 키트(Nanjing Jiangcheng Bioengineering Institute, China)를 사용하여 결정되었습니다.

Trichrome, Tunel 및 수단 II 염색 각 그룹의 마우스 심근 조직의 좌심실 영역을 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 파라핀 포매, 절편 및 HE 염색했습니다. 광학현미경(JEOL, Tokyo, Japan)에서 각 생쥐 그룹의 심근섬유의 병리학적 및 형태학적 변화를 관찰하였다. Tunel assay(number11684817910, Roche, USA)로 심근세포의 세포자멸사를 검출하였다. 심장 조직을 파라포름알데히드로 사전 처리하고, 포매하고, 슬라이스했습니다. 섹션을 크실렌 I(중화인민공화국 상하이)(20분) -자일렌 II(20분) -무수 에탄올 I(10분) -무수 에탄올 II(10분) -95% 알코올(5분)로 세척했습니다.{{ 14}} 퍼센트 알코올(5분){16}} 퍼센트 알코올(5분) -70퍼센트 알코올(5분) 및 증류수. 절편을 흔들어 건조시키고 조직화학 브러시 링을 사용하여 액체 손실을 방지했습니다. 조직을 덮기 위해 링에 프로테아제 K를 첨가했습니다. 37도에서 15분 동안 인큐베이션한 후 슬라이드를 PBS(pH 7.4)에 넣고 탈색 쉐이커에서 세척했습니다(5분 동안 3회). 시약 1(TdT)과 시약 2(dUTP)를 1:9의 비율로 혼합하고 조직의 내부 덮개에 첨가했습니다. 혼합물을 37도의 수조에서 60분 동안 인큐베이션했습니다. 습도를 유지하기 위해 소량의 물을 첨가했습니다. 슬라이드를 PBS로 헹구고 DAPI로 5분 동안 암실에서 DAPI 염색했습니다(중화인민공화국 우한시 아스펜 생물학). 슬라이드를 PBS로 헹구고 항형광 소광제를 사용하여 장착했습니다. 섹션을 형광 현미경으로 시각화하고 이미지화했습니다. 수단 II 염색을 사용하여 심장 근육 세포의 지질 축적을 관찰했습니다. 좌심실 조직을 10% 파라포름알데히드에 30분 동안 고정하고, 실온에서 수단 레드 II(Gefen, Shanghai, People's Republic of China)로 10분 동안 염색하고, 75% 알코올로 탈색시키고, PBS에서 15분 동안 다시 염색하였다. . Image-Pro Plus 정량 소프트웨어를 사용하여 Masson의 염색된 삼색소 섹션의 전체 면적에 대한 심근 섬유증의 비율을 결정했습니다. 슬라이드는 글리세린 젤라틴을 사용하여 장착하고 현미경을 통해 이미지화했습니다.

결과

Db/Db 마우스에 대한 ECH의 효과

db/db 그룹의 마우스는 명백한 다식증과 다뇨증을 보였습니다. 신체 크기도 db/m 마우스보다 상당히 컸습니다. db/db 그룹의 체중은 db/m 그룹에 비해 유의하게 증가했습니다(그림 1A; **p<0.01). body="" weights="" of="" the="" db/db="" +="" ech="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" of="" the="" db/="" db="" group="" after="" 10="" weeks="" of="" ech="" treatment="" (figure="" 1a;=""><0.05). at="" week="" 15,="" the="" difference="" in="" body="" weight="" of="" each="" group="" gradually="" appeared="" after="" ech="" intervention.="" the="" abdominal="" fat="" thickness="" of="" mice="" in="" the="" db/db="" group="" was="" higher="" than="" those="" in="" the="" db/m="" group="" (figure="" 2b;=""><0.01). ech,="" therefore,="" improves="" obesity="" in="" db/db="" mice,="" the="" specific="" mechanisms="" of="" which="" require="" further="">

공복 혈당 수치는 매주 평가되었습니다. 도 1B에 도시된 바와 같이, db/m 마우스와 비교하여, db/db 마우스의 공복 혈당 수준은 연령에 따라 유의하게 증가하고 명백한 고혈당을 나타냈다(도 1B; *p<0.01). over="" a="" 10="" week="" period,="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/db="" and="" db/db="" +="" ech="" group="" increased,="" whilst="" glucose="" levels="" in="" the="" db/m="" group="" remained="" stable.="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/="" db="" +="" ech="" group="" were="" slower="" than="" those="" of="" the="" db/db="" group="" (figure="" 1b;=""><0.01), suggesting="" that="" ech="" markedly="" improved="" hyperglycemia="" in="" db/db="" diabetic="" mice.="" we="" speculated="" that="" ech="" could="" promote="" the="" synthesis="" of="" liver="" glycogen="" and="" inhibited="" the="" activity="" of="" α-glucosidase="" to="" suppressed="" glucose="" transport="" in="" the="" small="" intestine,="" significantly="" contributing="" to="">

논의

당뇨병성 심근병증은 일반적으로 4단계로 나뉩니다. 첫 번째 단계에서 좌심실 질량이 증가하고 이완기 기능 장애와 박출률(EF)이 정상입니다. 임상적으로 무증상인 경우에도 심근 섬유증이 증가하고 조기 이완기 충만이 감소하며 좌심실 이완기 말압이 증가합니다.<50%), mild="" cardiac="" dilatation.="" in="" the="" third="" stage,="" diastolic="" dysfunction="" and="" arterial="" hypertension="" contribute="" to="" systolic="" dysfunction="" and="" microangiopathy.="" stage="" iv,="" moderate-severe="" systolic="" dysfunction,="" cardiac="" dilatation,="" fibrosis,="" and="" microvascular="" and="" macrovascular="" lesions="" cause="" severe="" and="" irreversible="" changes="" in="" heart="" tissue="" ultimately.26="" myocardial="" cell="" apoptosis,="" necrosis,="" hypertrophy,="" and="" fibrosis="" increase="" leading="" to="" disorders="" of="" diastolic="" and="" systolic="" functioning.6,27="" this="" eventually="" develops="" into="" ischemic="" heart="" disease="" and="" heart="" failure.28="" in="" this="" study,="" blood="" glucose="" and="" serum="" lipid="" levels="" of="" db/db="" mice="" significantly="" increased="" in="" the="" db/db="" group.="" symptoms="" of="" obesity="" were="" also="" observed,="" including="" body="" weight="" changes="" and="" increases="" in="" the="" rate="" of="" hw/tl="" compared="" to="" the="" db/m="" group.="" he="" staining="" and="" masson's="" trichrome="" staining="" of="" the="" heart="" showed="" obvious="" pathological="" changes="" in="" the="" cardiac="" myocytes="" of="" the="" db/db="" group,="" including="" hypertrophy="" and="" necrosis,="" disordered="" cardiac="" myocytes,="" and="" high="" levels="" of="" extracellular="" matrix="" deposition.="" these="" data="" indicate="" that="" db/db="" mice="" exhibit="" early="" dcm="" under="" long-term="">

ATP는 심장의 기본 에너지원입니다. 심장 에너지는 심장 에너지 공급의 ~70%를 차지하는 FA의 산화 및 분해에 의해 제공됩니다.29 나머지는 포도당 및 젖산과 같은 탄수화물에 의해 제공됩니다.30 당뇨병이 있는 심장은 감소된 포도당 대사 및 FA 대사 증가를 포함하는 심근 대사 장애의 주요 원인을 나타내는 심근 용량. 이것은 지방 축적과 독성 지방 물질의 형성으로 이어지는 FA 흡수 및 산화를 증가시켜 DCM 병변으로 직접 이어집니다.31

결론

당뇨병성 심근이 있는 db/db 마우스에서 포도당 및 지질 대사가 조절되지 않아 산화 스트레스 및 세포자멸사 수준이 증가합니다. 이 연구는 ECH가 PPAR/M-CPT-1/GLUT-4 신호 전달을 통해 db/db 마우스에서 장기간 고혈당을 유의하게 감소시킬 수 있음을 확인했습니다. 한편, ECH는 db/db DCM 마우스에서 산화 스트레스를 개선하고 심근 세포 사멸을 억제했는데, 이는 에너지 대사 개선과 관련이 있을 수 있습니다. 이러한 효과를 지배하는 기본 메커니즘은 발견되지 않았지만, 이러한 발견은 DCM의 치료에 대한 새로운 방향과 심근 손상을 개선하는 ECH의 보호 역할을 제공합니다.

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