칼파스타틴은 자가포식 유지를 통해 안지오텐신 II 매개 족세포 손상을 예방합니다
Mar 17, 2022
자세한 정보:ali.ma@wecistanche.com
이마네 벤사다1,3, 블레즈 로빈1,3, 조엘 페레즈2, 얀 살렘쿠르1, 안나 치폰트1, 마린 카뮈1,마틸드 르무안1, 레아 귀요넷1, 그는 나사렛1, 에마뉘엘 레타베르니에2, 캐롤 에니크1,피에르 루이 타로1올리비아 르누아르1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, 파리, 프랑스; 그리고2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, 파리, 프랑스
만성 사구체 병증에서 단백뇨의 강력한 예측 가치는 사구체 fi-여과 장벽, 족세포 손상 및 사구체 흉터의 변형으로 사구체 질환의 진행을 촉진하는 안지오텐신 II의 병원성 역할뿐만 아니라 확고하게 확립되어 있습니다. 여기에서 우리는 만성 지오텐신 II 유발 고혈압이 억제된다는 것을 발견했습니다.자가포식마우스 사구체의 유출. 특히 족세포에서 Atg5(자가포식에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자)가 결실되면 단지오텐신 II에 의해 유발된 족세포병증이 가속화되고 알부민뇨증 및 사구체 경화증이 가속화됩니다. 이것은 자가포식이 이 상태에서 족세포의 주요 보호 메커니즘임을 나타냅니다. 족세포에서 안지오텐신-II 유도 칼페인 활성 억제자가포식유출. 내인성 칼페인 억제제의 형질전환 발현을 갖는 마우스의 족세포칼파스타틴더 높은 족세포를 표시자가포식기준선에서 지오텐신 II 의존성 억제에 내성이 있었습니다. 또한 지속적인 자가포식칼파스타틴제한된 족세포 손상 및 알부민뇨. 이러한 발견은 고혈압이 부분적으로 족세포 자가포식의 차단으로 이어지는 칼페인의 활성화를 통해 사구체 구조와 기능에 병원성 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 이러한 발견은 지오텐신 II 매개성 고혈압이 칼슘에 의해 유발된 칼페인 모집을 통해 자가포식을 억제하고칼파스타틴활동. 따라서 calpain 매개 감소를 방지자가포식높은 레닌-안지오텐신 시스템 활성과 관련된 신병증에 대한 유망한 새로운 치료 전략이 될 수 있습니다.
키워드: 안지오텐신 II;자가포식; 칼파스타틴; 고혈압; 족세포
번역문
자가포식의 중요한 역할을 감안할 때신장질병, 약리학적 조절자가포식여러 질병의 예방 및 치료를 위한 유망한 전략이 될 수 있습니다.신장질병. 동시에, 족세포에서 칼페인 활성의 과활성화는 족세포 기능에 해로운 영향을 미치는 것으로 밝혀진 반면 유해한 작용 기전은 확인되지 않았습니다. 여기에서 우리는 칼페인이 지오텐신 II의 유해한 작용을자가포식족세포에서 calpain 억제가 족세포 자가포식의 유지를 통해 부분적으로 족세포 질환에 대한 유망한 치료 표적이 될 수 있음을 시사합니다.
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고혈압은 진행성 만성질환의 주요 원인으로 당뇨병에 이어 두 번째신장질병1-3 및 심지어 약간의 혈압 상승도 말기 신장 질환의 독립적인 위험 요소입니다.4 점점 더 많은 실험 연구에서 발 세포의 발달에서 발세포의 중요성이 강조되고 있습니다.신장부상. 실험적 고혈압 신병증에서 발세포의 점진적인 소실과 미세혈관 변화는 기능적 신장 감소와 함께 조기에 나타납니다.5 환자에서 생존 가능한 족세포의 요 배설은 자간전증에 대한 민감하고 특이적인 마커인 것으로 나타났으며,6,7 신경화증 환자는 보다 낮은 사구체 족세포 밀도신장기증자.8,9 게다가, 사구체 질환의 진행을 촉진하는 안지오텐신 II(AngII)의 병원성 역할은 고혈압 상태뿐만 아니라 여러 사구체 질환에서도 잘 확립되어 있습니다.10-21
사구체 고혈압은 사구체 모세혈관 신장, 내피 손상 및 사구체 단백질 여과 증가를 초래하여 사구체 붕괴 및 사구체 경화증을 유발합니다. 또한 사구체 구조에 직접적인 작용을 하여 보상을 목적으로 하는 신호 조절 반응을 일으킵니다. 활성화된 전신 및 국소 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템(RAAS)은 혈관간막 증식과 혈관 투과성 인자의 합성을 촉진합니다. 동시에 족세포는 칼슘 신호를 표시하고 AngII 유형 1 수용체(AT1) 의존적 자극에 따라 모양을 변형합니다. AT1은 혈압과 염분 및 물 항상성에 대한 현저한 RAAS 관련을 매개합니다. 안지오텐신 전환 효소 억제제와 AT1 차단제는 환자의 고혈압 및 심부전 치료에 임상적으로 사용됩니다. 흥미롭게도 두 차단제는 또한신장기능.
자가포식은 특히 유사분열 후 세포29,30, 특히 족세포에서 세포 항상성의 유지에 필수적인 것으로 입증되었습니다.31-34자가포식수명이 긴 세포질 단백질 및 기능 장애 세포 소기관 35,36에 대한 리소좀 관련 분해 시스템이며 autophagosomes에서 단백질 및 세포 기관의 격리를 포함합니다. autophagosomes의 형성은 Map1lc3a/b, Beclin 1 및 Tags를 포함한 여러 유전자의 유도에 의존합니다. 37 자가포식 경로의 조절장애가 신장 노화의 발병기전과 관련되어 있다는 증거가 늘어나고 있습니다.신장급성신장손상, 다낭성신장질환, 노화, 당뇨병성 신증 등의 질환31,32,38-41
규제자가포식족세포에서 생리학적, 그리고 무엇보다 병리학적 맥락에서 잘 알려져 있지 않습니다. 우리는 최근에 족세포 자가포식이 생리학적 조건에서 라파마이신(mTOR) 조절의 기계적 표적과 무관함을 입증하여 이 세포 유형을 예외로 만듭니다.42 AT1 활성화는 세포에서 단백질 합성 및 단백질 회전율을 자극합니다. 따라서, 우리는 RAAS의 활성화가 단백질 전환 자극 및 단백질 유지에도 영향을 미칠 수 있다고 추론했습니다.
현재 연구에서 우리는 족세포에서 AngIIsignaling의 역할에 초점을 맞추었습니다.자가포식규제. 우리는 족세포에 대한 AngII의 만성 차단 효과를 매개하는 칼슘 활성화 프로테아제 칼페인을 확인했습니다.자가포식. 또한, 우리는 내인성 칼페인 억제제가칼파스타틴고혈압 중 AngII 의존성 자가포식 억제 및 족세포 손상을 예방할 수 있었습니다.
이러한 발견은 AngII 매개성 고혈압이자가포식calpastatin 활동에 의한 불균형의 경우 병원성 결과와 함께 calpain의 칼슘 유도 모집을 통해.
행동 양식
동물
칼파스타틴E. Letavernier 박사는 형질전환(CSTTg) 마우스를 친절하게 제공했습니다.43 Atg5 유전자(Nphs2.cre Atg5lox/lox)의 족세포 특이적 파괴가 있는 마우스는 Nphs2.cre 마우스44를 Atg5lox/lox와 교배하여 이전에 설명한 대로 생성되었습니다. C57BL6/J 배경의 mice45. Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스와 대조군 수컷(1{27}}~12주)이 이 연구에 사용되었습니다. 고혈압 모델은 삼투성 미니펌프(Alzet Corp, model 2006)를 통해 4-6주 동안 1 mg/kg/min의 용량으로 AngII(Sigma-Aldrich, A9525)를 피하 주입하여 유도되었습니다. 펌프는 견갑골과 고관절 사이의 등에 sc 이식되었습니다. 마우스는 음식에서 소금 보충(3% NaCl)을 받았습니다. 모든 연구에서 Atg5lox/lox(야생형[WT]) 마우스를 대조군으로 사용했습니다. 네프론 감소 모델이 있는 데옥시코르티코스테론 아세테이트(DOCA) 염의 경우, 성체 수컷 마우스는 한쪽 왼쪽 신장 절제술을 받았습니다. 신 절제술 2주 후, 그들은 21-day release(Innovative Research of America) 이식된 sc로 DOC 펠릿을 받았습니다. 첫 번째 이식 3주 후에 두 번째 펠릿이 이식되었습니다. 모든 마우스는 식수에 0.9% NaCl을 임의로 제공했고 DOC 투여 6주 후에 사망했습니다.46 실험은 프랑스 수의학 지침과 실험 동물 사용을 위해 유럽 공동체에서 공식화한 지침에 따라 수행되었습니다(L{31}}/ 609EEC) 및 프랑스 연구부 및 지역 대학 연구 윤리 위원회(APAFIS-7646 및 -22373)의 승인을 받았습니다.
1차 족세포 배양 실험
분화된 1차 족세포는 이전에 설명한 대로 배양되었습니다.47,48 간단히 말해서, 새로 분리된 신장 피질을 혼합하고 Roswell Park Memorial Institute 164{12}}(Life Technologies, 61870-044). 그런 다음 조직을 70mm 및 40mm 세포 스트레이너(BD Falcon, 352340 및 352350)에 통과시켰습니다. 40mm 세포 스트레이너에 부착된 사구체를 인산염 완충 식염수(PBS; Life Technologies, 10010023) - 0.5% 소 혈청 알부민(Eurobio, HALALB{14}})을 주입하여 압력을 가하여 제거한 다음 두 번 세척했습니다. PBS에서. 갓 분리한 사구체를 {15}Roswell Park Memorial Institute 1640(Gibco, 61870036)의 웰 디쉬에 10% 송아지 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies, 15140122)으로 보충하여 족세포가 사구체에서 빠져나갈 수 있도록 했습니다. 그리고 성장. 족세포 농축은 이전에 설명한 대로 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었습니다(보충 그림 S1). 족세포를 바필로마이신 A1(100nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793)의 부재 또는 존재하에 4시간 동안 배양하였다. 면역형광 실험을 위해 1차 족세포를 4개의 접시 라벨에 도말했습니다(Dutcher, 055071). 그런 다음 족세포를 파라포름알데히드 4%에서 10분 동안 고정하고 면역형광을 위해 처리했습니다.
칼파인 활성 분석
세포내 칼페인 활성은 이전에 설명한 대로 1차 족세포에서 결정되었습니다.50–52 총 100{3}} 세포가 10% 태아로 보충된 Roswell Park Memorial Institute 1640의 웰 조직 배양 접시에서 배양되었습니다. 송아지 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신. 표시된 배양 기간 후 배지를 4mM CaCl2를 포함하는 Krebs-Ringer HEPES bicarbonate(KRH) 용액(pH 7.4)으로 교체하고 10mM 칼페인 억제제{14}}를 포함하거나 포함하지 않고 첨가하기 전에 10분 동안 배양했습니다. 50mM 칼페인 기질 N-숙시닐-Leu-Leu-Val-Tyr-7-아미노-4-메틸 쿠마린(Sigma-Aldrich, S6510). 90-분의 인큐베이션 기간 후, 칼페인 활성은 칼페인 억제제가 있거나 없는 FL 형광(360 nm 여기 및 430 nm 방출에서 측정) 간의 차이로 결정되었습니다{29}}.
웨스턴 블롯
1차 족세포를 포스파타제 및 프로테아제 억제제를 함유하는 8{8}} ml의 방사성면역침전 분석 완충액으로 긁었습니다. 단백질 농도는 BCA Protein Assay Kit(Merck Biochemistry, 71285)를 사용하여 측정했습니다. 20마이크로그램의 단백질을 Criterion XT 프리캐스트 젤(12% Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124)에서 전기영동했습니다. 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Thermo Fischer Scientific, 88518)으로 옮겼습니다. Tris Buffer Saline 0.1% Tween(TBS-T)의 5% 우유에서 차단한 후, 막을 토끼 폴리클로날 항-LC3(1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), 토끼 폴리클로날 항-ATG5와 함께 배양했습니다. (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), 기니피그 다클론 항-Sequestosome 1(SQSTM1)/P62(1:10,000, PROGEN, GP62), 토끼 다클론 항-칼페인 1 도메인 IV(1:1000, Abcam0, ab3917 ), 토끼 다클론 항칼페인 2 도메인 I의 아미노 말단 말단(1:1000, Abcam, ab39165), 마우스 단클론 IgG1 항칼페인 4(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc{41}}), 토끼 항 포도신(1:1000, Abcam, ab50339), 기니피그 항-네프린(1:500, PROGEN, GP-N2) 및 쥐 단일클론 항튜불린(1:5000, Abcam, ab6160) 항체. 세척 후 막을 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 항체(1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077)와 함께 배양하였다. 특정 신호의 검출은 LAS 4000 기기(Fuji)에서 ECL Chemiluminescent Kit(Bio-Rad, 170-5070)를 사용하여 수행되었습니다. 정량화에는 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health)를 사용한 농도계 분석을 사용했습니다.
혈압 측정 및 생리학적 평가
쥐의 수축기 혈압은 tail-cuff 방법을 사용하여 기록되었습니다(Visitech Systems Inc., BP{1}}). 각 마우스에서 10번의 측정을 수행한 다음 평균값을 결정했습니다. 수축기 혈압은 기준선(12주령)에 측정한 다음 치료 기간이 끝날 때까지 매주 측정했습니다. 모든 마우스를 6-시간 소변 수집 동안 물에 자유롭게 접근할 수 있는 대사 우리에 넣었습니다. 비색법(Olympus, AU400)을 이용하여 분광광도법으로 요중 크레아티닌과 혈장요소 농도를 분석하였다. 소변 알부민 배설은 마우스 소변에서 알부민의 정량적 측정을 위한 특정 효소 결합 면역흡착 분석을 사용하여 측정되었습니다(Crystal Chem, 80630).
조직학
신장수확하고 4% PBS 완충 포르말린에 고정시켰다. 파라핀 포매 섹션(3-mm 두께)을 Masson'strichrome으로 염색하여 신장 형태를 평가했습니다. 신장의 이상은 사구체경화증, 간간막 확장, 세뇨관 위축 또는 깁스, 섬유증을 포함한 구성 요소 이상의 존재와 심각도에 따라 등급이 매겨졌습니다. 경화성 사구체의 비율은 50개 이상의 사구체를 블라인드 검사하여 평가했습니다.신장부분.
신장 절편 및 기본 족세포의 면역형광 염색
고정된 1차 족세포는 TBS-T 3% 소 혈청 알부민에서 차단되었고 1차 항체 기니피그 항-SQSTM1/P62(1:1000, PROGEN, GP{9}}C) 및 토끼 항 -녹색 FL 형광 단백질(GFP; 1:500, Abcam, ab290). TBS-T 헹굼 후 FL 형광단 결합 이차 항체 당나귀 항-기니피그 IgG AF{16}접합 항체(JacksonImmunoResearch, 706-585-148) 및 당나귀 항토끼 IgG AF{19}접합 항체( Invitrogen, A21206)을 적용하였다. Zeiss 2피트 형광 현미경, AxioCam HRccamera 및 Axiovision 4.3 소프트웨어를 사용하여 이미지를 촬영했습니다.
포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE)용신장, 섹션(3mm)을 탈파라핀화하고 수화하고 가열된 시트레이트 완충액(pH 6)에서 항원 검색을 수행했습니다. 그런 다음 섹션을 Triton 0.1%(Euromedex)로 투과화하고 TBS-T 3% 소 혈청 알부민에서 차단한 후 4C에서 밤새 항체 인큐베이션했습니다. 우리는 염소 항-네프린(1:100, PROGEN, GP)을 사용했습니다. -N2), 기니피그 항-SQSTM1/P62(1:1000, PROGEN, GP{17}}C), 토끼 항-GFP(1:1000, Abcam, ab290), 염소 항-포도칼릭신(PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556) 및 토끼 항-Wilm's Tumor 1(WT1;1:100, Abcam, ab192) 항체. 2차 항체는 Invitrogen의 Alexa488 및 Alexa 568 결합 항체였습니다. 핵은 Hoechst를 사용하여 파란색으로 염색되었습니다. 형광등 장착 매체(Dako, S3023)를 사용하여 슬라이드를 장착했습니다. 현미경 사진은 Zeiss Axiohot 현미경과 Axiovision 소프트웨어로 촬영했습니다. 피지의 반자동 정량화는 마우스당 최소 30개의 사구체에서 사구체 섹션당 네프린 양성 및 PODXLþ 영역의 정량화에 사용되었습니다. 족세포 수는 마우스당 최소 30개의 사구체에서 사구체 절편당 WT1þ 핵의 수로 계산되었습니다.
투과 전자 현미경 절차
신장 피질의 작은 조각(1 mm3)을 3% 글루타르알데히드 등급(Electron Microscopy Sciences)에 1~30일 동안 고정하고 PBS에서 세 번 세척했습니다. 샘플을 0.1M PBS(pH 7.4) 중 1% 사산화오스뮴0.1M(Electron Microscopy Science)에 후고정하고 물로 세척했습니다. 샘플은 알코올 등급 및 100% 프로필렌 옥사이드(Electron Microscopy Science)에서 탈수되었습니다. 수지 침투는 다음과 같이 수행되었습니다: Epikote 812와 프로필렌 옥사이드를 1:1의 비율로 30분 동안 혼합한 다음 Epikote 812와 프로필렌 옥사이드를 1:2의 비율로 혼합하여 실온에서 밤새도록 했습니다. 샘플을 100% Epikote 812의 4mm 젤라틴 캡슐에 삽입하고 60C로 가열된 오븐에서 중합했습니다. 초박형 섹션을 UFC7 울트라마이크로톰(Leica MicrosystemsGmbH)으로 절단하고 Gilder Grids 200 메쉬(Electron Microscopy Science)에 증착했습니다. 그것들은 uranyl acetate 7%(LFG Distribution)와 Reynold's lead citrate(LFG)로 대조염색되었습니다. 샘플은 획득을 위해 Digital Micrograph 소프트웨어(Gatan)로 작동되는 Orius SC1000 CCD 카메라(Gatan)가 있는 JEM1011 투과 전자 현미경(JEOL)에서 검사되었습니다.
시스탄체-신장질환
정량적 중합효소 연쇄 반응 어레이
새로 분리된 사구체를 QIAzol Lysis 시약(Qiagen)에서{0}}도 동결했습니다. 페놀 기반 방법을 사용한 총 RNA 추출은 제조업체의 권장 사항에 따라 처리되었습니다. RT2 First Strand Kit(Qiagen, 330401)를 사용하여 cDNA를 합성하고 RT2 SYBR Green qPCR Mastermix(Qiagen, 330502)를 사용하여 Custom RT2 Profiler PCR Array(Qiagen, CLAM36771C)를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행했습니다. . 정량적 PCR 플레이트는 Applied Biosystems StepOnePlus 사이클러에서 실행되었습니다. 각 어레이에는 역전사 효율과 게놈 DNA 오염을 위한 품질 관리 기능이 포함되어 있습니다. GeneGlobe Data Analysis Center(www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page)의 도움으로 2-DDCT 방법을 사용하여 정량적 PCR 분석을 수행하고 다음과 같이 표현했습니다. 유전자 발현의 Log2 배 변화로.
인실리코 단백질 분석
calpain 절단 부위의 in silico 예측은 DeepCalpain(http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD(http://ccd.biocuckoo.org) 및 CaMPDB(http:// calpain.org/) 온라인 도구. 마우스 단백질 아미노산 서열은 Uniprot(https://www.uniprot.org)에서 입수했습니다. 결과는 보충 표 S1 및 S2에서 재개됩니다.
통계 분석
모든 그래프는 개별 값과 평균±SEM을 나타냅니다. 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 9를 사용하여 수행되었습니다. 샘플이 Anderson-Darling 및 D'Agostino 정규성 테스트와 분산 동등성에 대한 F 테스트를 통과했을 때 parametricStudent t-test를 사용하여 두 그룹 간의 비교를 수행했습니다. 그렇지 않으면 비모수 Mann-Whitney 테스트가 사용되었습니다. 여러 그룹 간의 비교는 1-방식 또는 2-방식의 분산 분석을 사용한 후 Simak 보정을 사용한 다중 비교 테스트를 사용하여 수행했습니다. P < 0.05의="" 값은="" 중요한="" 것으로="" 간주되었습니다.*p="">< 0.{13}}5,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>
그림 1|안지오텐신 II(AngII) D 고염식(HSD) 유발 고혈압은 사구체 억제자가포식. (a–c) 야생형(WT) 마우스의 사구체(a,a{1}})에서 Podocalyxin(PODXL, 빨간색) 및 P62(녹색)의 면역형광, (b,b0) AngII þ HSD 6주 후의 WT 마우스 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스의 (c,c0 ) 고혈압 동안 족세포 및 족세포 특이적 ATG에서 P62의 축적을 보여줍니다{{1{{12 }}}}결핍된 마우스. 화살촉은 (a0)에서 WT의 P62þ 점을 나타냅니다. 핵은 Hoechst(파란색)로 대조염색되었습니다. 프라임이 있는 그림 하위 부분은 더 높은 배율을 나타냅니다. 막대{13}} mm. (d) 사구체 면적의 백분율로 표시되는 P62þ 면적의 관련 정량화. n=4 WT 마우스 및 n{16}} WT(AngII þ HSD 포함) 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스. 값은 개별 플롯 및 평균±SEM으로 표시됩니다. Mann-Whitney 테스트: *P=0.0159. 이 이미지의 보기를 최적화하려면 www에서 이 기사의 온라인 버전을 참조하십시오.신장-international.org.
결과
AngII D 고염식이 유발 고혈압 억제 족세포 자가포식
족세포는 높은 수준의자가포식생체 내에서 자가포식의 핵심 마커인 LC3(GFP-LC3 마우스)에 GFP 융합이 있는 형질전환 마우스에서 강력한 GFP 발현에 의해 나타난 바와 같이(보충 그림 S2A). Autophagy는 autophagosome이 지속적으로 형성되고 autophagolysosome이 분해되는 역동적인 과정입니다. 클로로퀸으로 autophagosomal 분해를 차단하면 GFPþ 점이 축적되어 족세포에서 높은 autophagic 유출을 나타냅니다(보충 그림 S2A 및 B). GFPþ 점이 autophagosomes라는 확인은 GFP 및 SQSTM1/P62에 대한 이중 면역 FL 형광에 의해 나타났습니다.자가포식(보충 그림 S2C 및 D). 다시 말하지만, 클로로퀸 처리는 GFPþ P62þ 점의 축적을 유도하여 족세포에서 중요한 자가포식 유출을 보여줍니다. 마지막으로, GFP-LC3 마우스에서 분리한 1차 족세포에서 GFP 및 P62 발현과 autophagosomal 분해의 또 다른 차단제인 bafilomycin A1 처리 하에서 GFP 및 P62 도트의 강력한 축적에 의해 높은 자가포식 유출이 시험관 내에서 보존되었습니다(보충 그림 S2E-H) .
족세포 자가포식 반응을 조절하는 고혈압의 능력은 6주 동안 고염식(HSD)과 함께 AngII를 주입한 마우스와 비고혈압 대조군에서 평가되었습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, AngII-HSD는 사구체에서 P62 축적을 유도하고 족세포에 강하게 축적되어 AngII-HSD가 족세포에 책임이 있음을 시사합니다.자가포식봉쇄(그림 1a-d). 흥미롭게도, 족세포에서 P62 축적은 족세포 자가포식이 결핍된 마우스(Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스)에서 관찰된 것과 유사했습니다. 다른 고혈압 모델인 DOC-염 모델에서 우리는 또한 질병의 시간 경과에 따라 족세포에서 점진적인 P62 축적을 관찰했습니다(보충 그림 S3).
족세포에서 특히 Atg5의 삭제는 AngII D HSD 모델에서 증가된 알부민뇨, 족세포 손실 및 사구체 손상을 초래합니다
그런 다음 여부를 조사했습니다.자가포식족세포(Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스)에서만 봉쇄는 AngII - HSD 모델에서 사구체 손상에 영향을 미칩니다. 우리는 먼저 Nphs2를 확인했습니다. cre Atg5lox/lox 마우스는 정상 혈압, 정상신장기능이 있고 이전에 보고된 바와 같이 10개월까지 사구체 조직학적 병변이 없었습니다(보충 그림 S4).32 그런 다음 Atg5lox/lox(WT) 및 Nphs2. cre Atg5lox/lox 마우스에 AngII와 HSD를 6주 동안 주입했습니다. 중요하게도, 수축기 혈압은 연구 과정 동안 AngII 주입 후 두 그룹에서 유사했지만(그림 2a), 혈압 측정에 사용된 꼬리-커프 방법은 작은 혈압 차이를 해결할 수 없을 수도 있습니다. HSD를 사용한 AngII 주입은 WT 마우스에서 요중 알부민 대 크레아티닌 비율을 현저하게 증가시켰고, 이 효과는 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스에서 더욱 크게 증가했습니다(그림 2b). 고혈압 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스도 WT 한배 새끼와 비교할 때 사구체 경화증이 유의하게 증가하는 것으로 나타났습니다(그림 2c-e). 측정된 단백뇨와 일치하여 ATG5의 족세포 결핍이 있는 마우스에서 단백질성 캐스트 및 세뇨관 확장이 훨씬 더 널리 퍼졌습니다(그림 2f-h).
그림 2|특히 족세포에서 Atg5가 제거되면 알부민뇨가 크게 증가하고,신장안지오텐신 II(AngII) 주입 D 고염 식이(HSD) 6주 후 손상 및 족세포 손실. (a) AngII - HSD의 36일 동안 Atg5lox/lox 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스의 수축기 혈압. 유전자형당 n=9 마우스. 값은 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 양방향 분산 분석(ANOVA): ns. (b–m)에서 유전자형당 n=10 마우스. (b,g,h,k)에서 값은 개별 플롯과 평균 ± SEM으로 표시됩니다. (b) AngII - HSD(계속)
그림 2|(계속) Nphs2에서 알부민뇨의 극적인 증가를 초래했습니다. cre Atg5lox/lox 마우스와 Atg5lox/lox 대조군 마우스 비교. 양방향 ANOVA: 유전자형, P=0.013; 시간, P=0.0018. (c-f) AngII - HSD 6주 후 Atg5lox/lox 대조군 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스의 사구체의 Masson 삼색 염색 섹션의 대표적인 이미지. 막대{13}} mm in (c,d). 막대{14}} mm in (e,f). (g,h) 경화성 사구체의 비율과 (h) 현미경 필드당 관상 캐스트 수의 비교(g). Mann-Whitney 테스트: **P=0.0026 in (h), ***P=0.0003 in (g). (i, j) 6주 동안 AngII - HSD 후 Atg5lox/lox 대조군 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스의 사구체에서 Wilm's Tumor 1(WT1, 빨간색) 및 Podocalyxin(PODXL, 녹색) 발현의 대표적인 면역형광 이미지. 핵은 Hoechst(파란색)로 염색되었습니다. 바{26}} mm. (k) 사구체 섹션당 WT1þ 세포 수의 정량화. Mann-Whitney 테스트: **P=0.0029 in (l,m). Atg5lox/lox 대조군 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스에서 6주 동안 AngII - HSD 후 사구체에서 CD44(녹색) 발현의 대표적인 면역형광 이미지. 핵은 Hoechst(파란색)로 염색되었습니다. 바{36}} mm. (n,o) 6주 동안 AngII - HSD 후 Atg5lox/lox 대조군 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스의 사구체 섹션의 대표적인 투과 전자 현미경 현미경 사진으로, 고혈압 Nphs2에서 족세포 발 과정 소실(화살촉)을 보여줍니다. cre Atg5lox/lox 마우스. 바{43}} mm. 유전자형당 n{44}} 마우스. 이 이미지의 보기를 최적화하려면 www.kidney-international.org에서 이 기사의 온라인 버전을 참조하십시오.
그림 3|족세포에서의 칼페인 발현 및 활성. (a) 일차 족세포에서 calpain-1, calpain-2 및 calpain-4의 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. 튜불린 발현은 정규화 역할을 합니다. (b) 칼펩틴(10mM)의 유무에 관계없이 24시간 동안 안지오텐신 II(AngII; 100nM)로 처리하거나 처리하지 않은 일차 족세포에서 칼페인 활성을 측정했습니다. n=5 독립적인 실험. 값은 개별 플롯 및 평균±SEM으로 표시됩니다. 일원 분산 분석(ANOVA): 처리, P=0.0035. Sidak의 다중 비교 테스트: AngII 대 기준선의 경우 *P=0.0128, AngII의 경우 ##P=0.0056 - 칼펩틴 대 AngII. (c) 칼페인 활성은 야생형(WT) 또는칼파스타틴AngII(100nM)를 24시간 동안 처리하거나 처리하지 않은 형질전환(CSTTg) 마우스. n=7개의 독립적인 실험. 값은 개별 플롯 및 평균±SEM으로 표시됩니다. 치료를 위해 쌍을 이루는 양방향 ANOVA: 유전자형, P=0.0483. Sidak의 다중 비교 테스트: WT AngII 대 기준선의 경우 ***P=0.0009, CSTTg AngII 대 기준선의 경우 *P=0.0420, WT 대 CSTTg의 경우 #P=0.0424 AngII. 이 이미지의 보기를 최적화하려면 www에서 이 기사의 온라인 버전을 참조하십시오.신장-international.org.
사구체당 족세포 수는 Nphs2에서 유의하게 감소했습니다. cre Atg5lox/lox 마우스는 AngII - HSD로 처리되었습니다(그림 2i–k). AngII 주입 - HSD가 있는 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스의 족세포 손상은 사구체에서 정수리 상피 세포(PEC) 활성화 마커 CD44의 발현에 의해 나타난 바와 같이 국소 및 분절 사구체 경화증으로 진행되었습니다(그림 2l 및 m). 전자 현미경 분석은 고혈압 Nphs2에서 발 돌기 소실을 포함하여 HSD와 함께 만성 AngII 주입 시 ATG5 결핍과 관련된 중요한 변화를 확인했습니다. cre Atg5lox/lox 마우스. 대조적으로, HSD로 AngII 주입 10주 후에도 WT 마우스의 족세포에서 초구조적 결함이 거의 발견되지 않았으며(그림 2n 및 o), 이는 족세포의 자가포식 활성이 AngII - HSD 유도 손상에 대한 저항에 필요함을 나타냅니다. 전체적으로 우리의 결과는 AngII þ HSD 모델에서,자가포식억제는 족세포 손상 및 손실을 악화시키고 후속적인 국소 및 분절 사구체 경화증을 유도합니다.
AngII D HSD는 자가포식 차단에 기여하는 족세포에서 칼페인 활성을 활성화합니다
칼페인 활성은 (i) 여러 세포 유형에서 AngII에 의해 활성화되고 (ii) 여러 세포 유형을 절단하는 것으로 밝혀졌습니다.자가포식관련 단백질,53 우리는 AngII-HSD-매개 자가포식 차단이 AngII-유도 칼페인 활성 증가에 기인할 수 있는지 궁금했습니다. 우리는 먼저 1차 족세포가 3가지 유비쿼터스 형태의 칼페인을 발현한다는 것을 발견했습니다(그림 3a). 그런 다음 AngII가 기본 족세포에서 칼페인 활성을 자극한다는 것을 보여주었습니다. 칼페인 활성의 이러한 증가는 선택적 칼페인 억제제에 의해 차단되었습니다(그림 3b). 우리는 추가 기능이 있는 노크인 마우스를 사용했습니다.칼파스타틴AngII - HSD 매개에서 칼페인의 역할을 평가하기 위한 이식유전자 발현(칼페인 활성 감소로 이어짐)43신장부상 및 자가포식 차단. CSTTg 마우스의 1차 족세포는 대조군 마우스의 족세포와 비교할 때 AngII에 대한 반응으로 감소된 칼페인 활성을 보여주었습니다(그림 3c). 따라서,칼파스타틴족세포의 과발현은 AngII 매개 칼페인 활성화를 감소시켰다.
우리는 다음으로 평가했습니다.자가포식CSTTg 마우스의 족세포 수준. 우리는 GFP-LC3 이식유전자를 가진 CSTTg 마우스를 생성했습니다. LC3-GFP 리포터를 사용하면 자가포식소체를 GFPþ/P62þ 점으로 계산할 수 있습니다. 자가포식 유출이 차단되면 P62가 세포의 응집체에 축적됩니다. 기저 상태에서 CSTTg GFP-LC3 마우스의 족세포에서 정상적인 GFP-LC3 마우스의 족세포보다 GFP-P62-점(그림 4a, b, e)이 적고 P62 축적이 적습니다(그림 4c, d, f). , 높은 칼파스타틴 풍부를 가진 마우스의 족세포에서 증가된 자가포식 유출을 제안합니다.
그림 4|족세포의 자가포식 유출 평가칼파스타틴트랜스제닉(CSTTg) 마우스. (a,b) 12-주령 GFP-LC3 및 CSTTg GFP-LC3 마우스의 사구체에서 녹색 FL 형광 단백질(GFP)(녹색) 및 P62(빨간색) 발현의 대표적인 면역형광 이미지. 화살촉은 GFPþ P62þ 자가포식소체를 나타냅니다. (c,d) 12-주령 GFP-LC3 및 CSTTg GFP-LC3 마우스의 사구체에서 P62(녹색) 및 포도칼릭신(PODXL, 빨간색) 발현의 대표적인 면역형광 이미지. 프라임이 있는 그림 하위 부분은 더 높은 배율을 나타냅니다. 핵은 Hoechst(파란색)로 염색되었습니다. 막대{15}} mm. (e) 족세포당 LC3þ P62þ 도트 수의 정량화. Mann-Whitney 테스트: **P{19}}.0065. (f) 사구체 섹션당 P62þ 면적의 정량화. 만-휘트니 검정: *P=0.0420. (e,f)에서 n=5 GFP-LC3 마우스와 n{28}} CSTTg GFP-LC3 마우스. 값은 개별 플롯 및 평균±SEM으로 표시됩니다. 이 이미지의 보기를 최적화하려면 www에서 이 기사의 온라인 버전을 참조하십시오.신장-international.org.
Autophagic 유출은 Western blot에서 세포질 형태의 LC3, LC{1}}I가 autophagosomal cleaved 및 phosphatidylethanolamine 결합 형태의 LC3, LC{3}}II로 전환되는 것을 측정하여 모니터링할 수 있습니다. . CSTTg 마우스의 족세포는 바필로마이신 A1의 존재 및 부재 모두에서 LC{4}}I에서 LC{5}}II로의 전환이 증가하고 P62 발현이 감소했으며(그림 5a 및 b), 이는 자가포식 유출의 증가를 나타냅니다. 칼파스타틴 과발현이 있는 족세포. 마지막으로, 클로로퀸 투여 후 족세포에서 GFP-P62-점의 축적은 GFP-LC3 마우스보다 CSTTg GFP-LC3 마우스에서 더 중요하여 다음을 확인했습니다.칼파스타틴과발현은 생체 내 족세포에서 자가포식 유출을 유도합니다(그림 5c-e). 종합하면, 우리의 데이터는 AngII가 족세포에서 칼페인 활성을 자극하여자가포식발세포에서 칼파인에 의해 억제되고, 칼파스타틴 과발현에 의한 내인성 칼페인 활성 억제는 족세포에서 자가포식 유출을 자극하기에 충분합니다.
CSTTg 마우스는 AngII D HSD로 인한 족세포 손상으로부터 보호됩니다
CSTTg 마우스는신장최소 12개월까지 변경(보충 그림 S5). 우리는 AngII - HSD 치료 동안 CSTTg 마우스에서 족세포 손상을 분석했습니다. WT 마우스는 고혈압 4주 후에 경미한 사구체 경화증과 족세포 손상을 일으켰지만, 포도칼릭신과 네프린의 비정상적 발현에 의해 나타난 바와 같이, CSTTg 마우스는 더 적은 경화성 사구체 병변을 나타내었고(그림 6a 및 b) 보존된 포도칼릭신 및 네프린 발현(그림 6c-h) . 족세포 표현형의 이러한 차이는 족세포 핵의 밀도가 WT와 고혈압 CSTTg 마우스 간에 다르지 않은 단계에서 관찰되었습니다(그림 6i-k).
그림 5|autophagosomal 분해를 차단하면 족세포 autophagic 유출이 증가함을 확인했습니다.칼파스타틴트랜스제닉(CSTTg) 마우스. (a) 야생형(WT) 또는 CSTTg 마우스의 1차 족세포에서 LC3, Sequestosome 1(SQSTM1)/P62 및 ATG5의 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. 튜불린 발현은 정규화 역할을 합니다. 족세포는 배양 정지 전 4시간 동안 바필로마이신 A1(BafA1; 100 nM)으로 처리되거나 처리되지 않았습니다. (b) LC{{10}}II/튜불린 및 P62/튜불린 비율의 정량화. n{12}} WT 마우스 및 n{13}} CSTTg 마우스 값은 개별 플롯 및 평균±SEM으로 표시됩니다. 치료를 위해 쌍을 이루는 분산의 양방향 분석: LC{15}}II/튜불린: 유전자형, P{16}}.{{3{39}}}}008; 처리, P < 0.0001;="" p62/튜불린의="" 경우:="" 유전자형,="" p{21}}.0884;="" 처리,="" p="">< 0.0001.="" sidak의="" 다중="" 비교="" 테스트:="" lc{25}}ii/튜불린의="" 경우:="" ***p="">< 0.0001="" wt="" +="" bafa1="" 대="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0.0001="" csttg="" +="" bafa1="" 대="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" wt="" þ="" bafa1="" 대="" csttg="" þ="" bafa1;="" p62/튜불린의="" 경우:="" ***p="">< 0.0001="" 대="" wt="" +="" bafa1="" 대="" wt="" -="" bafa1,="" ***p="">< 0.0001="" csttg="" +="" bafa1="" 대="" csttg="" -="" bafa1.="" (c,d)="" 12-주="" 된="" gfp-lc3="" 및="" csttg="" gfp-lc3="" 마우스의="" 사구체에서="" 녹색="" fl="" 형광="" 단백질(gfp;="" 녹색)="" 및="" p62(빨간색)="" 발현의="" 대표적인="" 면역형광="" 이미지.="" 프라임이="" 있는="" 그림="" 하위="" 부분은="" 더="" 높은="" 배율을="" 나타냅니다.="" 핵은="" hoechst(파란색)로="" 염색되었습니다.="" 바{54}}="" mm.="" 마우스를="" 죽이기="" 4시간="" 전에="" 클로로퀸(cq;="" 80mg/kg)으로="" 처리했습니다.="" 화살촉은="" gfpþ="" p62þ="" 자가포식소체를="" 나타냅니다.="" (e)="" 족세포당="" lc3þ="" p62þ="" 도트="" 수의="" 정량화.="" 유전자형당="" n{60}}="" 마우스.="" 값은="" 개별="" 플롯과="" 평균으로="">±SEM. SD가 동일한 짝을 이루지 않은 t-검정: *P=0.0302. 이 이미지의 보기를 최적화하려면 www에서 이 기사의 온라인 버전을 참조하십시오.신장-international.org.
그림 6 |칼파스타틴과발현은 안지오텐신 II(AngII) D 고염 식이(HSD) 매개 족세포 손상을 예방합니다. (a, b) AngII - HSD 6주 후 야생형(WT) 및 칼파스타틴 형질전환(CSTTg) 마우스에서 사구체의 Masson 삼색 염색 섹션의 대표적인 이미지. 바=50 mm. (c,d,f,g) AngII - HSD의 6주 후 WT 및 CSTTg 마우스에서 (c,d) Podocalyxin(PODXL) 및 (f,g) 네프린(NPHS1) 발현의 대표적인 면역형광 이미지 및 (e ,h) 관련 정량화. 막대=50 mm. (i, j) AngII - HSD의 6주 후 WT 및 CSTTg 마우스의 사구체에서 Wilm's Tumor 1(WT1; 녹색) 및 PODXL(빨간색) 발현의 대표적인 면역형광 이미지 및 (k) WT1- 수의 관련 정량화 사구체 섹션 당 세포. 핵은 Hoechst(파란색)로 염색되었습니다. 막대{11}} mm. (e,h,k)에서 값은 개별 플롯과 평균±SEM으로 표시됩니다. n{12}} WT 마우스 및 n{13}} CSTTg 마우스 동일한 SD를 갖는 짝지어지지 않은 t-검정: **P=0.0095 in (e), *P=0.0249 in (h), P=0.7891 in (k). 이 이미지의 보기를 최적화하려면 www에서 이 기사의 온라인 버전을 참조하십시오.신장-international.org.
유사하게, 고혈압 6주 후, GFP-LC3 및 CSTTg GFP-LC3 마우스는 족세포 손상을 나타내었지만 병변은 GFP-LC3 마우스에서 더 두드러졌습니다(그림 7). 소변 알부민 대 크레아티닌 비율은 AngII - HSD의 4주 후에 GFP-LC3 마우스에서 더 높았습니다(그림 7a). 족세포 수는 2개의 유전자형 간에 다르지 않았지만 네프린 발현은 GFP-LC3(대조군) 마우스에서 훨씬 더 감소했습니다(그림 7b-e). 와 상관관계칼파스타틴-매개 보호, 미세 구조 분석은 AngII - HSD로 처리한 GFP-LC3 마우스에서 경미하고 국소적인 족세포 발 돌기 소실을 보여주었지만, 사구체 기저당 발 돌기 수의 글로벌 정량화에도 불구하고 CSTTg 마우스에서 발 돌기 소실의 더 나은 보존과 함께 막(GBM) 길이는 통계적으로 다르지 않았는데, 이는 족세포 손상이 우리 모델에서 국소적이고 분절적이기 때문일 가능성이 큽니다(그림 7f–h). 참고로 대식세포와 T-림프구 침윤신장그룹 간에 다르지 않았습니다(보충 그림 S6). 종합해보면, 이러한 결과는칼파스타틴AngII - HSD로 인한 족세포 손상을 방지했습니다.
칼파스타틴 과발현은 AngII D HSD 치료 후 마우스의 족세포에서 자가포식 유출을 복원합니다
마지막으로칼파스타틴AngII - HSD 모델에서 매개된 사구체 보호는 족세포에서 자가포식 유지를 의미합니다. 흥미롭게도, 족세포에서 AngII - HSD로 유도된 P62 축적은 CSTTg 및 GFP-LC3 CSTTg 마우스에서 방지되었으며(그림 8a-d), 이는 칼파스타틴이 족세포 차단을 방지했음을 나타냅니다.자가포식. 참고로 autophagosomes의 GFPþ P62þ 점 라벨링의 수는 고혈압 GFP-LC3 및 GFP-LC3 CSTTg 마우스의 족세포에서 유사하여 AngII-HSD가 완전한 정지보다는 족세포 자가포식 유출의 감속을 유도했음을 시사합니다(그림 8e- g).
족세포 단백질에서 칼페인 절단 부위의 실리코 예측
우리는 족세포(보충 표 S1 및 S2)에서 잠재적인 calpain 표적을 예측하기 위해 몇 가지 in silico 도구를 사용했습니다. 3개의 온라인 데이터베이스가 비교되었습니다: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 및 DeepCalpain.56 In silico 분석에서 calpain에 의해 절단될 수 있는 몇 가지 족세포 단백질, 그 중 nephrin 및 podocin이 확인되었습니다. 따라서,칼파스타틴- 매개된 사구체 보호는 칼페인 효소 활성의 감소와 연결되어 일부 족세포 단백질의 분해 감소로 이어질 수 있습니다.
또한, 적어도 3자가포식-관련 단백질은 칼페인의 직접적인 표적입니다. ATG5는 칼페인에 의해 절단되어 ATG12-ATG5 복합체 형성을 방해합니다.57,58 생체 내에서 칼페인 억제제를 투여하면 자가포식 단백질 Beclin-1의 절단도 방지됩니다.59 In silico 분석 자가포식 관련 단백질의 추정 절단 부위는 칼페인이 자가포식 단백질의 효소적 절단을 통해 자가포식을 조절할 수 있다는 가설을 뒷받침합니다.
Cistanche-신장 기능
AngII + HSD로 처리된 마우스의 사구체에서 소포체(ER) 및 산화 스트레스 마커의 mRNA 발현
우리는 AngII - HSD 치료 동안 사구체에서 정량적 PCR에 의해 소포체(ER) 스트레스와 산화 스트레스를 평가했습니다(표 1). 기준선에서 우리는 WT 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스의 사구체에서 분석된 유전자의 mRNA 발현 변화를 관찰하지 못했습니다(보충 그림 S7). 고혈압 6주 후 Nphs2의 사구체. cre Atg5lox/lox 마우스는 WT 사구체와 비교하여 Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 및 Hsp90b1의 발현이 증가함에 따라 ER 스트레스 및 산화 스트레스 경로의 유전자의 다른 mRNA 프로파일을 보여 주었기 때문에자가포식족세포의 고갈은 AngII - HSD로 인한 ER 스트레스와 산화 스트레스를 선호했습니다. 반대로, CSTTg 마우스의 사구체는 ER 스트레스 및 산화 스트레스 경로의 여러 유전자의 하향 조절뿐만 아니라 일부 pro-apoptotic 유전자의 발현 감소를 나타냈다(그림 9).
종합하면, 이러한 결과는 다음을 나타냅니다.칼파스타틴과발현은 AngII - HSD로 인한 ER 및 산화 스트레스를 감소시켜 사구체 손상을 예방할 수 있습니다.
논의
현재의 연구에서 우리는 AngII - HSD 유발 고혈압에서 족세포 자가포식이 현저하게 하향 조절된다는 것을 입증했습니다. 또한, 족세포 특이적 Atg5 결실이 있는 마우스는 AngII - HSD로 인한 사구체 경화증 및 족세포 손실에 더 잘 걸리므로 다음을 보여줍니다.자가포식족세포에서 AngII - HSD로 인한 족세포 손상에서 자가포식의 중요한 역할을 강조하여 고혈압성 신병증의 발병을 예방합니다. 세포 자가포식을 조절하는 세포외 자극에 대해서는 알려진 바가 거의 없으며, 이러한 결과는 AngII에 의한 족세포 자가포식의 병태생리학적 조절에 대한 정보를 제공합니다.
대부분의 인간 사구체병증에서 족세포 족돌기 소실은 단백뇨로 이어지는 사구체 손상의 특징입니다. 자가포식은 족세포 기능을 유지하는 데 필수적인 역할을 할 가능성이 높습니다. 이러한 말단 분화 세포는 높은 비율의자가포식스트레스가 없는 상태에서도. 이전 연구에서는 AngII가 조건부로 불멸화된 쥐 족세포 세포주에서 반응성 산소 종의 생성을 통해 자가포식을 촉진한다는 것을 보여주었습니다.60 반응성 산소종 생산은 실제로 많은 세포 유형에서 자가포식의 일반적인 유도제이며 우리의 발견과 그러한 불일치에 대한 이유는 다음과 같습니다. 불분명. 이 후자의 연구와 달리, 우리는 쥐 세포주가 아닌 포도신 및 네프린 발현 및 생체내 접근법을 유지하는 쥐의 1차 배양된 족세포를 사용했습니다. 우리는 postmitotic podocytes가 비정상적으로 높은 수준의 구성 요소를 나타낸다는 이전 보고서를 확인합니다.자가포식. 자가포식 유출의 증가 또는 차단 여부를 결정하려면 리소좀 억제제의 존재 여부에 관계없이 AngII 자극 후 LC{0}}II의 증가된 양을 측정해야 합니다. 이전 연구에서는 이 현상을 무시했습니다.60
그림 7 |칼파스타틴과발현은 녹색 FL 형광 단백질(GFP)-LC3 마우스에서 안지오텐신 II(AngII) D 고염 식이(HSD) 매개 족세포 손상을 방지합니다. (a) AngII - HSD는 CSTTg(칼파스타틴 형질전환) GFP-LC3 마우스와 비교하여 GFP-LC3 마우스에서 알부민뇨의 극적인 증가를 초래했습니다. 유전자형당 n=8 ~ 13마리. 값은 개별 플롯 및 평균±SEM으로 표시됩니다. 양방향 분산 분석: 유전자형, P=0.0429; 시간, P{11}}.0165. Sidak의 다중 비교 테스트: 28일째에 GFP-LC3 대 CSTTg GFP-LC3 마우스에 대한 *P{13}}.0453. (b,c) Wilm's Tumor 1(WT1; 녹색) 및 네프린 발현의 대표적인 면역형광 이미지 (NPHS1) (빨간색) AngII 주입 - HSD 6주 후 18-주된 GFP-LC3 및 CSTTg GFP-LC3 마우스의 사구체. 핵은 Hoechst(파란색)로 염색되었습니다. 바{30}} mm. AngII 주입 - HSD 6주 후 18-주령 GFP-LC3 및 CSTTg GFP-LC3 마우스에서 사구체 섹션당 NPHS1þ 면적 및 (e) 사구체 섹션당 WT1þ 세포 수의 정량화. n{40}} GFP-LC3 마우스 및 n{43}} CSTTg GFP-LC3 마우스. 값은 개별 플롯 및 평균±SEM으로 표시됩니다. 동일한 SD를 갖는 짝지어지지 않은 t-검정: **P=0.0010 in (d), P= 0.1158 in (e). ( f, g ) AngII - HSD 6주 후 GFP-LC3 및 CSTTg GFP-LC3 마우스의 사구체의 투과 전자 현미경 이미지. 화살촉은 발 과정 소실을 나타냅니다. 바{56}} mm. (h) 사구체 기저막(GBM)의 마이크로미터당 발 돌기 수의 정량화. 유전자형당 n{57}} 마우스. 값은 개별 플롯과 평균 SEM으로 표시됩니다. 각 플롯은 1개의 연속적인 GBM 길이에 대한 GBM 마이크로미터당 족세포의 평균 수를 나타냅니다. 동일한 SD를 갖는 짝지어지지 않은 t-검정: P=0.7512. 이 이미지의 보기를 최적화하려면 www에서 이 기사의 온라인 버전을 참조하십시오.신장-international.org.
여기에서는 AngII 관류 및 HSD를 기반으로 하는 고혈압 모델을 사용했습니다. 족세포는 AT1 수용체를 나타내며 AngII와 같은 자유롭게 여과된 펩티드에 노출됩니다. 특정 RAAS. 마찬가지로, 생체 내 연구에서 족세포 손상에 대한 AngII의 효과와 AT1의 족세포 특이적 유전자 표적화에 대한 효과가 확인되어 실험적 루푸스 신염에서 사구체에서 AT1 수용체의 활성화가신장고혈압이 없는 경우 손상.66,67 Calpain 매개자가포식우리 모델의 조절 장애는 족세포에서 AngII-AT1 신호를 직접 전달하거나 고혈압의 결과일 수 있습니다. 이 질문에 대한 조기 답변을 제공할 수 있습니다. 실제로, DOC-염 모델에서 우리는 또한 고혈압 마우스의 족세포에서 P62 축적을 발견했습니다(보충 그림 S3). 이것은 이 모델의 족세포에서 자가포식 차단이 발생하며, 이는 AngII와 무관하다고 가정합니다.68 족세포에서 AT1이 선택적으로 결핍된 마우스에서 칼페인 활성 및 자가포식 유출과 관련된 족세포 손상을 평가하는 추가 연구는 그러한 조절이 족세포 자가포식의 정도는 AngII의 직접적 또는 간접적 효과에 달려 있습니다.
그림 8 |칼파스타틴과발현은 AngII(AngII) D 고염식(HSD) 유발을 방지합니다.자가포식족세포의 하향 조절. ( a, b ) 녹색 FL 형광 단백질 (GFP)-LC3 및 CSTTg (칼파스타틴트랜스제닉) AngII - HSD 6주 후 GFP-LC3 마우스. 프라임이 있는 그림 하위 부분은 더 높은 배율을 나타냅니다. 핵은 Hoechst(파란색)로 염색되었습니다. 바=50 mm. (c,d) 사구체 섹션당 P62þ 면적의 정량화. n=9 야생형(WT) 마우스 및 n=7 CSTTg 마우스(c), n=16 GFP-LC3 마우스 및 n{11}} CSTTg GFP-LC3 마우스 (d)에서. 값은 개별 플롯 및 평균±SEM으로 표시됩니다. Mann-Whitney 테스트: (c)의 **P{15}}.0033, (d)의 **P{17}}.0011 ( e, f ) AngII - HSD 6주 후 GFP-LC3 및 CSTTg GFP-LC3 마우스의 사구체에서 GFP(녹색) 및 P62(빨간색) 발현의 대표적인 면역형광 이미지. 프라임이 있는 그림 하위 부분은 더 높은 배율을 나타냅니다. 화살촉은 GFPþ P62þ 자가포식소체를 나타냅니다. (g) 족세포당 LC3þ P62þ 도트 수의 정량화. n{28}} GFP-LC3 마우스 및 n{31}} CSTTg GFP-LC3 마우스. 값은 개별 플롯 및 평균±SEM으로 표시됩니다. 동일한 SD를 갖는 짝을 이루지 않은 t-검정: P{35}}.1014. 이 이미지의 보기를 최적화하려면 www에서 이 기사의 온라인 버전을 참조하십시오.신장-international.org.
표 1|맞춤형 RT2 프로파일러 PCR 어레이
Calpain{0}} 및 calpain{1}}은 도처에 있는 전염증성 프로테아제로, 이들의 활성은 다음에 의해 제어됩니다.칼파스타틴, 그들의 특정 억제제. 실제로, 칼파스타틴은 칼페인을 선택적으로 억제하고 현재까지 다른 프로테아제는 억제하지 않습니다. Calpain 활성화는 최근에신장여러 병리학적 맥락에서 부상.69,70 칼슘 채널 수송체 일시적 수용체 전위 채널 C6은 Ca2þ/calcineurin 활성화를 통해 족세포에서 calpain{3}}을 활성화하는 것으로 밝혀졌습니다. 국소 및 분절 사구체경화증 환자의 신장은 발세포 세포골격 안정성에 중요한 일과성 수용체 전위 채널 C6 발현 증가, 칼페인 및 칼시뉴린 활성 증가, 칼페인 표적 탈린(calpain target talin{6}}) 발현 감소를 보였습니다.71 일과성 수용체 전위 채널 C6은 또한 calpain-1 및 calpain{10}}에 직접 결합합니다. 이 상호작용은 탈린 절단의 조절과 족세포의 운동성을 조절하는 데 중요합니다.72
과발현 형질전환 마우스칼파스타틴혈관 리모델링 및 AngII 의존성 염증73으로부터 보호됩니다. 사구체신염,43 패혈증,74 또는 동종이식 거부반응75 모델의 염증 및 연령 관련 염증에 대한 것입니다.76 이 마우스의 족세포 손상은 조사되지 않았습니다. Peltieret al. 의 과발현을 보여주었다.칼파스타틴따라서, CSTTg 마우스의 신장 보호는 항염증 기전에 의해 적어도 부분적으로 매개될 수 있습니다. 우리는 우리 모델에서 대식세포와 림프구 침윤을 평가하고신장글로벌 분석 시 CSTTg와 대조군 마우스 간의 염증신장백혈구 침윤(보충 그림 S6).
Calpain은 최근 자가포식 조절에 관여했으며(최근 Weber et al.53에서 검토됨)자가포식.77 여기에서 우리는 다음을 통한 칼페인 억제를 보고했습니다.칼파스타틴과발현은 (i) 고혈압 중 족세포 손상을 방지하고 (ii) 족세포에서 자가포식을 회복하여자가포식.
거의 모든 ATG 단백질은 시험관 내에서 칼페인에 의해 절단되는 것으로 나타났습니다. 78 여기서 우리는 다음과 같이 가정했다.자가포식고혈압 CSTTg 마우스의 유지는 calpain 억제에 의해 매개되었습니다. 우리의 가설을 뒷받침하기 위해, 우리는 CSTTg의 족세포가 시험관 내에서 AngII로 도전할 때 감소된 칼페인 활성을 갖는다는 것을 보여주었습니다(그림 3c). 우리는 CSTTg 마우스의 족세포에서 증가된 ATG5 단백질 수준을 발견했는데, 이는 칼파스타틴 과발현이 이 맥락에서 칼파인 매개 ATG5 절단을 방지함을 시사합니다(그림 5a). 이에 반해칼파스타틴- 매개된 칼페인 억제는 프로테아제 활성의 억제와 무관할 수 있습니다. 따라서 우리는 calpain 효소 활성과 독립적인 calpastatin에 의한 autophagy 조절을 배제할 수 없습니다.
요약하면, 이러한 발견은 이전에 인식되지 않은칼파스타틴족세포의 조절자가포식그리고 고혈압 신병증 동안 족세포 생존을 향상시키는 새로운 치료 전략의 조사를 위한 리드를 제공했습니다.
폭로
모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않았습니다.
감사의 말
이 작업은 Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale(Inserm)과 Université de Paris의 지원을 받았습니다. IB는 Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie의 대학원 펠로우십으로 지원되었습니다. OL은 유럽 당뇨병 연구를 위한 EFSD/Novo Nordisk 프로그램이 지원하는 유럽 당뇨병 연구 재단(EFSD) 상과 Société Francophone duDiabète(SFD)의 보조금을 통해 자금을 지원받았습니다. BR 및 CH는 유럽 연구 위원회 및 유럽 연합(P-LT)의 시작 보조금 107037에 의해 자금이 지원되었습니다. YS는 Fondation de France의 대학원 펠로우십에 의해 지원되었습니다.
Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac 및 ERIU970 팀(Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, France) 동물 관리 및 취급, Nicolas Sorhaindo forbiochemical 측정(ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat)에 감사드립니다. , 파리, 프랑스) 및 Alain Schmitt 및 Jean-Marc Massefor 투과 전자 현미경(Institut Cochin, Paris, France). 실리코 분석에 도움을 주신 Morgane Le Gall(Cochin 단백질 시설 3P5, 파리, 프랑스)에 감사드립니다. Véronique Oberweis, Bruno Pillard 및 Cyrille Mahieux(Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, France)의 행정 지원에 감사드립니다.
보충 자료
보충 파일(PDF)
그림 S1. 1차 족세포 배양은 족세포 마커를 발현합니다. WT 및 CSTTg 마우스의 1차 족세포 배양에서 족세포 마커 NPHS1 및 NPHS2의 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. 튜불린(TUBA)은 로딩 컨트롤 역할을 합니다. 유전자형당 n=4개의 마우스를 나타냅니다.
그림 S2. 높은 기초 수준의 족세포자가포식. (A, B) 죽이기 4시간 전에 CQ(8{11}}mg/kg)를 처리하거나 처리하지 않은 GFP-LC3 마우스의 사구체에서 GFP(녹색) 및 NPHS1(빨간색) 발현의 대표적인 면역형광 이미지. 화살촉은 GFPþ autophagosomes를 보여줍니다. (C,D) 죽이기 4시간 전에 CQ(80mg/kg)로 처리하거나 처리하지 않은 GFP-LC3 마우스의 사구체에서 GFP(녹색) 및 P62(빨간색) 발현의 대표적인 면역형광 이미지. 화살촉은 GFPþ P62þ 자가포식소체를 보여줍니다. (A-D) (0)은 더 높은 배율을 나타냅니다. 핵은 Hoechst(파란색)로 염색되었습니다. 바{12}} mm. 조건당 N{13}} 마우스(E–H) GFP-LC3 처리(F, H) 또는 처리되지 않은(E, G) GFP-LC3 마우스의 1차 족세포에서 GFP(녹색) 및 P62(빨간색) 발현의 대표적인 면역형광 이미지 ) 4시간 동안 바피필로마이신 A1(100nM)과 함께. 조건당 N{20}} 마우스.
그림 S3. P62는 고혈압의 DOC-염 모델에서 족세포에 축적됩니다. (A-C) DOC-염 모델의 2-6주 후 WT 마우스의 사구체에서 P62(녹색) 및 PODXL(빨간색) 발현의 대표적인 면역형광 이미지. (0 )는 더 높은 배율을 나타냅니다. 핵은 Hoechst(파란색)로 염색되었습니다. 바 ¼ 50mm. (D) 족세포 면적당 P62 면적의 정량화(백분율). 조건당 N{10}}-6마리의 마우스. 일원 분산 분석: 시간 P{13}}.0059, Sidak의 다중 비교 테스트: D42 대 D14 **P{17}}.0055, D28 대 D14 P{21}}.8590.
그림 S4. 족세포자가포식족세포 발달에 필수적입니다. (A) 수축기 혈압, (B) 소변 알부민 대 크레아티닌 비율, (C) Atg5lox/lox 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스의 혈액 요소 질소 수준. N=5-유전자형당 마우스 6마리. 값은 개별 플롯 및 평균으로 표시됩니다.±SEM. Mann-Whitney 검정: P=0.7273(A), P=0.4286(B) 및 P=0.6623(C). (D–E) Atg5lox/lox 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스의 사구체의 Masson 삼색 염색 섹션의 대표적인 이미지. (F-G) Atg5lox/lox 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스에서 PODXL(녹색) 및 WT1(빨간색) 발현의 대표적인 면역형광 이미지. 핵은 Hoechst(파란색)로 염색되었습니다. (D–G) 막대{14}} mm. N=유전자형당 6마리의 마우스. (H–I) Atg5lox/lox 및 Nphs2.cre Atg5lox/lox 마우스의 사구체 투과 전자 현미경 섹션의 대표적인 현미경 사진. 바{19}} mm. 유전자형당 N{20}} 마우스.
그림 S5.칼파스타틴과도한 표현은 영향을 미치지 않습니다신장기준선에서 기능. (A) 12-주령 GFP-LC3 및 CSTTg GFP-LC3 마우스의 혈액 요소 질소 및 (B) 혈장 알부민 수준. N=5 GFP-LC3 및 N=6 CSTTg GFP-LC3. 값은 개별 플롯 및 평균으로 표시됩니다.±SEM. Mann-Whitney 테스트: P=0.6623(A) 및 P=0.9307(B). (C,D) GFP-LC3 및 CSTTg GFP-LC3 마우스의 사구체의 Masson 삼색 염색 섹션의 대표적인 이미지. (E–H) GFP-LC3 및 CSTTg GFP-LC3 마우스에서 PODXL(E, F) 및 NPHS1(G, H) 발현의 대표적인 면역형광 이미지. (C–H) 바{14}} mm. (I, J) 사구체 섹션당 PODXL 및 NPHS1 면적의 관련 정량화. N{16}} GFP-LC3 및 N{19}} CSTTg GFP-LC3. 값은 개별 플롯 및 평균으로 표시됩니다.±SEM. Mann-Whitney 테스트: P=0.1898(A) 및 P=0.8413(B).
Cistanche-신장 기능
그림 S6.칼파스타틴과발현은 전체 신장 염증에 영향을 미치지 않습니다. 안지오텐신 II -HSD 6주 후 GFP-LC3 및 CSTTg GFP-LC3 마우스에서 F4/80(A, B) 및 CD3(D-E) 발현의 대표적인 면역조직화학. 바{8}} mm. (C, F) F4/80 및 CD3 면적당 관련 정량화신장부분. N=7 CSTTg GFP-LC3 및 N=8 GFP-LC3 마우스. 값은 개별 플롯으로 표시되며 SEM을 의미합니다. 만-휘트니 검정: P=0.3969(C) P= 0.3357(F).
그림 S7. 족세포자가포식deficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
표 S1. 칼파인 절단 부위의 인 실리코(in silico) 예측. Calpain 절단 부위는 GPS-CCD(http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB(HTTP://calpain.org) 및 DeepCalpain Predict(http://deepcalpain.org)를 사용하여 족세포 관련 및 자가포식 관련 단백질에서 예측되었습니다. 암바이오.info/help.php). 보조 파일(엑셀)
보충 표 S2. calpain 절단 부위의 in silico 예측의 전체 파일입니다. Calpain 절단 부위는 족세포 관련 및자가포식-GPS-CCD(http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB(http://calpain.org) 및 DeepCalpain Predict(http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php)와 관련된 단백질. GPS-CCD 및 DeepCalpain Predict에 대한 각 단백질에 대한 예측 절단 사이트가 재개됩니다.
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