추상적인:이집트 만다린 오렌지(Citrus reticulata Blanco, F. Rutaceae) 종자의 식물화학적 조사는 13개의 알려진 화합물, 1-13을 제공했습니다. 분리된 화합물의 구조는 1D 및 2D NMR 및 HRESIMS 분석을 사용하여 할당되었습니다. 이러한 화합물의 약리학적 활성을 특성화하기 위해 몇 가지 통합된 가상 스크리닝 기반 및 분자 역학 시뮬레이션 기반 실험이 적용되었습니다. 그 결과 화합물 2, 3, 5는 hyaluronidase, xanthine oxidase, tyrosinase inhibitor로 추정적으로 동정되었다. 6.39 ± 0.36 ~ 73.7 ± 2.33 μM 범위의 IC50 값을 가진 유망한 히알루로니다제, 크산틴 옥시다제 및 티로시나제 억제제로서의 이러한 플라보노이드의 잠재력을 강조하기 위해 in silico 기반 실험을 검증하기 위해 후속 시험관 내 테스트를 수행했습니다. . 본 연구는 이집트 만다린 오렌지의 노폐물(즉, 그 씨앗)이 피부 건강을 증진시키는 천연 물질로서의 잠재력을 조명했습니다. 또한 통합 역도킹 기반 가상 스크리닝과 MDS 기반 실험을 통해 천연물의 생물학적 잠재력을 효율적으로 예측할 수 있음을 밝혔다.

Cistanche의 배당체는 또한 심장 및 간 조직에서 SOD의 활성을 증가시킬 수 있으며 각 조직에서 리포푸신 및 MDA의 함량을 크게 감소시켜 다양한 활성 산소 라디칼(OH-, H₂O₂ 등)을 효과적으로 제거하고 이로 인한 DNA 손상으로부터 보호합니다. OH-라디칼에 의해. Cistanche phenylethanoid glycosides는 자유 라디칼의 강력한 소거 능력, 비타민 C보다 높은 환원 능력, 정자 현탁액에서 SOD의 활동을 개선하고 MDA의 함량을 감소시키며 정자 막 기능에 대한 특정 보호 효과가 있습니다. Cistanche 다당류는 D-갈락토스에 의해 유발된 실험적으로 노화된 쥐의 적혈구 및 폐 조직에서 SOD 및 GSH-Px의 활성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 폐 및 혈장의 MDA 및 콜라겐 함량을 감소시키고 엘라스틴 함량을 증가시킬 수 있습니다. DPPH에 대한 우수한 소거 효과, 노화된 쥐의 저산소증 시간 연장, 혈청 내 SOD 활성 개선, 실험적으로 노화된 쥐의 폐의 생리학적 퇴행 지연 피부 노화 질환을 예방하고 치료하는 약물이 될 가능성이 있습니다. 동시에 Cistanche의 echinacoside는 DPPH 자유 라디칼을 제거하는 상당한 능력이 있으며 활성 산소 종을 제거하고 자유 라디칼로 인한 콜라겐 분해를 방지하는 능력이 있으며 티민 자유 라디칼 음이온 손상에 대한 우수한 복구 효과도 있습니다.

Cistanche 정제 혜택을 클릭하십시오.

【자세한 정보: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. 소개

만다린, C. reticulata는 신선한 활용을 위한 가장 주목할만한 감귤 작물 중 일부입니다[1]. 그들은 자주 '귤'로 소개됩니다. 그러나 '만다린'이 더 유명한 이름입니다. 만다린 종의 여러 잡종과 변종이 자연에 분포되어 있습니다[1]. 가장 유명하고 정교한 종은 C. unshiu Marcovitch, C. nobilis Loureiro, C. deliciosa Tenore 및 C. reticulata Blanco입니다[1,2]. 만다린은 많은 국가에서 수확되는 주요 감귤류 과일 중 하나입니다. 작물은 주로 디저트용으로 사용되지만 에센셜 오일로 인해 상당한 상업적 중요성을 가지고 있습니다[3]. 시트러스 향은 음료, 제과, 쿠키 및 디저트에 적용됩니다[4]. 또한 C. reticulata 껍질은 술의 향료로 사용된다[4].

역 도킹은 주어진 화합물 구조에 대한 잠재적인 분자 표적을 예상하기 위해 조작할 수 있는 일종의 가상 스크리닝 방법입니다. 이전에는 이 효율적인 가상 스크리닝 방법을 활용하여 여러 분리된 천연 제품에 대한 최상의 단백질 표적을 결정했습니다[5]. 그러나 이 예비 스크리닝 단계에서 얻은 도킹 점수는 단백질 표적과 쿼리 화합물 구조 사이의 구조적 상보성에 대한 일부 정보만 제공합니다[6]. 따라서 절대 결합 자유 에너지(ΔGbinding)를 포함한 분자 역학 시뮬레이션(MDS) 실험은 체외 테스트를 위해 선택할 수 있는 보다 엄격하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다. 여기에서 C. reticulata 종자를 단계별 크로마토그래피 분리하여 이 폐기물의 주요 식물 화학 물질에 대한 아이디어를 얻었습니다. 그 후 포괄적 인 역 도킹에 의해 시작되고 여러 MDS 실험으로 종료되는 단계적 in silico 기반 분석을 통해 해당 식물 화학 물질이 특정 약리학 적 효과가 있는지 조사했습니다. C. reticulata 종자에서 유래한 생리활성 피토케미컬의 잠재력은 건강 증진 물질을 위한 거대한 저장고로서 식용 과일 노폐물의 고용량에 빛을 비춰줍니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 식물 재료

C. reticulata 과일은 2021년 1월 이집트 Beni-Suef 지역에서 수집되었으며 선임 식물학자인 Abd El-Halim A. Mohammed Flora and Phytotaxonomy Research 교수가 인증했습니다. 원예연구소; 도끼; 카이로; 이집트). 과일 표본은 약리학과에서 바우처 번호 2021-BuPD 80으로 보관되었습니다. 약학대학; 베니수에프 대학교; 이집트).

2.2. 화학물질 및 시약

에틸 아세테이트(EtOAc), 메탄올(MeOH), n-헥산(n-Hex), 에탄올(EtOH), 디클로로메탄(DCM) 및 n-부탄올(n-BuOH)은 이집트 El-Nasr Company에서 구입했습니다. Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA는 NMR 분석을 위한 중수소화 용매와 HPLC, 분광 및 크로마토그래피 분석을 위한 고순도 용매(예: methanol-d4(CD3OD), dimethyl sulfoxide-d6(DMSO), 클로로포름)를 제공했습니다. -d (CDCl3), HPLC용 메탄올, HPLC 등급 물 및 HPLC 등급 아세토니트릴). 크로마토그래피 분리의 경우, Sephadex LH20(0.25–0.1 mm, GE Healthcare, Sigma-Aldrich, CA, USA) 및 실리카 겔(E-Merck, Sigma-Aldrich, CA, USA) 사용 된. 진공액체크로마토그래피는 TLC용 실리카겔(Pharmaceuticals and Chemicals; El-Nasr Company; Cairo, Egypt)을 사용하였다(VLC). 사전 코팅된 실리카 겔(E-Merck, Darmstadt, Germany)을 TLC 연구에 사용했습니다. 생성된 스폿은 110℃에서 가열한 후 파라 아니스알데하이드에 의해 확인되었다[7]. 생물학적 조사를 위한 모든 자료는 Sigma Chemical Company(SCC; CA, USA)에서 구입했습니다.

2.3. 스펙트럼 분석

NMR 신호는 1H-NMR은 400MHz, 13C-NMR은 100MHz에서 얻었다. CDCl3-d, CD3OD-d4 및 DMSO-d6 용매 피크는 참조 신호로 사용되었습니다. NMR 신호는 NMR 기계 Bruker Advance-III 400MHz(Bruker AG-Billerica, California, MA, USA)를 사용하여 획득했습니다.

Quadrupole-Time-of-Flight-Hybrid-Mass-Spectrometer (Waters, Milford, MA, USA)에 연결된 Acquity-Ultra-Performance-LiquidChromatography-machine을 사용하여 고해상도 질량 데이터를 수집했습니다. Agilent/1260-Infinity-preparative-HPLC를 사용하여 HPLC 크로마토그래피 분리를 달성했습니다.

2.4. C. reticulata 종자 추출물의 제조

C. reticulata 씨앗(1kg)을 신선하게 구입한 다음 그늘에서 공기 건조했습니다. 그 후, 분쇄기(중국 본토 허난)를 사용하여 종자를 강판으로 갈았다. 그런 다음 분말 제품을 70% EtOH(1L × 5)로 완전히 추출했습니다. 생성된 액체 추출물을 회전 증발기(Buchi-Rotavapor-R-300, ColeParmer, Vernon Hills, IL, USA)를 사용하여 진공 상태에서 45ºC로 농축하여 100 g 조 건조 추출물, 일련의 증가하는 극성 용매: n-Hex-DCMEtOAc-n-BuOH를 사용하여 분배됨. 분획물 I (24.0g), II (5.0 g), III (3.0 g), IV (6.0 g)는 분리된 유기상을 감압 증발시켜 얻었다. 모든 추출물과 분획물은 이후의 식물화학적 및 생화학적 분석을 위해 4ºC에 보관되었습니다.

2.5. C. reticulata 종자의 주요 천연물 분리 

TLC-실리카 겔 컬럼을 사용하여 분획 I(20g)을 정상 VLC에 노출시켰다. EtOAc 및 n-Hex 연속 용출(0–100%, 5% 증가)을 사용했습니다. 3개의 하위 분획물(I1–I3)은 동일한 분획물을 모아 감압 하에서 증발시켜 얻었습니다. 또 다른 실리카 겔 컬럼에서 하위 분획물 I1(1.0g)을 광범위하게 분별했습니다. 크로마토그래피 용출을 n-Hex에서 EtOAc로, 구배 혼합(0-10%, 1% 상승, 각각 100mL)으로 수행하여 화합물 13(10mg)을 제공했습니다.

하위 분획 I2(50 mg)를 실리카겔-60(100 × 1cm, 20g)에서 추가로 크로마토그래피했습니다. DCM: MeOH, 등용매 혼합물(0.5%, 500mL)을 사용하여 크로마토그래피 절차를 수행하여 화합물 8(20mg) 및 9(15mg)를 제공했습니다. 하위 분획 I3은 실리카겔 60(100 x 1cm, 20g)에서 다소 분획화되었습니다. 용출은 DCM: MeOH, 등용매 혼합물(0.5%, 500mL)을 사용하여 생성되어 10(20mg)을 제공합니다.

TLC 실리카겔 컬럼을 사용하여 분획 II(2.5g)를 노출했습니다. DCM: EtOAc(0–100퍼센트, 5퍼센트 증가)를 사용하여 샘플을 용출했습니다. 생성된 유출물은 250mL 부분으로 수용되었습니다. 동일한 분획을 얻었고 감압에서 2개의 하위 분획(II1-II2)으로 환원했습니다. 또 다른 실리카 겔 컬럼에서 하위 분획물 I1(1.0g)을 광범위하게 분별했습니다. DCM: EtOAc(0-10%, 1% 상승, 각각 100mL)(10mg)를 사용하여 화합물 5를 용출했습니다.

하위 분획 I2(50 mg)를 실리카 겔60(100 × 1cm, 20g)에서 추가로 크로마토그래피했습니다. DCM을 사용하여 크로마토그래피 용출을 MeOH에 적용하여(등용매 용출; 0.5%, 500mL) 화합물 11(20mg) 및 12(15mg)를 제공했습니다.

일반 VLC에서 분획 IV(6.0g)를 실리카겔을 사용하여 분리했습니다. DCM: EtOAc(0–100%, 5% 상승, 각각 250mL)를 사용하여 샘플을 용출했습니다. 크로마토그래피 유출물은 250mL 증분으로 수집되었습니다.

동일한 분획을 그룹화하고 감압 하에서 환원하여 5개의 하위 분획(IV1–V5)을 생성했습니다. 하위 분획 IV1, IV2, IV3 및 IV4는 MeOH로 용출되는 Sephadex-LH20 컬럼에서 약간만 크로마토그래피하여 4(30mg), 6(50mg), 7(70mg) 및 1(15mg, 하위 분획 IV5는 각각 상당히 순도가 높았습니다(10 mg).

2.6. 인 실리코 연구

2.6.1. 역 도킹

분리된 플라보노이드에 대한 가능한 분자 표적은 Protein-Data-Bank에서 전달된 거의 모든 단백질에 대한 역도킹에 따라 가상 스크리닝에 그들의 구조를 적용하여 결론을 내렸습니다. PDB.

IdTarget 온라인 기반 플랫폼이 이 단계에 사용되었습니다. 이 가상 구조 미미한 스크리닝 프로그램은 특정 역 도킹 방법, 즉 제한된 중첩 네트워크를 구성하는 DivideConquer-Docking을 사용하여 단백질 탐색을 더욱 제한합니다. 그 결과 짧은 시간에 많은 수의 도킹을 수행할 수 있다[8]. 결과 점수는 최악에서 최고까지의 등급 목록으로 설명되었습니다. 주어진 각 구조에 대한 최적의 단백질 표적을 식별하기 위해 -10kcal/mol의 친화성 점수를 컷오프 값으로 사용했습니다(표 1).

분자 역학 시뮬레이션(MDS) 실험은 이전에 Alhadrami et al.에 의해 보고된 대로 수행되었습니다. 2021 [6]. Maestro 소프트웨어의 MDS 기계(즉, Desmond v. 2.2; 독일 함부르크)는 MDS 실험을 수행하기 위해 사용되었습니다[9-11]. OPLS-Force-Field는 시뮬레이션 실행에 활용되었습니다.

단백질 구조 준비는 System-Builder 알고리즘에 의해 수행되었으며, 여기에서 단백질은 Na 플러스 및 Cl- 이온, {{ 16}}.각각 15M. 그런 다음 최적화된 모델링된 구조를 10ns 동안 예비 평형화했습니다. OPLSForce-Field에 따라 구조 준비 단계에서 리간드 구조가 자동으로 매개변수화되었습니다. 유효 부위에 히스티딘-Zn과 2 복합체를 포함하는 MMP와 같은 금속 함유 단백질은 단백질 형성 단계에서 매개변수화되어야 합니다. 계속하려면 Zn(헤테로 상태 생성)과 같은 헤테로 원자에 대해 헤테로 상태를 설정해야 합니다. 이 기능은 마에스트로의 단백질 형성 마법사의 일부입니다. 이 단계는 OPLS와 같은 역장이 아연 원자를 빠르게 관찰할 수 있도록 단백질과의 네트워크에서 헤테로원자(즉, Zn + 2)에 대한 적절한 헤테로 상태 또는 배위 공유 상태의 개발을 촉진할 것입니다. Nano-scale Molecular Dynamics 소프트웨어(NAMD 3.0) [12]에 의해 수행된 재현을 위해 모델링된 구조의 토폴로지 및 매개변수는 온라인 플랫폼 Ligand Reader 및 Modeler에 의해 결정되었습니다. Zn + 2를 제 위치에 유지하기 위해 고조파 Tcl 힘이 사용되었습니다.

결합 자유 에너지(ΔGbinding)의 계산은 이전에 Alhadrami et al. 2021 [6]. ∆Grinding은 Kim 등의 간행물에 자세히 설명되어 있는 자유 에너지 섭동(FEP) 절차[12]를 사용하여 수행되었습니다. 요컨대, 이 기술은 방정식 ∆Gbinding=∆GComplex − ∆GLigand를 사용하여 필요한 액세스 가능 에너지 ∆Gbinding을 계산합니다. 각 ∆Grinding 값은 별도의 실험에서 NAMD 프로그램을 사용하여 계산됩니다.

모든 입력 파일은 웹 사이트 CharmmGUI를 통해 준비할 수 있습니다. 그런 다음 파일을 사용하여 NAMD에서 FEP 프로토콜을 활용하여 계획된 ∆Gbinding 계산을 생성했습니다. 평형은 나중에 TIP3P 물 모델의 존재에서 NPT(300K, 1atm, Langevin-Piston-Pressure "복합체"-"리간드")에서 설정되었습니다. 나중에 각 구조에 대해 10ns FEP 시뮬레이션이 생성되었으며 최종 자유 에너지 비율에 대해 사용 가능한 에너지 양의 마지막 5ns가 계산되었습니다[12]. 최종적으로 바인딩 포즈는 VMD 프로그램을 이용하여 예상하고 평가하였다[13].

2.7. 히알루로니다제 활성의 시험관내 검정

히알루로니다제 억제 활성은 Chaiyana et al. 2019[14]. 히알루로니다아제 활성에 대한 억제 효과는 다음 방정식으로부터 추정되었다: 히알루로니다아제 억제(백분율)=(1-A/B) × 100, 여기서 A 및 B는 히알루로니다아제의 존재 또는 부재에서 처리 후의 히알루론산 특성이다. 샘플, 별도로. 양성 대조군으로 6-O-palmitoyl-Lascorbic acid를 적용하였다. 실험은 세 번 수행되었습니다.

2.8. Xanthine Oxidase 활성의 시험관 내 검정

Xanthine oxidase (XO) inhibitory potential은 앞서 설명한 방법[15]에 따라 수행하였다. XO의 산화 과정 중 과산화수소 방출로 인해 생성된 색상은 플레이트 판독기 EPOCH™ "MICROPLATE READER(BIOTEK)"를 사용하여 570nm에서 측정되었습니다. 44 마이크로리터의 크산틴 옥시다제 완충액을 2 μL의 크산틴 기질 용액 및 2 μL의 XO와 혼합했습니다. L-미모신을 양성 대조군으로 적용하였다. 이 실험은 세 번 수행되었습니다.

2.9. 티로시나제 활성의 시험관내 검정

각 플라보노이드의 티로시나제 억제 활성은 Momtaz et al. 2008[16], Nerya et al. 2003[17], Curto et al. 1999[18]. 티로시나제 억제 활성은 다음 식으로 측정하였다: 억제 활성(백분율)=(1-A/B)×100, (9) 여기서 A 및 B는 존재 또는 부재 하의 혼합물의 흡광도이다. 테스트 플라보노이드, 각각. 모든 실험은 세 번 수행되었습니다.

3. 결과 및 논의

3.1. C. reticulata 종자의 식물화학적 조사

UV, 1H 및 DEPT-Q NMR을 사용하여 문헌과 일부 실제 샘플을 비교하는 것 외에도 알려진 화합물인 kaempferol 1[19], kaempferol-40 -O- -Dglucopyranoside 2[19], kaempferol -7-O- -D-glucopyranoside 3 [19], 2-hydroxy genistein 4 [19], hesperetin 5 [19], 3000 (1000-O- - D-glucopyranosyl)-수크로스 6 [20], 6(1000 -O- -Dfructofuranosy)-30 (1"-O- -D-glucopyranosyl)-수크로스 7 [20 ], 1-O-elaidoyl-glycerol 8 [21], 1- O-oleoyl-2-palmitoyl-glycerol 9 [22], 1-O-oleoyl-glycerol 10 [ 21], (E)-3-((4-메틸 헵틸 옥시) 카르보닐)아크릴산 11 [23], (E)-3-((6-메틸 노닐 옥시) carbonyl)acrylic acid 12[23] 및 -sitosterol 13[24](그림 1)은 C. reticulata 종자의 조 에탄올 추출물에서 확인되었으며 모든 확인된 화합물 11 및 12는 처음으로 Citrus 속( 그림 1 및 S1–S28) 과일을 포함하여 C. reticulata 공중 부분에 널리 분포된 플라바논 및 플라본과 달리 플라보놀은 종자에서 플라보노이드의 주된 유형인 것으로 나타났습니다.

3.2. 인실리코 조사

분리된 화합물의 생물학적 활성을 특성화하기 위해 일련의 in-silico 기반 분석을 수행했습니다. 첫째, 플라보노이드는 잘 알려진 생리활성 식물 2차 대사산물이기 때문에 초기 가상 스크리닝 단계를 위해 분리된 플라보노이드(1-5)에 집중했습니다. 또한 나머지 분리된 화합물(6-13)은 치료 효능이 없을 가능성이 있는 일반적인 1차 대사 산물입니다.

플라보노이드 1-5의 구조는 PDB에서 호스팅되는 거의 모든 단백질에 대한 도킹 기반 가상 스크리닝을 거쳤습니다. 온라인 플랫폼, 즉 idTarget이 이 예비 가상 스크리닝 작업에 사용되었습니다[8]. 복구된 점수는 가장 큰 음수 값에서 가장 작은 값까지 목록으로 검색되었습니다. 각각의 분리된 플라보노이드(1-5)에 대한 좋은 표적을 선별하기 위한 컷아웃 값으로 -10kcal/mol의 결정적인 친화도 점수를 설정했습니다. 몇 가지 흥미로운 분자 표적이 단백질 키나아제 및 합성 효소를 포함하여 이러한 관련 화합물에 대한 좋은 표적이 될 수 있음이 밝혀졌습니다(표 1).

흥미롭게도, 이러한 플라보노이드, 히알루로니다아제, 크산틴 산화효소 및 티로시나아제 효소 간에 세 가지 일반적인 분자 표적이 보고되었습니다. 이러한 효소는 건강한 피부를 유지하는 것과 관련이 있으므로 예비 가상 스크리닝 단계에서 이러한 플라보노이드를 가능한 피부 관리 촉진제로 확인했습니다.

3.3. 분자 동역학 시뮬레이션 및 절대 결합 자유 에너지 계산

예비 도킹 기반 스크리닝 단계를 추가로 지원하기 위해 MDS 종속 방법, 즉 자유 에너지 섭동 방법을 사용하여 히알루로니다아제, 크산틴 옥시다아제 및 티로시나아제 효소와 함께 화합물 1-5의 절대 결합 자유 에너지(ΔGbinding)를 추정했습니다. FEP) [26,31].

표 2에 나타낸 바와 같이, 화합물 2, 3 및 5만이 -8.1 내지 -9.9 kcal/mol 범위의 ΔGrinding 값을 갖는 히알루로니다아제, 크산틴 옥시다아제 및 티로시나아제 효소에 대해 가장 높은 친화도를 달성할 수 있었다. 나머지 화합물은 -6kcal/mol보다 높은 ΔG결합 값을 얻었습니다.

추가 50ns MDS 실험을 수행하여 화합물 2, 3 및 5와 히알루로니다아제, 크산틴 옥시다아제 및 티로시나아제 효소의 상호작용 및 결합 안정성을 조사했습니다. 그림 2에 묘사된 바와 같이, 화합물 3과 공결정화된 리간드는 초기 도킹 포즈에서 ~2.8Å의 RMSD로 MDS 전체에 걸쳐 효소의 결합 부위 내에서 유사한 결합 안정성을 달성했습니다. 화합물 2 0의 RMSD는 MDS 전체에서 평균 3.8Å의 RMSD를 달성하기 위해 화합물 3 및 공결정화된 리간드에서 약간 더 높게 벗어나기 시작하는 28.7ns까지 화합물 3의 RMSD와 유사했습니다. 화합물 2, 3의 MDS와 공결정화된 리간드에서 파생된 마지막 스냅샷은 TYR-75, ASP-129 및 GLU-131가 H- 본딩.

xanthine oxidase와 관련하여 화합물 3은 MDS 전체에 걸쳐 활성 부위 내에서 안정적인 결합을 달성하여 공동 결정화 억제제(RMSD ~2.4Å)의 평균 RMSD에 수렴하는 2.6Å의 평균 RMSD를 기록했습니다. 화합물 3의 이러한 안정적인 결합은 분명히 LYS-771, PHE-798, GLU-802, SER-876, ARG{{ 12}}, PHE-911, ARG-912 및 THR-1010(그림 3).

마지막으로, 화합물 5는 평균 RMSD 값이 4.9Å인 50ns MDS 전체에 걸쳐 티로시나제의 활성 부위 내부에서도 안정했으며, 이는 공결정화된 억제제(RMSD ~3.8Å)보다 높았습니다. 마지막 MDS에서 파생된 스냅샷에서 볼 수 있듯이 화합물 5는 공동 결정화된 억제제와 유사하게 두 개의 Zn2 플러스 이온과 상호 작용할 수 있었습니다. 또한 LYS-198, GLY-209, TYR-362, ARG-374 및 THR-391을 포함하는 여러 H 결합으로 안정화되었습니다(그림 4 ).

【자세한 정보: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】