Cistanche Deserticola에서 분리한 총 Phenylethanoid Glycoside 분획이 난소 적출 쥐의 뼈 미세구조에 미치는 유익한 효과

본 연구는 난소절제술(OVX)에 의해 유도된 쥐의 C. deserticola(CDP)에서 분리한 총 페닐에타노이드 글리코시드 분획의 항골다공증 활성 및 관련 메커니즘을 추정하기 위해 고안되었습니다. 경구 투여 3개월 후, OVX 쥐의 감소된 골밀도, 혈청 Ca, P가 회복되었고 악화된 해면골 미세구조는 CDP(60, 120, 240mg/kg) 중재에 의해 부분적으로 개선되었으며, 골 흡수 마커는 하향 조절되었고, 골 형성 지수의 생체 활성은 상향 조절되었습니다. 한편, MDA 함량은 감소하였고, GSH는 CDP 처리에 의해 증가하였다. 구성적으로 CDP에서 8종의 페닐에타노이드 글리코시드 화합물이 확인되었으며, HPLC법을 이용하여 총 함량을 50.3%로 정량하였다. 기계적으로, CDP는 TRAF6, RANKL 및 RANK의 수준을 감소시켰고, 따라서 RANKL/RANK/TRAF6-유도된 다운스트림 NF-κB 및 PI3K/AKT 신호 경로의 활성화를 억제하고 궁극적으로 NFAT2의 주요 파골세포 생성 단백질의 활동을 방지했습니다. 및 c-Fos. 위의 모든 데이터는 CDP가 난소 절제된 쥐의 뼈 미세 구조에 유익한 효과를 나타냈으며 이러한 효과는 RANKL, RANK 및 TRAF6의 결합에 의해 유발된 NF-κB 및 PI3K/AKT 신호 전달 경로와 관련이 있을 수 있음을 암시합니다.

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1. 소개

50세 이상의 여성 3명 중 1명이 겪는 폐경 후 골다공증은 전 세계적으로 2억 명 이상의 여성을 괴롭히는 주요 건강 위험 요인이 되고 있습니다[1]. 폐경기에 에스트로겐 수치의 급격한 감소는 일반적으로 강화된 파골 세포 생성으로 인한 과도한 뼈 재흡수로 이어집니다. 그런 다음 조골 세포에 의한 골 형성과 파골 세포에 의한 골 흡수 사이의 균형이 깨져 골 흡수가 가속화되어 결국 골다공증과 고관절 또는 척추 골절이 발생했습니다 [2]. 파골세포의 분화는 RANK(nuclear factor kappa B)의 수용체 활성인자가 RANK의 리간드인 RANKL에 결합했을 때 촉발되는 것으로 여겨졌다. 그러나 RANK에서 RANKL로의 조합은 단백질 종양 괴사 인자 수용체 관련 인자 6(TRAF6)이 결합되지 않는 한 활성화될 수 없으며[3], PI3K/AKT 및 NF-κB를 포함한 하류 신호 경로의 자극이 뒤따릅니다. 그리고 마지막으로 활성화된 T 세포인 c2(NFAT2)와 c-Fos의 핵인자의 발현을 조절하여[4] 파골세포의 분화와 골흡수를 조절하였다. 따라서 파골세포의 활성화와 분화에 직간접적으로 관련된 인자와 조절인자는 골소실을 예방하는 중요한 표적으로 여겨졌다.

실제로 폐경기 골다공증 치료에 효과적인 estradiol valerate와 같은 일부 임상 및 합성 호르몬 대체 요법 약물이 있습니다. 불행하게도, 이들 중 일부는 유방암 및 자궁내막암을 포함한 심각한 암의 위험을 증가시켰고[5], 이는 임상적 적용을 제한했습니다.

따라서 효능과 부작용을 최소화한 다른 대안을 선택하는 것이 필요하다. 한약(TCM)과 분리된 생체 활성 화합물 및 분획[6-9]은 폐경 후 골다공증을 비롯한 다양한 질병에 효과적인 것으로 입증되었습니다. 이러한 생리 활성 성분 및 분획물 중에서 잠재적인 효능을 가진 페닐에타노이드 글리코시드(PhG) 화합물은 골다공증 치료를 위한 유망한 약제로 여겨졌습니다[10-12]. PhG의 구조는 글리코시드 결합을 통해 α-글루코피라노스, 아피오스, 갈락토스, 람노스 또는 자일로스와 결합된 히드록실 페닐 에틸 그룹인 신남산 아글리콘으로 구성됩니다. 그들은 Cistanche 속의 약용 종에 널리 존재합니다 [13]. Cistanche deserticola YC Ma는 중국 약전에 기록된 공식 TCM이며 중요한 TCM [14]인 것 외에도 C deserticola는 부작용이 거의 없는 항노화 강장제 허브로 약용주 및 영양액으로 개발되었습니다. 주 식품의약국.

중국 약전의 기록에 따르면 C. deserticola는 전통적으로 원주민이 근육 쇠약 및 요추 약화와 같은 신장 본질 결핍 문제를 처리하기 위해 사용했으며 에키나코사이드 및 액테오사이드를 포함한 페닐에타노이드 글리코사이드 화합물은 이 허브의 주요 생리 활성 성분입니다. "신장 뼈"의 TCM 이론에 따르면 뼈 시스템은 신장 본질 [15]에 의해 지배되며 골다공증과 같은 뼈 관련 문제는 신장 본질에 영양을 공급하는 활성을 가진 허브 또는 화합물로 회복될 수 있습니다. 따라서 우리는 C. deserticola에서 분리한 총 페닐에타노이드 글리코시드 분획이 적어도 부분적으로는 골다공증 치료에 유익하다는 가설을 세웠습니다. 따라서 현재 실험은 난소 절제(OVX) 쥐 모델을 사용하여 우리의 가설을 검증하기 위해 고안되었습니다. 추산되어야 하는 골 흡수 및 형성 마커 외에도 항산화 지수, RANKL/RANK/TRAF6- 유도 PI3K/AKT 및 NF-κB 신호 경로를 사용하여 주요 메커니즘을 조사했습니다. 항골다공증 생체활성

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2. 재료 및 방법

2.1. 식물 재료 및 준비. Cistanche deserticola YC Ma의 총 30kg 줄기는 2015년 9월 중국 닝샤성 좌표 106.026597 및 38.262816으로 Yongning County에서 수집되었습니다. 이 약초는 Lin Dong 박사(닝샤 의과 대학 약리학과)에 의해 식별되었으며 해당 표본(#20150901)은 약학 분석과에 보존되었습니다.

먼저 30.0 kg의 C. deserticola 분말을 70% 에탄올을 용매로 환류법으로 추출하였다. 물질 대 용매의 비율은 1:10로 설정하였고, 환류 시간은 2시간 동안 3회 수행하였다. 그런 다음, 모든 여액을 합하고 60℃에서 감압 하에 응축하였다. 둘째, 예비 분리를 위해 AB-8 거대다공성 수지 컬럼을 사용하였고, 물 중 에탄올의 비율({ {34}}퍼센트, 20퍼센트, 30퍼센트, 40퍼센트, 50퍼센트 및 60퍼센트, 각 60L)를 용출에 사용하였다. 세 번째로, 40% 및 50% 용리액을 결합하고 물에 0%, 20%, 30%, 40% 및 50% 에탄올의 용리액을 사용하여 반복적인 AB-8 매크로 다공성 수지 컬럼을 사용하여 추가로 정제했습니다. 각 용리액은 12L였다. 마지막으로 40% 분획을 모아 감압 농축하여 담황색 침전물 C. Deserticola의 페닐에타노이드 배당체 분획(CDP, 수율 0.5%) 150g을 얻었다. 생체 내 실험을 위해 CDP를 용해하기 위해 0.5% CMC-Na 용매를 사용했습니다. 동물에 대한 경구 투여는 1 mL/체중 100 g; 시험관 내 웨스턴 블롯 분석을 위해 CDP를 DMSO로 용해한 다음 DMEM으로 희석하여 0.1 mg/mL, 0.01 mg/mL 및 0.001 mg/mL의 최종 농도를 얻었다.

2.2. 화학 물질 및 용제. Estradiol valerate (EV)는 프랑스 Delpharm Lille SAS에서 구입했습니다. ALP(alkaline phosphatase), BGP(bone gla-protein), TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 및 DPD(deoxypyridinoline) 가교결합 ELISA 키트(Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, China, 201605); 말론디알데하이드(MDA, 20181221), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD, 20121218) 및 글루타티온(GSH, 20181221) 시약 키트(Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineering, Nanjing, China); 엘랩사이언스 바이오테크놀로지(Elabscience Biotechnology Co. Ltd.), 중국 우한(Wuhan) 소재의 인택트 파라토르몬(l-PTH, NEWASHE7UZ), 칼시토닌(2L9ISN7AIU) 및 에스트로겐 관련 수용체 알파(ERR , Y3AY8QEWB3) 가교 ELISA 키트; BioVision, America의 카텝신 K ELISA 시약 키트, 11300141; RANKL(GR{19}}), RANK(AA02113656), TRAF6(2), c-Fos(AG12059411), NFAT2(AO11015648), NF-κBp65(AH04138226), PI3 키나아제 p85 알파(AC09021266)의 1차 항체, AKT 1(AF05173234), 액틴(17AV0411), 및 ZSGB-BIO, 중국, 136080의 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 염소 항토끼 IgG의 2차 항체; 총 BCA 단백질 분석 키트 및 파골 세포 형성 및 태아 소 혈청 검출을 위한 상용 키트 및 미국 유타주 로건 소재 하이클론(HyClone)으로부터의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM); Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA의 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막; Gibco, Rockville, MD, USA로부터의 페니실린 및 스트렙토마이신. 사용 된 다른 모든 화학 약품은 AR 등급이었습니다.

2.3. CDP의 HPLC 정량. Agilent 1220 HPLC 기기를 사용하여 CDP의 구성을 식별하고 정량화했습니다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다: C18 컬럼(TSK-GEL, 4 6Id × 250 mm, 5 μm); 구배 용리에는 용매 A(아세토니트릴) 및 B(아세트산 0.5% 함유 물)(0-10분: 17-20% A; 10-30분: 20-25% A; 및 30-40분: 25-30퍼센트 A); 검출 파장은 333nm이고; 주변 온도; 유속은 1.0mL/분이었고; 샘플 주입 부피는 5μL였습니다. 8개의 PhG 화합물, 즉 cistanoside F, echinacoside, 6'-acetylacteoside, cistanoside C, cistanoside A, acteoside, 2'-acetylacteoside 및 isoacteoside가 확인되었습니다. 해당 표준 물질과 외부 표준 방법을 사용하여 위 8가지 PhG의 함량을 HPLC 분석으로 정량화했습니다(그림 1).

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2.4. 동물 실험 프로토콜. 총 60마리의 3개월령 암컷 성체 Sprague-Dawley 쥐를 평균 초기 체중이 약 234±25g인 Ningxia Medical University의 동물 실험 센터에서 목적하였다. 쥐를 표준 특정 병원균이 없는 환경에 수용하여 1주일 동안 적응시켰다. 그런 다음 모든 쥐를 마취(chloral hydrate, 100 mg/kg, ip) 단독 또는 가짜 난소절제(SHAM)하거나 2개의 난소를 모두 제거한 다음 무작위로 5개의 하위 그룹으로 나누었습니다. Na)를 모델군(OVX)으로, estradiol valerate(1 mg/kg/day)를 양성군(EV)으로, 60, 120, 240 mg/kg/day의 CDP를 저(CDPL)로 설정하고, 중간(CDPM) 및 높은(CDPH) 용량 그룹. 모든 랫트에게 매일 경구 투여하였고, 체중 변화에 따라 2주마다 용량을 조절하여 3개월 동안 지속하였다. 동물실험 마지막 날 대사케이지를 이용하여 24-시간 소변을 채취하였다. 마취된 쥐의 대퇴 동맥에서 혈청을 수집했습니다. 오른쪽 대퇴골, 경골 및 모든 장기를 해부하고 추가 분석을 위해 -80°C에서 보관했습니다. 우리가 수행한 동물 실험은 Ningxia Medical University의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

2.5. 골밀도 측정 및 Micro-CT 분석. 첫째, 이중 에너지 X선 흡수계측기(Lunar, USA)를 사용하여 각 쥐의 오른쪽 대퇴골의 총 골밀도를 추정했습니다. 둘째, micro-CT 스캐너 장치(GE, America)를 사용하여 소주골 미세구조의 3D 이미지를 추정하기 위해 동일한 대퇴골을 사용했습니다. 등방성 해상도는 이상적인 3D 이미지를 얻기 위해 14μm로 설정되었습니다. 각 샘플의 대퇴골 성장판에서 동일한 좌표를 설정하여 관심 영역(ROI)을 선택했습니다. 및 섬유주 분리(Tb. Sp), 섬유주 수(Tb. N), 섬유주 두께(Tb. Th), 골 미네랄 함량(BMC), 조직 미네랄 밀도(TMD) 및 조직 미네랄 함량(TMC)을 포함하는 골 형태 측정 파라미터 )는 ROI를 분석하여 얻었습니다.

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2.6. 혈청 및 소변 생화학적 검정. 혈청 카텝신 K, TRAP, SOD 및 GSH의 활성 및 혈청 PTH, 칼시토닌, ERR, MDA, BGP 및 소변 DPD의 함량은 제조자의 지시에 따라 상응하는 시약 키트를 사용하여 측정하였고, ALP(alkaline phosphatase) 및 혈청 및 소변 칼슘(Ca) 및 인(P) 함량은 자동 기계(Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA)를 사용하여 추정하였다.

2.7. 웨스턴 블롯 분석. 대식세포 집락자극인자(MCSF)와 RANKL이 첨가된 RAW 264.7 세포를 이용하여 파골세포를 유도하였다. 간단히, 1 × 107 RAW 264.7 세포를 30 ng/mL의 MCSF 및 25 ng/mL의 RANKL의 존재 하에 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 유도 6일 후 성숙 파골세포를 해당 키트와 함께 TRAP 염색법으로 동정한 후 CDP(0.1, 0.01, and 0.001 mg/mL)를 처리하였다. , 각각) 24시간 동안; 그런 다음, 세포를 0.5mmol 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 용해 완충액으로 용해시켰다. 용해물을 10% SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 PVDF 멤브레인으로 옮겨 AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3Kp85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos 및 -actin(1 : 400) 5% 무지방 우유로 2시간 차단 후. 동일한 막을 벗겨내고 상기 9개의 상응하는 항체로 각각 다시 탐침한 다음 마지막에 Image Lab 소프트웨어에 의해 검출하였다. 실험은 세 번 반복되었습니다.

2.8. 통계 분석. 평균 ± 표준 편차로 기술된 생체 내 및 시험관 내 실험에서 얻은 모든 데이터는 일원 분산 분석에 이어 Dunnett의 테스트(SPSS 22.0 소프트웨어, SPSS, USA)를 사용하여 분석되었습니다. p < 0 05는 통계적으로 유의했습니다.

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3. 결과

3.1. CDP의 화학 성분. HPLC 방법을 사용하여 이 분획에서 그림 1과 같이 8개의 페닐에타노이드 배당체 화합물이 발견되었습니다. 표준 참조 및 외부 표준 방법을 사용하여 화합물 및 그 함량을 다음과 같이 식별하고 정량화했습니다. {11}}퍼센트 ), (4) 액티오사이드(13.3퍼센트 ), (5) 이소악티오사이드(3.3퍼센트 ), (6) 액티오사이드 C(3.6퍼센트 ), (7) 2'-아세틸락티오사이드(9.9퍼센트 ) 및 (8) ) 6'-아세틸락티오시드(3.2%). 이들 8개 성분의 총 함량은 50.7%로 정량화되었다.

3.2. CDP가 골밀도와 섬유주 미세구조에 미치는 영향. 다른 하위 그룹에 있는 쥐의 총 골밀도는 그림 2에 나와 있습니다. OVX 모델 그룹의 쥐에서 골밀도 함량의 감소 추세가 관찰되었으며, 이는 거의 12.0% 감소했습니다. SHAM 그룹의 쥐와 비교하여 수술 12주(p < 0 001). 모든 CDP 처리 쥐는 OVX 모델군 쥐에 비해 골밀도가 각각 11.2%, 12.0%, 10.7%(p < 0 01) 유의하게 증가함을 보였다. .

또한, 총 골밀도, 미세 CT 재건 및 대퇴골의 조직형학적 측정 데이터와 일치하여 OVX 그룹의 쥐는 눈에 띄게 감소한 섬유주 수와 면적으로 입증되는 섬유주 구조의 명백한 악화를 나타냈습니다. 뿐만 아니라 Tb가 현저하게 증가했습니다. 따라서 SHAM 그룹의 쥐와 비교할 때. CDP로 치료하면 섬유주 구조의 OVX 유발 악화가 방지됩니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 BMC, TMC 및 Tb. N 값이 크게 증가했으며 Tb의 면적이 증가했습니다. Sp는 현저하게 감소한 반면 TMD와 Tb의 값은 감소했습니다. 그들은 OVX 운영과 CDP 개입에 크게 영향을 받지 않는 것 같았습니다.

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3.3. CDP가 소변 및 혈청 생화학적 매개변수에 미치는 영향. 그림 4에서 볼 수 있듯이 OVX 모델 그룹의 쥐에서 요중 P 및 칼시토닌의 혈청 함량의 상당한 감소 경향이 감지되었으며 이는 SHAM 쥐보다 거의 30% 및 60% 적었습니다(p < 0 001 ), 반면에 OVX 그룹과 SHAM 그룹 간에는 요중 Ca 및 혈청 Ca 수치뿐만 아니라 혈청 P 및 혈청 PTH 수치의 뚜렷한 증가 또는 감소 경향이 관찰되지 않았습니다. CDP 처리는 OVX 쥐에서 혈청 P와 Ca의 손실을 상당히 방지했으며, 이는 OVX 모델 그룹의 쥐와 비교하여 현저하게 상향 조절된 혈청 P와 Ca의 수준으로 입증되었습니다(p < 0 05). 또한, OVX 모델 그룹과 비교하여 CDP의 저용량 및 고용량 그룹 모두에서 칼시토닌의 증가하지만 비통계적으로 유의한 경향이 관찰되었습니다.

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3.4. CDP가 골형성 및 골흡수 표지자에 미치는 영향. 골 형성 지수에 대한 CDP의 유익한 효과와 골 흡수 표지자에 대한 억제 영향은 그림 5에 설명되어 있습니다. 반면 쥐와 비교했을 때 낮은(60 mg/kg) 및 중간(120 mg/kg) 용량의 CDP 개입 그룹 모두에서 혈청 ALP의 통계적으로 유의미한 개선이 얻어졌습니다. SHAM 그룹의 (p < 0 01). 골흡수 지수의 경우, OVX 모델 그룹의 쥐에서 혈청 카텝신 K 및 DPD와 TRAP의 수준이 SHAM 쥐에 비해 각각 약 75.0%, 41.4% 및 21.0% 크게 향상되었으며, CDP, 특히 60 mg/kg의 저용량으로 처리했을 때 OVX 모델군에서 카텝신 K와 DPD 및 TRAP의 특성이 각각 67.3%, 41.4%, 25.9% 현저하게 억제되었습니다. OVX 모델 그룹의 쥐.

3.5. CDP가 질과 자궁 및 전신 체중에 미치는 영향. 6개 그룹에서 치료 전 쥐의 초기 전체 체중에서 유의하지 않은 차이가 관찰되었습니다(그림 6). 그러나 난소절제 수술은 OVX 모델 그룹에서 쥐의 최종 체중이 거의 36.0% 증가한 반면 자궁 및 질 습윤 중량은 거의 9{{6} }.0% 및 60.0%, SHAM 쥐와 비교하여 각각(p < 0 001). ERR의 함량은 OVX군과 SHAM군 간에 유의한 차이를 보이지 않았지만, CDP와 EV를 포함한 모든 처리군에서 ERR의 수준이 유의하게 증가하였다. 또한, EV로 치료했을 때 위의 체중 증가와 OVX 쥐의 질 및 자궁 중량 감소는 부분적으로 역전되었지만(p < 0 001) CDP 개입에 영향을 받지 않았습니다.

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3.6. CDP가 혈청 MDA, SOD 및 GSH 수준에 미치는 영향. SHAM 및 OVX 모델 그룹 간에 혈청 SOD 및 GSH의 특성에는 통계적으로 유의한 차이가 없었습니다. 그림 7에서 설명하는 것처럼 위의 두 그룹 사이에서 GSH의 증가 추세를 관찰할 수 있습니다. 또한 혈청 MDA 수준은 SHAM 쥐와 비교할 때 OVX 모델 그룹의 쥐에서 거의 50%까지 급격히 상향 조절되었습니다. SOD의 활성은 CDP 처리에 의해 영향을 받지 않은 반면 GSH의 특성은 CDP 개입에 의해 크게 개선되었으며 CDP는 MDA 수준을 60 및 240 mg/kg 용량에서 각각 33.9% 및 42.4% 감소시켰다. p < 0 001).

3.7. CDP가 단백질 발현 수준에 미치는 영향. 그림 8에 표시된 우리의 데이터는 CDP 처리가 대조군과 비교하여 TRAF6, RANK 및 RANKL의 단백질 수준을 상당히 감소시켰음을 시사합니다. NF-κB 억제 및 PI3K/AKT를 포함한 하류 신호 경로는 NF-κB-p65 하향 조절의 발현에 의해 입증된 CDP 개입에 의해 자극된 반면, PI3Kp85 및 AKT1은 상향 조절되었습니다. 결과적으로 0.001-0.1 mg/mL 농도의 CDP 처리 후 NFAT2의 발현은 유의하게 감소하였고 cFos는 증가하였다. 제안된 메커니즘은 그림 9에 설명되어 있습니다. 여기서 CDP는 RANKL 및 RANK의 수준을 하향 조절하여 이 리간드와 수용체의 결합량을 감소시켰고 RANKL과 RANK의 연결은 TRAF6의 하향 조절에 의해 더욱 감소되었습니다. NF-κB 경로를 포함하는 하류 경로의 억제가 뒤따르는 반면 PI3K/AKT 신호 경로는 자극되어 최종적으로 NFAT2 발현 감소 및 c-Fos 수준 증가로 이어집니다.

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4. 토론

페닐에타노이드 배당체는 약용 식물계에 널리 존재하는 자연 발생 수용성 성분입니다[11]. 지금까지 페닐에타노이드 배당체의 화합물은 다양한 인간 질병과 이상을 다루는 분명한 역할 때문에 점점 더 많은 연구자들을 매료시켰습니다[13]. 폴리페놀 및 페닐에타노이드 글리코시드를 포함한 여러 항골다공증 생체 활성 분획 및 화합물이 수십 개의 천연 약초에서 확인 및 분리되었습니다[5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola는 이 식용 TCM의 안전성 프로필을 암시하는 "사막의 인삼"으로 잘 알려져 있습니다[18, 19]. C. deserticola는 아시아 국가에서 오랫동안 사용되어 온 일반 강장제 및 자연 건강 식품으로 신장 기능 강화에 유익한 기능을 나타냈습니다.

전통적으로 신장 본질을 활성화하고 유지하는 데 사용되는 TCM은 일반적으로 골다공증을 치료하는 데 사용되었으며, 시험관 내 및 생체 내 발표 데이터 모두 C. deserticola의 항골다공증 활성을 입증했습니다[20–23], 에키나코시드 및 액티오시드를 포함하는 페닐에타노이드 글리코시드 성분은 이 식용 약용 식물에 존재하는 주요 생리 활성 성분입니다. 이 모든 것은 에키나코사이드와 액테오사이드 자체뿐만 아니라 C. Deserticola에 포함된 다른 페닐에타노이드 글리코사이드 성분이 이 허브의 항골다공증 특성에 책임이 있는 것으로 간주되었음을 시사했습니다. 본 연구에서는 안전한 거대다공성 수지를 사용하여 C. deserticola로부터 페닐에타노이드 배당체 분획을 분리하고 강화했으며, HPLC 방법을 사용하여 8가지 주요 페닐에타노이드 배당체 성분, 즉 액테오사이드 F, 에키나코사이드, 시스타노사이드 A, 액테오사이드, 분리된 페닐에타노이드 배당체 분획물에서 isoacteoside, acteoside C, 2'-acetylacteoside, 6'-acetylacteoside가 발견되었으며, 그 함량은 3.6%, 8.8%, 5.0%, 13.3%, 3.3%, 3.6%, 9.9%, 및 3.2%, 각각. C. deserticola[14]에 기록된 주요 활성 화합물 중 하나인 Echinacoside는 항골다공증 활성을 갖는 것으로 입증되었습니다. 그러나 270 mg/kg의 용량이 너무 높아 추가 임상 적용이 제한되었습니다[24]. 현재 실험에서 60-240mg/kg 체중/일의 낮은 용량을 가진 총 페닐에타노이드 배당체 분획물은 OVX 쥐에 사용되었으며, 식별된 구성 성분의 내용물은 HPLC 방법.

OVX가 골다공증을 유발할 수 있다는 것은 잘 알려져 있으며, OVX 쥐는 인간의 폐경 후 골다공증을 시뮬레이션하기에 고전적이고 적합한 모델로 여겨졌습니다. 동시에 난소절제술 후 골밀도, 소주골 미세구조, 자궁 및 질 습윤 중량, 에스트로겐 수치의 현저한 감소와 골 흡수 및 체중의 명백한 향상이 관찰되었습니다. 에스트로겐 손실로 인한 부분 [25]. 지금까지 우리의 데이터는 OVX가 실제로 폐경 후 골다공증을 유발하고 항상 골질, 골 미세구조, 자궁 및 질 습윤 중량의 급격한 감소를 동반한다는 것을 명확하게 입증했습니다. EV는 임상에서 사용되어 온 일반적인 호르몬 대체제이기 때문에 우리 in vivo 실험에서 양성대조군으로 사용하였고 체중증가와 자궁무게의 위축은 물론 골밀도와 소주골미세구조의 저하를 나타내었다. EV 보완으로 역전될 것으로 예상됩니다.

양성 대조군과 달리 OVX 모델군 쥐의 질 및 자궁 무게 감소 및 체중 증가는 CDP 처리에 영향을 받지 않았으며, 이는 CDP가 신체 및 자궁 유기 조직. ERR의 수치는 CDP 치료에 의해 상당히 상향 조절되었지만 자궁 및 질 유기 조직에 대한 부작용이 관찰되지 않았다는 점에서 식물성 에스트로겐 효과와 같았습니다. 또한, CDP 치료는 난소절제 수술로 악화된 OVX 쥐의 골질을 상당히 강화시켰습니다.

또한, OVX 쥐의 소변과 혈청 내 P와 Ca 수치도 항골다공증 효과를 반영하는 데 사용되었으며, Ca와 무기 P의 농도는 일반적으로 calcitonin과 PTH 수치에 의존적이었다[26]. 본 연구에서, 비록 OVX 모델 그룹의 쥐에서 Ca, 혈청 P, 혈청 Ca 및 PTH의 소변 배설 수준에서 유의한 감소 또는 증가 경향이 얻어지지 않았지만, P 및 칼시토닌의 유의한 요중 수준(p < { {1}})이 관찰되었습니다. 난소절제술로 인한 에스트로겐 결핍은 항상 혈중 칼시토닌 수치를 감소시킨다는 발표된 데이터와 일치하게, 이 감소된 혈청 칼시토닌은 결국 PTH 수치를 증가시켰고, 여기서 Ca는 PTH 분비의 주요 조절자로 여겨졌습니다. PTH의 농도는 본 연구에서 OVX군과 SHAM군 사이에 유의한 차이가 없었기 때문에 혈청과 소변 모두에서 Ca 농도도 위의 두 군 사이에 뚜렷한 변화를 나타내지 않았다.

그러나 OVX군과 SHAM군 사이에서 칼시토닌 수치가 유의하게 감소하는 경향을 보였고, 결과적으로 OVX의 소변 내 P 함량은 강력하게 감소했다. 우리는 위의 데이터가 왜 OVX 쥐의 Ca 수준의 소변 배설이 SHAM 쥐와 비교하여 뚜렷한 변화를 보이지 않았는지에 대한 모순된 현상을 설명할 수 있으며, 이 현상은 또한 증가된 뼈 교체율과 관련이 있을 수 있다고 믿었습니다 [27] . CDP로 치료한 후, OVX 쥐에서 혈청 내 P와 Ca 수치가 눈에 띄게 증가했으며 소변 내 P 함량은 하향 조절되었습니다. 요소, 따라서 뼈 손실을 간접적으로 억제합니다.

또한 골 형성 및 재흡수 마커와 SOD 및 GSH를 포함한 항산화 효소를 사용하여 CDP의 근본적인 항골다공증 기전을 설명했습니다. 공개된 데이터와 유사하게, OVX 모델 그룹의 쥐에서 ALP 수준은 비통계적으로 유의미한 증가 추세를 나타냈으며 이는 폐경 후 골다공증에서 골 교체율이 가속화되었음을 나타냅니다[10]. 그러나 CDP(60, 120, 240 mg/kg/day)로 처리한 후 ALP의 특성이 크게 향상되었습니다. OVX가 에스트로겐 수치의 급격한 감소를 유발하여 일반적으로 과도한 뼈 흡수 및 산화 스트레스를 유발한다는 것은 잘 알려져 있습니다[28]. OVX 모델 그룹.

그러나 이러한 악화는 CDP 개입으로 부분적으로 개선되었습니다. 또한 CDP(60 및 240mg/kg)로 OVX 쥐를 치료한 결과 GSH 활성이 상당히 증가한 것으로 나타났습니다(p < 0 05). 위의 결과는 CDP가 OVX에 의해 유발된 골다공증에 대한 치료 효과를 나타냈으며, 이러한 효과는 골 형성을 촉진하고 골 흡수를 억제할 뿐만 아니라 골 항산화 시스템을 개선함으로써 이루어졌다는 것을 의미합니다.

리간드 RANKL에 의한 RANK의 활성화는 PI3K/AKT 및 NF-κB 신호 전달을 통해 NFAT2 및 c-Fos의 발현을 자극했습니다[29]. NF-κB의 파괴가 골다공증 표현형으로 손상된 파골세포 분화로 이어질 수 있고, NF-κB가 RANKL/RANK/TRAF-유도 파골세포 형성 동안 c-Fos를 상향 조절하고 NFAT2 발현을 하향 조절하기 때문에 NF-κB는 파골 세포 형성에 필수적인 것으로 입증되었습니다. NFAT2 및 c-Fos 매개 파골 세포 형성에 대한 CDP의 유익한 영향을 평가하기 위해 RANKL 및 RANK의 발현 수준을 분석했습니다. 예상대로 CDP는 RANKL 및 RANK의 발현을 하향 조절함으로써 NFAT2를 상당히 억제하고 c-Fos 수준을 자극했습니다.

한편, RANK 자체는 다운스트림 시그널링을 촉발하기 위해 TRAF6에 의해 결합되지 않는 한 고유 키나아제 특성이 결여되어 있다[3]. CDP는 또한 TRAF6의 발현을 하향 조절하여 RANKL과 RANK의 결합량이 크게 감소했습니다. OVX 쥐에 대한 CDP의 항골다공증 기전은 위의 신호 경로를 포함하고 조절자는 그림 9에 설명되어 있습니다. 간단히 말해서 CDP는 TRAF6, RANKL 및 RANK 수준을 감소시켜 PI3K/AKT 및 NF-κB를 포함한 하류 신호 경로를 억제합니다. RANKL/RANK에 의해 촉발되고 최종적으로 주요 파골세포 형성 단백질인 NFAT2 및 c-Fos의 발현 및 활동이 감소합니다. 따라서 데이터의 여러 단서는 주로 RANKL/RANK/TRAF6-매개 PI3K/AKT 및 NF-κB 경로를 통해 OVX 쥐의 뼈 대사에 대한 CDP의 유익한 효과를 암시했습니다.

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5. 결론

요약하면, C. deserticola에서 분리된 총 페닐에타노이드 배당체는 OVX 쥐의 폐경 후 골다공증에 상당한 유익한 효과를 나타냈으며, 골 손실 억제의 치료 가능성은 주로 골 형성 촉진 및 골 흡수 억제뿐만 아니라 골 항산화제 개선을 통해 이루어졌습니다. 체계; 그 기전은 RANKL/RANK/TRAF6-유도 NF-κB 활성화 및 PI3K/AKT 비활성화, c-Fos 자극 및 NFAT2 억제와 관련이 있을 수 있으며, 마지막으로 파골 세포의 분화가 억제되었습니다.

약어

AKT: 단백질 키나아제 B

ALP: 알칼리성 포스파타제

BGP: 뼈 gla-단백질

BMC: 뼈 미네랄 함량

CDP: 씨. 데저티콜라의 페닐에타노이드 배당체 분획

CK: 카텝신 K

CT: 칼시토닌

DPD: 데옥시피리디놀린

ERR : 에스트로겐 관련 수용체 알파

EV: 에스트라디올 발레레이트

GSH: 글루타치온

l-PTH: 온전한 파라토르몬

MCSF: 대식세포 콜로니 자극 인자

MDA: 말론디알데히드

NFAT2: 활성화된 T 세포의 핵 인자 c2

NF-κB: 핵 인자 카파 B

OPG: 오스테오프로테게린

OVX: 난소 절제

PhG: 페닐에타노이드 배당체

PI3K: 포스포이노시티드 3-키나제

순위: 핵 인자 카파 B의 수용체 활성제

RANKL: 핵 인자 카파 B 리간드의 수용체 활성제

ROI: 관심 영역

SOD: 슈퍼옥사이드 디스뮤타제

결핵. N: 소주수

Tb.Sp: 섬유주 분리

Tb.Th: 섬유주 두께

TCM: 중국 전통 의학

TMC: 조직 미네랄 함량

TMD: 조직 미네랄 밀도

TNF: 종양 괴사 인자

TRAF6: 종양 괴사 인자 수용체 관련 인자 6

함정: 타르타르산염 저항성 산성 포스파타제.

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데이터 가용성

이 연구 결과를 뒷받침하는 데 사용된 데이터는 요청 시 해당 작성자에게 제공됩니다.

이해 상충

저자는 이해 상충이 없었습니다.

저자의 기여

XM은 실험을 설계하고 감독했습니다. SD와 LY는 대부분의 실험을 수행하고 원고 초안을 작성했습니다. BZ와 JL은 웨스턴 블롯 분석을 수행하고 동물 실험에 참여했습니다. YD는 데이터를 분석했습니다. QT와 PY가 원고를 수정했습니다. 모든 저자는 원고를 검토했습니다. Lingling Yang과 Shuqin Ding이 동등하게 원고에 기여했습니다.

감사의 말

이 작업은 닝샤 고등 교육 과학 기술 재단(NGY2017090), 중국 국립 자연 과학 재단(No. 81560684), 닝샤 핵심 연구 개발 프로그램(2018BHF2001), 닝샤 핵심 연구 및 동양과 서양의 과학 기술 협력 발명 프로그램(Nos. 2017BY084 및 2017BY079), 중국 과학 아카데미의 West Light Foundation-Western Young Scientists 2017.

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