Cistanche Deserticola에서 분리한 총 페닐에타노이드 배당체 분획이 난소절제 쥐의 뼈 미세구조에 미치는 유익한 효과 Ⅰ

본 연구는 페닐에타노이드 배당체로부터 분리된 총 페닐에타노이드 배당체 분획의 항골다공증 활성을 평가하기 위해 고안되었다.C.데데티콜라난소절제술(OVX)로 유도된 쥐에 대한 CDP(CDP) 및 관련 메커니즘. 3개월 경구 투여 후,골밀도 감소OVX 쥐의 혈청 Ca 및 P가 회복되었고 섬유주가 악화되었습니다.뼈의 미세구조CDP(60, 120 및 240mg/kg) 개입으로 부분적으로 개선되었으며, 골흡수 마커의 활성은 하향조절되었으며, 골형성 지수의 생리활성은 상향조절되었습니다. 한편, MDA의 함량은 감소하였고, CDP 처리로 GSH는 증가하였다. 구성적으로 8개의 페닐에타노이드 글리코시드 화합물이 동일했습니다.fiCDP로 편집, 총 콘텐츠 수량fiHPLC 방법을 사용하여 50.3%로 나타났습니다. 기계적으로 CDP는 TRAF6, RANKL 및 RANK 수준을 감소시켜 RANKL/RANK/TRAF6-로 유도된 다운스트림 NF- 활성화를 억제했습니다.κB 및 PI3K/AKT 신호 전달 경로 및 궁극적으로 NFAT2 및 c-Fos의 주요 파골세포 형성 단백질의 활동을 방지합니다. 위의 모든 데이터는 CDP가 이점을 나타냈음을 암시합니다.fi시알 전자Ff 로난소를 절제한 쥐의 뼈 미세구조에 영향을 미치며, 이는Ff 로NF-와 관련이 있을 수 있습니다.κRANKL, RANK 및 TRAF6의 결합에 의해 촉발된 B 및 PI3K/AKT 신호 전달 경로.

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뼈 성장을 위한 천연 유기농 시스탄체

1. 소개

50세 이상 여성 3명 중 1명이 겪는 폐경기 골다공증은 전 세계적으로 2억 명 이상의 여성을 괴롭히는 주요 건강 위험 요인이 되고 있습니다[1]. 폐경 시 에스트로겐 수준의 급격한 감소는 일반적으로 파골세포 형성의 강화로 인해 과도한 뼈 흡수를 초래합니다. 그러면 조골세포에 의한 뼈 형성과 파골세포에 의한 뼈 형성 사이의 균형이뼈 흡수파괴되고, 가속화된 뼈 흡수로 인해 최종적으로 골다공증이 발생하고 심지어 고관절이나 척추 골절이 발생했습니다[2]. 파골세포의 분화는 핵인자 카파 B(RANK)의 수용체 활성화제가 RANK의 리간드인 RANKL에 결합함으로써 촉발되는 것으로 여겨졌다. 그러나 RANK와 RANKL의 조합은 단백질 종양 괴사 인자 수용체 관련 인자 6(TRAF6)이 결합되어 있지 않으면 활성화될 수 없으며[3], PI3K/AKT 및 NF-κB를 포함한 하류 신호 전달 경로가 자극됩니다. . 마지막으로, 활성화된 T 세포의 핵인자 c2(NFAT2)와 c-Fos의 발현이 조절되어 파골세포의 분화와 골흡수가 조절되었습니다. 따라서 파골세포의 활성화 및 분화에 직·간접적으로 관련되는 인자 및 조절인자는 골소실을 예방하는 중요한 표적으로 여겨진다.

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실제로 폐경기 골다공증 치료에 효과적인 에스트라디올 발레레이트와 같은 일부 임상 및 합성 호르몬 대체 요법 약물이 있습니다. 불행하게도 이들 중 일부는 유방암과 자궁내막암을 포함한 심각한 암의 위험을 증가시켜 임상 적용이 제한되었습니다. 따라서 효능이 있으면서도 부작용이 최소화된 다른 대안을 선택하는 것이 필요하다. 한약(TCM)과 분리된 생리 활성 화합물 및 분획물[6-9]은 폐경기 골다공증을 포함한 다양한 질병에 효과적인 것으로 입증되었습니다. 이러한 생리활성 성분 및 분획물 중에서 잠재적인 효능을 지닌 페닐에타노이드 배당체(PhG) 화합물은 골다공증 치료를 위한 유망한 제제로 여겨졌습니다[10-12]. PhG의 구조는 글리코시드 결합을 통해 α-글루코피라노스, 아피오스, 갈락토스, 람노스 또는 자일로스와 결합된 하이드록실 페닐 에틸 그룹인 신남산 아글리콘으로 구성됩니다. 이들은 Cistanche 속의 약용종에 널리 존재합니다[13]. Cistanche Deserticola YC Ma는 중국 약전에 기록된 공식 TCM이며, 중요한 TCM일 뿐만 아니라[14], C Deserticola는 부작용이 거의 없는 항노화 강장제로서 약용액 및 영양액으로 개발되어 약용액으로 승인되었습니다. 국가식품의약국. 중국 약전의 기록에 따르면 C. Deserticola는 전통적으로 근육 약화 및 요추 약화와 같은 신장 본질 결핍 문제를 치료하기 위해 원주민에 의해 사용되어 왔으며 에키나코사이드 및 아세토나이드를 포함한 페닐에타노이드 글리코사이드 화합물은 이 허브의 주요 생리 활성 성분입니다. 한의학의 "신장 뼈" 이론에 따르면, 뼈 시스템은 신장 본질에 의해 지배되며[15], 골다공증과 같은 뼈 관련 문제는 신장 본질에 영양을 공급하는 활성을 지닌 약초나 화합물에 의해 회복될 수 있습니다. 따라서 우리는 C. Deserticola에서 분리된 전체 페닐에타노이드 배당체 분획이 골다공증 치료에 적어도 부분적으로 유익하다는 가설을 세웠습니다. 따라서 현재 실험은 난소 절제술(OVX) 쥐 모델을 사용하여 우리의 가설을 검증하기 위해 고안되었습니다. 추정해야 하는 골흡수 및 형성 마커 외에도 항산화 지수와 RANKL/RANK/TRAF6- 유도 PI3K/AKT 및 NF-κB 신호 전달 경로를 사용하여 항골다공증 생체 활성의 주요 메커니즘을 조사했습니다. .

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2. 재료 및 방법

2.1. 식물 재료 및 준비.

총 30kg의 Cistanche Deserticola YC Ma 줄기가 9월 2일015 Yongning 카운티에서 좌표 106.026597 및 38.262816으로 수집되었습니다. 중국 닝샤성. 해당 약초는 Lin Dong 박사(닝샤 의과대학 약리학과)에 의해 동정되었으며 해당 표본(#20150901)이 해당 부서에 보관되어 있습니다. 제약 분석. 먼저, 70% 에탄올을 용매로 하여 환류법을 이용하여 분말화된 C. Deserticola 30.0 kg을 추출하였다. 물질 대 용매의 비율은 1:10으로 설정하였고 환류 시간은 2시간 동안 3회 수행하였다. 그런 다음, 모든 여액을 모아 60 ℃에서 감압 농축하였다. 둘째, 예비 분리를 위해 AB{15}} 거대 다공성 수지 컬럼을 사용하였고, 물 중 에탄올의 비율을 다르게 하였다(0%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%(각각 60L)를 용출에 사용했습니다. 세 번째로, 40% 및 50% 용리액을 결합하고 물에 0%, 20%, 30%, 40% 및 50% 에탄올의 용리액을 사용하는 반복적인 AB{25}} 거대 다공성 수지 컬럼을 사용하여 추가로 정제했습니다. 각 용리액은 12L였습니다. 마지막으로 40% 분획을 수집하고 감압 하에서 응축하여 C. Deserticola의 연한 노란색 침전물 페닐에타노이드 글리코시드 분획 150g을 얻었습니다(CDP, 수율은 0.5%). 생체 내 실험의 경우 0.5% CMC-Na 용매를 사용하여 CDP를 용해시켰습니다. 동물에 대한 경구 투여는 체중 100g당 1mL로 설정되었으며; 시험관 내 웨스턴 블롯 분석을 위해 CDP를 DMSO로 용해시킨 후 DMEM으로 희석하여 최종 농도 0.1 mg/mL, 0.01 mg/mL 및 0.001 mg/mL를 얻었습니다.

2.2. 화학물질 및 용제.

에스트라디올 발레레이트(EV)는 프랑스 Delpharm Lille SAS에서 생산되었습니다. 알칼리성 포스파타제(ALP),뼈 Gla-단백질(BGP), 타르타르산 저항성 산 포스파타제(TRAP) 및 데옥시피리디놀린(DPD) 가교 ELISA 키트(Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, China, 201605); 말론디알데히드(MDA, 20181221), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD, 20121218) 및 글루타티온(GSH, 20181221) 시약 키트(중국 난징 소재 Nanjing Jiancheng Biological Engineering 연구소); 중국 우한 소재 Elabscience Biotechnology Co. Ltd.의 lntact 파라토르몬(1-PTH, NEWASHE7UZ), 칼시토닌(2L9ISN7AIU) 및 에스트로겐 관련 수용체 알파(ERR, Y3AY8QEWB3) 가교 ELISA 키트; 카텝신 K ELISA 시약 키트(BioVision, America, 11300141); RANKL(GR3193842-5), RANK(AA02113656), TRAF6(2), c-Fos(AG12059411), NFAT2(AO11015648), NF-κBp65(AH04138226), PI3 키나제 p85 알파(AC09021266)의 1차 항체, AKT 1(AF05173234), -액틴(17AV0411) 및 양 고추냉이 퍼옥시다제 결합 염소 항 토끼 IgG의 2차 항체(ZSGB-BIO, 중국, 136080); 골파괴 형성 및 소태아혈청 검출을 위한 총 BCA 단백질 분석 키트 및 상업용 키트와 미국 유타주 로건 소재의 HyClone 제품인 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM); Millipore Life Sciences(Billerica, MA, USA)의 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막; 미국 메릴랜드 주 록빌 소재 Gibco의 페니실린 및 스트렙토마이신. 사용된 다른 모든 화학약품은 AR 등급이었습니다.

2.3. CDP의 HPLC 정량화.

CDP의 조성을 확인하고 정량화하기 위해 Agilent 1220 HPLC 기기를 사용했습니다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다: C18 컬럼(TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); 구배 용리에는 용매 A(아세토니트릴) 및 B(0.5% 아세트산을 함유한 물)가 포함되어 있습니다(0-10분: 17-20% A; 10-30분: 20-25% A; 및 30-40분: 25-30% A); 검출 파장은 333nm였고; 주변 온도; 유속은 1.0mL/분이었고; 샘플 주입량은 5μL였습니다. 8개의 PhG 화합물, 즉 시스타노사이드 F, 에키나코사이드, 6'-아세틸액티오사이드, 시스타노사이드 C, 시스타노사이드 A, 액티오사이드, 2'-아세틸액티오사이드 및 아이소액티오사이드가 확인되었습니다. 해당 표준물질과 외부 표준물질법을 이용하여 위 8종 PhG의 함량을 HPLC 분석을 통해 정량화하였다(Figure 1).

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그림 1: CDP의 HPLC 지문. 이 분획에서는 8개의 페닐에타노이드 배당체 화합물이 발견되었으며, 총 함량은 50.7%로 정량화되었습니다. 화합물 및 그 함량은 다음과 같았다: (1) 액티오사이드 F(3.6%), (2) 에키나코사이드(8.8%), (3) 시스타노사이드 A(5.0%), (4) 액티오사이드(13.3%), (5) 이소액티오사이드(3.3%), (6) 액티오사이드 C(3.6%), (7) 2'-아세틸액티오사이드(9.9%) 및 (8) 6'-아세틸액티오사이드(3.2%).

2.4. 동물 실험 프로토콜.

3개월 된 총 60마리의 암컷 성인 Sprague-Dawley 쥐가 Ningxia Medical University의 동물 실험 센터에서 목적되었으며, 평균 초기 체중은 약 234 ± 25g이었습니다. 쥐를 1주 동안 적응시키기 위한 표준 특정 병원균 없는 환경에 가두었습니다. 그런 다음, 모든 쥐를 마취(염소 수화물, 100 mg/kg, ip)만 하거나 가짜 난소 절제술(SHAM)을 실시하거나 두 개의 난소를 모두 제거한 후 무작위로 5개의 하위 그룹으로 나누었습니다. 비히클(0.5% CMC-0.5% CMC- Na)를 모델군(OVX)으로, 에스트라디올 발레레이트(1 mg/kg/day)를 양성군(EV)으로, CDP 60, 120, 240 mg/kg/day를 낮음(CDPL)으로 설정했습니다. 중간 용량(CDPM) 및 고용량(CDPH) 용량 그룹. 모든 쥐에게 매일 경구 투여하였고, 2주마다 전체 체중 변화에 따라 복용량을 조정하여 3개월 동안 지속하였다. 동물실험 마지막 날 대사케이지를 이용하여 24-시간의 소변을 채취하였고; 마취된 쥐의 대퇴 동맥으로부터 혈청을 수집하였고; 오른쪽 대퇴골, 경골 및 모든 장기를 해부하고 추가 분석을 위해 -80 ℃에서 보관했습니다. 우리가 수행한 동물 실험은 닝샤 의과대학 동물기관 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

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2.5. 골밀도 측정 및 Micro-CT 분석.

첫째, 이중 에너지 X선 흡수계 기계(Lunar, USA)를 사용하여 각 쥐의 오른쪽 대퇴골의 총 골밀도를 추정했습니다. 둘째, 마이크로 CT 스캐너 장치(GE, America)를 사용하여 동일한 대퇴골을 사용하여 소주골 미세 구조의 3D 이미지를 추정했습니다. 이상적인 3D 이미지를 얻기 위해 등방성 해상도는 14μm로 설정되었습니다. 각 샘플의 대퇴골 성장판에 동일한 좌표를 설정하여 관심 영역(ROI)을 선택했습니다. 및 소주 분리(Tb.Sp), 소주 수(Tb.N), 소주 두께(Tb.Th), 골 미네랄 함량(BMC), 조직 미네랄 밀도(TMD) 및 조직 미네랄 함량(TMC)을 포함한 골 형태학적 매개변수 )는 ROI를 분석하여 얻었습니다.

2.6. 혈청 및 소변 생화학 분석.

혈청 카텝신 K, TRAP, SOD 및 GSH의 활성과 혈청 PTH, 칼시토닌, ERR, MDA, BGP 및 소변 DPD의 함량은 제조업체의 지침에 따라 해당 시약 키트를 사용하여 결정되었으며, 알칼리성 포스파타제(ALP) 수준과 혈청 및 소변 칼슘(Ca) 및 인(P) 함량은 자동 기계(Ciba-Corning 550 Diag nostics Corp., Oberlin, OH, USA)를 사용하여 평가되었습니다.

2.7. 웨스턴 블롯 분석.

대식세포 콜로니 자극 인자(MCSF)와 RANKL이 첨가된 RAW 264.7 세포를 이용하여 파골세포를 유도하였다. 간단히 말하면, 1 × 107 RAW 264.7 세포를 30 ng/mL의 MCSF 및 25 ng/mL의 RANKL 존재 하에 6-웰 플레이트에서 배양했습니다. 유도 6일 후 해당 키트를 이용하여 TRAP 염색법을 이용하여 성숙한 파골세포를 확인하고 CDP(0.1, 0.01, 0.001 mg/mL를 처리하였다. , 각각) 24시간 동안; 그 후, 0.5mmol의 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 용해 완충액으로 세포를 용해시켰다. 그런 다음 용해물을 10% SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 PVDF 막으로 옮겼으며, 이를 AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos 및 -actin으로 탐색했습니다( 1:400) 5% 무지방 우유로 2시간 동안 차단한 후. 동일한 막을 벗겨내고 각각 위의 9개 해당 항체로 다시 프로빙한 다음 마지막에 Image Lab 소프트웨어로 검출했습니다. 실험은 세 번 반복되었습니다.