신장 발달 중 네프론 전구 세포의 염색질 접근성 및 MicroRNA 발현
Mar 11, 2022
자세한 정보:ali.ma@wecistanche.com
앤드류 클럭스턴1,2,3, 앤드류 보드나2,3, 데보라 몰타 세르퀘이라2,3, 위렝푸아2,5,6, 알리사 롤러8,9,10, 크리스티 보그스7, 안드레아스 페닝8,10,재클린 호2,3*그리고 데니스 코스트카1,4*
1미국 펜실베니아 피츠버그 피츠버그 의과대학 발달생물학과2미국 펜실베니아주 피츠버그 피츠버그 UPMC 아동 병원 Rangos Research Center3미국 펜실베니아 피츠버그대학교 의과대학 신장내과 소아과4전산 및 시스템 생물학과 및 피츠버그 진화 생물학 및 의학 센터, 피츠버그 의과 대학, 피츠버그, 펜실베니아, 미국5미국 펜실베니아주 피츠버그 피츠버그 UPMC 아동병원 소아과 유전 및 유전체 의학부6미국 펜실베니아 주 피츠버그 피츠버그 UPMC 아동 병원 임상 생화학 유전학 연구실 병리과7미국 펜실베니아주 피츠버그 피츠버그 의과대학 소아과, 위장병학, 간 및 영양학부8전산생물학,9생물학 및10미국 펜실베니아주 피츠버그 카네기멜론대학교 신경과학연구소
추상적인
포유류 네프론은네프론 전구 세포, 그리고 이들 세포의 전사체(transcriptome)의 변화는 네프론 수의 중요한 결정 인자인 신생식의 정지에 기여합니다. microRNA(miRNA) 발현을 특성화하고 추정되는 cis 조절 영역을 식별하기 위해 마우스에서 네프론 전구 세포를 수집했습니다.신장배아 일 14.5 및 출생 후 0일에 작은 RNA 발현 및 트랜스포제 액세스 가능한 염색질을 분석했습니다. 우리는 1,104개의 miRNA(발현 변화가 있는 114개)와 46,374개의 염색질 접근 가능 영역(2,103개 변화가 있는 접근 불가)의 발현을 감지했습니다. 게놈 전체에서 당사의 데이터는 세포 분화, 세포 이동, 세포외 기질 상호작용 및 발달 신호 전달 경로와 같은 프로세스를 강조합니다. 또한, 그들은 네프론 전구 세포 분화에 역할을 하는 두 유전자인 Eya1 및 Pax8에 대한 새로운 후보 시스 조절 요소를 식별합니다. 마지막으로 let{15}}p, miR{16}}b{17}}p, miR{18}}a{19}}p, miR{{ 20}}p, 후보 시스 조절 요소 및 표적 유전자 포함. 이러한 분석은 네프론 전구체에서 miRNA에 대한 새로운 추정 시스 조절 유전자좌를 강조합니다.
소개
의 기능적 단위신장네프론은 노폐물을 걸러내고 체내의 물, 산-염기 및 전해질의 정상적인 항상성을 유지하는 역할을 합니다. 네프론 수는 인간에서 광범위하게 다양하며(일반적으로 네프론이 20만 개에서 100만 개 이상(Hughson et al., 2003)) 인간에서는 출생 전에 설정됩니다(쥐의 경우 대략 출생 후 2-3)(Hartman et al. ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)). 네프론은 출생 후 재생될 수 없으며, 네프론 기질의 감소는 만성 신장 질환 및 고혈압의 위험 증가와 관련이 있습니다(Bertram et al., 2011). 차례로 네프론 수는 대부분 다음과 같은 세포 집단에 의해 결정됩니다.네프론 전구 세포(Cebrian et al., 2014b). 후기 단계에서는신장발달에 따라 네프론 전구 세포는 분화 경향을 증가시켜 점차적으로 개체군을 고갈시키고 궁극적으로 신장 형성의 중단을 표시합니다(Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). nephrogenesis의 중단을 조절하는 메커니즘을 이해하는 것은 nephron 엔다우먼트 및 후속 신장 질환의 위험을 결정하는 데 중요한 의미를 갖습니다.
동안신장개발, 자가 재생 Cited1 plus /Six2 plus 네프론 전구세포는 Cited{3}}/Six2 plus 전구세포가 프라이밍되도록 유도되고, 이후 Wnt9b/-catenin(McMahon)에 반응하여 신장 소포를 발현하는 Wnt로 분화 et al., 2016; Rumballe et al., 2011). 초기 네프론 전구체 대 후기 네프론 전구체의 고유 전사 변화에는 줄기 세포 노화, 특히 mTor 및 그 억제인자 하마르틴에 영향을 미치는 유전자 및 경로가 포함됩니다(S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018). 실제로, 하마르틴은 자기 재생 신호에 대해 네프론 전구 세포를 둔감하게 하는 것으로 생각되며, 이러한 방식으로 신장 생성 중단에 기여합니다(S. Chen et al., 2015). 초기 네프론 전구체가 자가 재생 경향이 더 크다는 아이디어와 일치하게, 후기 네프론 전구체와 비교할 때 Six2 및 Wt1을 포함한 코어 네프론 전구체 세포 전사 인자의 결합 부위에 대한 염색질 접근성이 풍부하다는 관찰이 있습니다(Hilliard et al. , 2019). 이러한 전사 인자는 게놈의 "조절 핫스팟"에 위치한 인핸서 서열에 결합하는 것으로 나타났습니다(O'Brien et al., 2018). nephron progenitors의 유도는 nephrogenesis 프로그램의 활성화를 위해 준비된 유전자에서 Lef1/Tcf7 복합체의 활성화를 초래하는 증가하는 -catenin 수준으로 인해 발생하며(Park et al., 2012), Tcf7l1 및 Tcf7l2와 복합체를 형성하는 것으로 제안되었습니다. 유전자 활성화를 촉진하는 조절 염색질 루프를 설정하고 유지합니다(Guo et al., 2021).
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최근 연구에서는 신생식의 중단을 조절하는 microRNA(miRNA)가 관련되어 있습니다. miRNA는 RISC(RNA-induced silencing complex)를 통한 감소된 번역 또는 향상된 분해를 위해 전령-RNA 전사체(mRNA)를 표적으로 하는 짧은 비암호화 RNA 분자입니다(Bartel, 2009). 단백질 Lin28b는 let{5}miRNA 계열의 알려진 억제인자입니다(Heo et al., 2008). Lin28b 발현은 신생식이 진행됨에 따라 nephron progenitors에서 감소하며, 이는 let{8}} miRNA family의 발현 증가와 일치합니다(Yermalovich et al., 2019). 또한 Wt 계통에서 Lin28b 발현의 조건부 유도는 신생식을 연장하기에 충분한 let{12} miRNA의 억제를 초래합니다(Yermalovich et al., 2019). 다른 miRNA가 신생식의 타이밍을 조절하는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 또한, 신생 동안 긴 비암호화 RNA 발현을 조절하는 인핸서가 확인되었지만(Nishikawa et al., 2019), 네프론 전구체에서 miRNA 발현을 조절하는 것으로 나타난 것은 없습니다.
이 연구에서 우리는 잠재적인 시스 조절 기능과 함께 신생의 중단에 기여하는 새로운 miRNA를 동시에 식별하고자 했습니다. 따라서 배아 14.5일(E14.5)과 출생 후 0일(P0) 사이의 miRNA 발현 및 염색질 접근성의 변화를 관찰하기 위해 1차 및 미계대지에서 일치하는 mRNA-seq 및 ATAC-seq 데이터 세트를 생성했습니다.네프론 전구 세포이 두 시점에서. 우리는 에서 차등적으로 발현되는 114개의 miRNA를 확인했습니다.네프론 전구 세포이러한 두 시점과 DAR(Differentially Accessible Region)이라고 하는 2,103개의 염색질 접근성 변화 영역 사이에 있습니다. DAR의 게놈 위치뿐만 아니라 크게 변화하는 miRNA의 예측된 유전자 표적에 대한 농축 분석은 상피 세포 분화, 세포 이동, 세포외 기질 상호 작용 및 Wnt, Notch 및 TGF-신호와 같은 주요 발달 신호 전달 경로에 영향을 미치는 경로를 암시합니다. . 우리는 염색질에서 접근성의 중요한 변화를 관찰하고 네프론 전구 세포에서 유전자 Eya1 및 Pax8에 대한 추정 인핸서로서 두 개의 게놈 영역을 연루하는 여러 줄의 증거를 제시합니다. 마지막으로 let-7-5p, miR{8}}b-5p, miR{10}}a{를 포함한 33쌍의 miRNA 및 DAR에 대한 일관된 염색질 접근성 및 miRNA 발현 변화를 확인했습니다. {11}}p 및 miR{12}}p, 그리고 차등적으로 발현되는 miRNA에 대해 네프론 전구세포에서 발현되는 추정 표적 유전자를 제시합니다.
결과
E14.5 및 P0에서 네프론 전구 세포 집단의 분리신장
네프론 전구 세포E14.5 또는 P0에서 Itg 8에 대한 양성 선택에 의해 분리되었고, 각 샘플을 나누어 mRNA-seq, ATAC-seq 및 품질 관리를 수행했습니다(보충 그림 1 AB). 정량적 PCR(qRT-PCR)은 네프론 전구체 마커 유전자 Six2 및 Cited1(Huang et al., 2016)이 전체에 비해 분리된 네프론 전구체 샘플에서 높게 발현됨을 확인했습니다.신장, 다른 세포 유형(요관 봉오리(Caleb) 포함)(Cebrian et al., 2{{1{16}}}}14a), 내피 세포(Pecan)(Kobayashi et al., 2008)에 대한 마커보다 더 그렇습니다. 신장 기질(Pdgfr)(S. Chen et al., 2015) 및 신장 소포(Lhx1)(Brunskill et al., 2014)(보충 그림 1C) 성별과 관련하여 E14.5 샘플에 사용된 쓰레기는 27% ~ 50% 암컷, P0 샘플의 새끼는 31% ~ 75% 암컷 평균 E14.5 샘플은 38% 암컷, P0 샘플은 49% 암컷이었습니다(보충 그림 1D). -일치하는 네프론 전구 세포 집단을 통해 분석 가능염색질 접근성및 2개의 시점(E14.5 및 P{3}})에서 동일한 발달 단계에서 작은 RNA 발현.
초기 및 후기 네프론 전구체는 뚜렷한 miRNA 전사 프로필을 가지고 있습니다.
Small-RNA 시퀀싱은 1,1{6}}4개의 알려진 miRNA 전사체를 감지하고 E14.5와 P{1{15}}}} 샘플 사이에서 발현에 상당한 변화를 보이는 114개의 miRNA를 확인했습니다(오발견율( FDR)=0.{19}}5, 보충 표 1). 차등적으로 발현된 miRNA의 절반은 E14.5에 비해 P{22}}에서 증가된 발현을 나타내며, 주성분 분석은 P0에 비해 E14.5 샘플 간의 miRNA 발현에서 더 큰 균질성을 강조합니다(그림 1A). 계층적 클러스터링은 각각 E14.5와 P{37}} 사이의 발현 증가 및 감소로 miRNA의 명확한 그룹화를 보여줍니다(그림 1B). let{21} miRNA 계열 구성원은 감지된 miRNA 중 가장 많이 발현되는 miRNA이며, 유의한 변화가 있는 모든 계열 구성원은 P0에서 발현 증가를 나타냅니다(데이터는 표시되지 않음). 이는 Lin28b 발현의 감소가 신생 과정에 걸쳐 let{24}} 패밀리 발현의 광범위한 증가로 이어진다는 결과와 일치합니다(Yermalovich et al., 2019). P0에서 훨씬 더 높은 발현을 보이는 다른 miRNA에는 족세포 분화에 영향을 미치는 것으로 알려진 miR{28}} 계열의 구성원인 miR{27}}p와 두 miR{30 }}a-5p 및 miR-125b-5p. 이들 중 후자의 두 가지는 서로 다른 세포 환경에서 Lin28 전사체를 억제하는 것으로 알려져 있습니다(Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). P0에서 현저히 낮은 발현을 보이는 miRNA에는 혈관신생-(S. Wang et al., 2008) 및 증식 촉진(Schober et al., 2014) miR{41}}가 포함됩니다.
DIANA miRPath 도구는 마이크로 T-CDS(Vlachos et al., 2{4}}15)에서 예측한 대로 각각의 유전자 표적을 기반으로 miRNA의 KEGG 경로 분석을 가능하게 합니다. 우리는 E14.5와 P{26}}(위 또는 아래) 사이의 발현 변화가 가장 큰 miRNA가 신생에서 핵심 역할을 하는 경로를 조절하는 miRNA임을 발견했습니다(그림 1C, 보충 그림 2). 예를 들어, Tgf-는 네프론 전구 세포 분화를 촉진하기 위해 주변 기질 세포에 의해 분비되며(Rowan et al., 2{{5{52}}}}18), 우리는 "TGF- 신호 전달 경로"(KEGG 경로 mmu04350, p-값 1.45e{14}}). "MAPK 신호 전달 경로"(mmu04010)는 분화를 위한 네프론 전구체의 구성 및 프라이밍에 영향을 미치며 Itg 8을 통해 세포외 기질(ECM)과의 상호작용을 조절합니다(Ihermann-Hella et al., 2018). 우리는 이 MAPK 신호 전달 경로에서 서로 다른 유전자를 표적으로 하는 상향 및 하향 조절된 miRNA의 상당수에 주목합니다(상위 및 하향 목록의 p-값은 각각 3.5e- 6 및 3.0e- 4). . 마지막으로, KEGG 경로 "세포외 기질(ECM) 수용체 상호작용"(mmu04512)은 확인된 가장 유의하게 풍부한 경로이며, 그 구성 유전자는 시간이 지남에 따라 발현이 증가하는 miRNA에 의해 훨씬 더 유의하게 표적화됩니다(p-값 7.4e{ {32}} 증가 중 miRNA 대 1.1e{35}} 감소). ECM 관련 유전자는 miR{37}}a{38}}p, miR{39}}a{40}}p, miR를 포함하여 우리가 감지하는 가장 고도로 발현되고 크게 증가하는 miRNA의 표적이 됩니다. -125a-5p, let-7f{44}}p. 특히 miR{45}}a{46}}p는 샘플에서 가장 많이 발현되는 miRNA이며 E14.5와 P0 사이에서 8-배 증가합니다. P0에서 발현이 증가된 miRNA(TargetScan(Agarwal et al., 2015) 사용)의 예측된 표적이었던 유전자 전사체에는 자가 재생 및 분화를 위한 MAPK/AP1과 Six2/-카테닌 경로 사이의 제안된 분자 연결인 Bach2가 포함됩니다. 각각 네프론 전구체에서(Hilliard et al., 2019).
네프론 전구 세포에서 차등적으로 발현된 miRNA의 추정 표적을 식별하기 위해 miRDB(Y. Chen & Wang, 2{10}}20)에서 제공되는 miRNA의 컴퓨터 주석과 모르타르 염기(HY Huang et al., 2020), 이전에 생성된 E14.5 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터세트(Bais et al., 2020). 따라서, 우리는 자가 재생 및 프라이밍된 네프론 전구체 사이의 표적 유전자 발현의 상응하는 변화와 함께 네프론 전구체에서 E14.5와 P0 사이의 miR의 차등 발현을 기반으로 하는 잠재적인 miRNA-mRNA 상호작용 목록을 생성했습니다. 분화 네프론 전구 (그림 2). 우리의 분석에 따르면 Meis2 및 Hmga2는 네프론 전구 세포에서 let{15}} miRNA의{15}} 계열의 잠재적 표적이며, Meis2 및 Hmga2의 발현 감소는 let{19}} 계열 구성원의 발현 증가와 관련이 있습니다. 분화 또는 노화 네프론 전구. 전사인자 Meis2는 nephron progenitors와 신장 기질에서 강하게 발현된다.신장발달(Lam et al., 2014) 및 다른 맥락에서 세포 증식의 조절과 관련이 있습니다(Abruzzese et al., 2019). Hmga2는 비히스톤 염색질 결합 단백질로 줄기세포에서 높게 발현되며 다양한 중간엽 종양과 관련이 있다(Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014). 유사하게, miR-34b-5p, miR-983p 및 miR{10}}a{11}}p의 발현 감소와 관련된 Jag1 발현의 증가가 있습니다. 또는 노화된 네프론 전구체(그림 2). Jag1은 네프론 전구체가 분화함에 따라 발현이 증가하는 Notch 신호전달의 핵심 리간드입니다(Chung et al., 2016). 자가 재생, 프라이밍 및 분화 네프론 전구체 사이의 발현 변화가 있는 유전자에 대한 모든 예측 또는 주석이 달린 miRNA 표적은 보충 자료에서 사용할 수 있습니다.
그림 1. E14.5와 P{3}} nephron progenitors 사이의 miRNA 발현의 실질적인 변화.A) 주성분 분석은 발달 시점이 miRNA 발현 변화의 주요 원인임을 보여줍니다. B) 크게 변화하는 모든 miRNA의 상대적 발현을 나타내는 히트맵. 왼쪽에 E14.5 샘플이 포함된 열은 밝은 녹색으로 주석이 지정되고 오른쪽에 P0 샘플이 포함된 열은 짙은 녹색으로 주석이 지정됩니다. C) 상향 및 하향 조절된 miRNA의 예측된 유전자 표적 중 특정 KEGG 경로의 유전자 농축(각각 빨간색 및 파란색 막대). 포함된 최소 p-값은 1e{11}}입니다.
그림 2. 네프론 전구 세포 노화 및 분화에서 가능한 역할과 miRNA-mRNA 상호작용. miRNA(원) 및 mRNA(사각형)가 표시됩니다. E14.5와 P{4}} 사이에서 발현이 증가된 miRNA는 빨간색으로 표시되고, 감소하는 miRNA는 파란색으로 표시됩니다. 자가 재생, 프라이밍 또는 분화 사이의 발현 증가와 함께 주석이 달린 표적 유전자(mirDB 및 mir TarBase에서)네프론 전구 세포(Bais et al., 2020)은 빨간색으로 표시되고 mRNA는 파란색으로 감소하는 발현으로 표시됩니다. 관찰된 표현 변화와 일치하지 않는 mirDB 및 mirTarDB의 에지는 생략되었지만 보충 표 2에 포함되어 있습니다.
초기 및 후기 네프론 전구체는 뚜렷한 염색질 환경을 가지고 있습니다.
E14.5 및 P0 네프론 전구체의 ATAC-seq 데이터를 통해 접근 가능한 염색질의 46,374개 영역을 식별할 수 있었습니다. 22}}.1, 샘플 및 시점에 걸쳐 결합된 (보충 그림 3C, 보충 표 3) 참조 우리의 데이터는 ENCODE 프로젝트의 ATAC-seq 지침(ENCODE, nd)을 준수합니다(보충 그림 3A, B) 무작위 대조군에서 볼 수 있는 것보다 IDR 피크 사이에서 증가된 보존 비율을 관찰합니다(보충 그림 3 D) 우리가 보고한 IDR 중 3,576개에는 VISTA(Visel et al., 2007)에 문서화된 인핸서가 포함되어 있습니다. FANTOM5(de Rie et al., 2017) 인핸서 데이터베이스 및 13,495에는 EnhancerAtlas 2.0(Gao & Qian, 2020)에 따라 하나 이상의 마우스 조직 또는 세포 유형에서 예측된 조절 역할을 가진 DNA 서열이 포함되어 있습니다.
주성분 분석(샘플 간의 성별 차이에 대해 조정됨)은 발달 시점별로 샘플을 명확하게 그룹화한 것으로 나타났습니다(그림 3A). 염색질 접근성의 변화가 있는 게놈 유전자좌를 식별하기 위해 E14.5와 P{4}} 샘플 간의 ATAC-seq 신호를 비교했습니다. FDR을 1{16}}퍼센트로 제어하는 2,1{11}}3개의 DAR을 관찰했습니다. 이 중 1,323개(55%)는 E14.5에 비해 P0에서 향상된 접근성을 보여주었으며 계층적 클러스터링은 각각 E14.5와 P0 사이에서 열리고 닫히는 DAR 간의 명확한 구별을 보여주었습니다(그림 3B).
HINT를 사용하여 전사 인자 발자국을 식별하고 HOCOMOCO 11 데이터베이스의 모티프를 사용하여 DNA 결합 단백질과 일치시켰습니다(Kulakovskiy et al., 2{5}}18). 테스트한 431개의 모티프 중에서 신생과 관련된 여러 전사 인자 단백질의 발자국을 포함하는 DAR은 E14.5와 P{7}} 사이에서 접근성이 증가함을 보여줍니다. 평균적으로 접근성이 증가하는 DAR에 존재하는 발자국 중 상위 6개는 Pax8({{1{12}}}}.15), Six2({15}}.14), Cebpd와 일치하는 전사 인자 발자국에 속합니다. (0.13), Six4(0.13), Jun(0.12), Fos(0.11). 닫는 DAR에 주석이 달린 발자국에는 전사 인자 E2F2 및 E2F4가 포함되며, 이는 세포 주기 진행에 영향을 미치고(Gaudet et al., 2011) 다른 세포 상황에서 세포 증식을 촉진하는 것으로 알려져 있습니다(D. Wang et al., 2000)(보충 그림 4).
DAR 열기 및 닫기의 생물학적 맥락을 평가하기 위해 GREAT(Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool)(McLean et al., 2010)를 사용하여 관련 변화하는 염색질 영역이 강화된 유전자 세트를 강조 표시했습니다. 이러한 접근 방식을 통해 우리는 네프론 전구체 발달과 밀접하게 연결된 유전자 온톨로지(GO) 생물학적 프로세스를 식별합니다. 특히 개방 DAR 중 가장 풍부한 프로세스는 "상피 세포 분화 조절"(GO:0030856, Binomial Q-value {{3 }}.5e-5) 및 "상피 세포 분화의 양성 조절"(GO:0030858, 이항 Q-값=5e-3)이 상위 10위 안에 가장 많이 농축되어 있습니다( 보충 그림 5). 둘 다 네프론 전구 세포가 분화됨에 따라 중간엽에서 상피로의 전이(MET)를 겪는 경향의 증가와 일치합니다(S. Chen et al., 2015). 기타 상당히 풍부한 경로에는 "Notch Signaling pathway의 양성 조절"(GO:0045747, Binomial Q-value=2e{18}})이 있으며, 이는 Notch 신호가 네프론 전구 분화를 촉진하는 역할과 일치합니다. 정 등, 2016). 감지된 10,083개의 종료 DAR은 GREAT의 기본 중요도 기준에 따라 중요한 GO 용어를 나타내지 않았습니다(보충 그림 5 참조).
그림 3. E14.5와 P0를 특징짓는 염색질 접근성의 차이점네프론 전구 세포.A) ATAC-seq 샘플의 주성분 분석은 발달 시점을 변동의 주요 원인으로 강조합니다. B) ATAC-seq 샘플에서 크게 변화하는 IDR 영역을 보여주는 히트맵. E14.5 샘플/열은 연한 녹색으로 주석 처리되고 P0개 샘플/열은 짙은 녹색으로 주석 처리됩니다. C) GO Biological Process 용어는 GREAT에 따라 E14.5와 P{7}} 사이에서 열리는 게놈 영역에 대해 풍부하며, 이항 P 값, FDR 0.001 이하로 순위가 매겨집니다.
다음으로 탐색한염색질 접근성네프론 전구 세포 분화에서 공개된 역할을 하는 유전자에 대한 프로모터 및 인핸서를 포함하는 게놈 영역. 이 중 Six2 전사 인자는 다분화능을 유지하는 데 중요합니다.네프론 전구 세포(Self et al., 2006), 그리고 모든 샘플에서 우리는 프로모터와 알려진 Six2 인핸서를 둘러싸고 있는 접근 가능한 염색질을 관찰했으며 Six2 전사 시작 부위(TSS)의 업스트림 50kb(O'Brien et al., 2018)(그림 4A, B, 파란색 음영 영역). 우리는 또한 프로모터의 접근 가능한 염색질 영역과 요관 새싹 분기를 촉진하기 위해 네프론 전구체에 의해 분비되는 단백질 Gdnf에 대한 공개된 인핸서(그림 4D, E)에 주목합니다(Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996). ). 이 인핸서는 유전자 프로모터의 ~113kb 업스트림에 위치하며 네프론 전구체 개발 맥락에서 Wnt 신호전달에 반응하는 것으로 알려져 있습니다(Park et al., 2012). Gdnf에 대한 프로모터는 시간이 지남에 따라 크게 변경되지 않지만 주석이 있는 인핸서는 액세스 불가능성을 크게 증가시킵니다. 우리는 또한 유전자의 TSS(Park et al., 2012)의 ~325kb 상류에 위치한 Eya1에 대한 네프론 전구체에서 활성인 공개된 인핸서를 둘러싼 접근 가능한 염색질 영역에 주목합니다(보충 그림 6). Eya1은 Six2와 상호작용하여 네프론 전구체 다분화능을 유지하는 전사 인자입니다(J. Xu et al., 2014).
알려진 규제 기능과 겹치지 않지만 EnhancerAtlas 2.{1}}(Gao & Qian, 2020)에 주석이 달린 다양한 마우스 세포 유형에서 특정 유전자에 대한 인핸서 활성이 있을 것으로 예상되는 영역을 포함하는 여러 DAR을 관찰합니다. Eya1의 공개된 인핸서(Park et al., 2012)(보충 그림 6) 외에도 Eya1의 인트론 중 하나의 폐쇄 DAR(그림 5A-B)은 마우스의 Eya1 유전자에 대한 인핸서 활성을 가질 것으로 예측되는 영역을 포함합니다. 신경 전구 세포 및 과립구-단핵구 전구 세포(Gao & Qian, 2020). 인핸서 활성의 감소와 함께 우리는 이전에 E14.5 scRNA-seq 데이터를 사용하여 분화하는 네프론 전구체에서 Eya1의 발현이 감소한다는 것을 관찰했습니다(보충 그림 7)(Bais et al., 2020). 이것은 활성 인핸서 마크, H3K27ac 및 Ctnnb1, Lef1, Six2 및 Tcf7의 결합 부족을 보여주는 1차 E16.5 네프론 전구체에서 공개된 ChIP-seq 데이터와 일치합니다(그림 5)(Guo et al. ., 2021). 이 잠재적인 인핸서는 또한 피크 내에 Hoxd10에 대한 전사 인자 발자국을 포함하며, 이는 중간엽에서 상피로의 전이(MET) 동안 네프론 전구 세포의 분화 및 통합에 필수적인 전사 인자입니다(Yallowitz et al., 2011).
24번 염색체에서 접근 불가능성을 증가시키는 DAR은 마우스 신장, 장 상피 및 자궁에서 배양된 세포에서 전사 인자 Pax8에 대한 인핸서 활성이 예측되는 염색질 영역과 겹칩니다(Gao & Qian, 2020). Pax8은 Pax2와 부분적으로 중복되지만 이 두 전사 인자 중 적어도 하나는 다음을 위해 네프론 전구체에 필요합니다.신장개발(Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). 우리는 이전에 Pax8 발현이 분화되고 분화된 네프론 전구세포에서 증가한다는 것을 관찰했으며(보충 그림 7), 이 규제 기능을 포함하는 DAR에서 접근성이 크게 증가한 것을 확인했습니다. 이 영역은 또한 활성 인핸서 마크인 H3K27ac 및 1차 E16.5 네프론 전구세포의 공개된 ChIP-seq 데이터에서 Ctnnb1, Lef1, Six2 및 Tcf7의 결합과 관련이 있습니다(그림 5)(Guo et al., 2021). 우리는 신생에 영향을 미치는 것으로 알려진 핵 인자인 Sall1에 대한 2개(Kanda et al., 2014)와 MYC 관련 징크 핑거에 대한 밀접하게 그룹화된 7개의 발자국을 포함하여 이 DAR의 고도로 보존된 접근성 피크 내에 속하는 많은 전사 인자 발자국을 관찰합니다. 단백질(Maz), 용량 의존적 효과가 있는 것으로 밝혀진 전사 인자신장인간과 생쥐의 발달(Haller et al., 2018). 보충 표 3에는 우리가 찾은 접근 가능한 영역의 전체 목록과 각각의 차등 접근성 통계, 겹치는 유전자, 엑손 및 프로모터에 대한 주석, 식별된 주요 신생 관련 전사 인자 발자국 목록이 포함되어 있습니다.
그림 4. 알려진 및 추정 규제 유전자좌에서의 ATAC-seq 프로파일. 위에서 아래로 각 패널에 대해 패싯은 폴드 농축을 나타냅니다.염색질 접근성E14.5 및 P0 샘플에서 IDR 및 DAR은 파란색(변경되지 않는 IDR) 및 녹색(개방 DAR)의 하이라이트로 식별됩니다. 및 빨간색(DAR 닫기). 다음 패싯은 풀링된 E14.5 및 P{6}} 샘플에서 측정된 유전자 주석, 뉴클레오솜 위치(회색) 및 뉴클레오솜이 없는 영역(빨간색), PhastCon60 보존 점수(검정색은 1{{ 12}}0% 보존, 흰색 0% 보존 A) Six2 전사 인자의 프로모터 및 유전자 본체. B) Enhancer for Six2published by Park et. 알. C) P0에서 접근성이 증가된 Gdnf용 차등 접근 가능 인핸서. D) Gdnf에 대한 발기인.
그림 5. 신생 관련 유전자에 대한 잠재적인 신규 인핸서와 중첩되는 DAR. A 및 C) 패널은 녹색으로 단백질 코딩 유전자를 포함하고 제안된 인핸서/프로모터 상호작용을 검정색 루프로 사용하여 관심 유전자를 둘러싼 1MB 영역의 맵을 묘사합니다. . B 및 D) 패널은 위에서 아래로 접힘 농축을 나타냅니다.염색질 접근성IDR이 녹색(열림) 및 빨간색(닫힘)으로 강조 표시된 E14.5 및 P0 샘플에서 측정된 후 Guo et. 알. 1차 네프론 전구체에서세포(Guo et al., 2021). 세 번째 패널은 Enhancer Atlas 2.0(빨간색)의 유전자 주석(파란색) 및 예측된 조절 요소를 나타내고, 네 번째 패널은 ATAC-seq 데이터에서 식별된 전사 인자 발자국을 나타냅니다. 다섯 번째 패널은 뉴클레오솜(회색)과 NFR(빨간색)을 나타내고 하단 패널은 보존을 나타냅니다. A) Eya1의 유전자 본체와 잠재적인 Eya1 인핸서를 포함하는 1MB 영역은 대략 325kb 업스트림입니다. B) 잠재적인 Eya1 인핸서를 포함하는 4.5kb 영역. C) Pax8 유전자 좌위 및 예측된 인핸서를 포함하는 1MB 영역. D) 예측된 인핸서 및 중복 DAR을 포함하는 4.5kb 영역.
토폴로지 관련 도메인은 잠재적인 인핸서-miRNA 관계를 식별하는 데 도움이 됩니다.
위상 관련 도메인(TAD)은 3차원 공간에서 핵으로 염색질의 패키징으로 인해 발생하는 고차 염색질 조직의 메가베이스 규모 영역이며(Dixon et al., 2012), 인핸서-프로모터 상호작용은 일반적으로 다음으로 제한됩니다. 동일한 TAD 내의 요소(Symmons et al., 2014). 우리는 마우스 배아 줄기 세포(ESC)에서 생성된 주석을 사용하여 네프론 전구체의 TAD를 근사화했습니다(Y. Wang et al., 2018). miRNA의 가능한 시스 조절 영역을 스크리닝하기 위해 우리는염색질 접근성동일한 TAD 내에서 차등적으로 발현된 miRNA로. 전체적으로 42,778개의 고유한 액세스 가능한 영역(약 92%)이 주석이 달린 TAD 내부에 있으며 이 중 3{13}},626(약 72%)은 알려진 프로모터와 겹치지 않습니다. 여기에는 2,103개의 DAR이 포함되며 시간이 지남에 따라 각각 1,180개 및 923개의 DAR이 열리고 닫힙니다. 15개의 개방 DAR은 E14.5와 P0 사이에서 발현이 증가된 하나 이상의 miRNA와 TAD를 공유하고, 9개의 폐쇄 DAR은 발현이 감소된 하나 이상의 miRNA와 TAD를 공유합니다. 그림 6은 이 접근 방식을 요약하고 27kb에서 1mb 이상(평균: 447kb) 범위의 DAR과 일치하는 miRNA 사이의 거리를 보여줍니다. 표 1은 일치하는 miRNA당 하나의 DAR이 나열된 가능한 DAR – miRNA 관계 세트를 자세히 설명합니다.
주석이 달린 miRNA-인핸서 쌍 중에서 특히 관심을 끄는 3가지를 주목합니다. 먼저, 시작 DAR은 let-7c{3}}p의 120kb 다운스트림과 miR-125b-5p의 73kb 다운스트림으로 식별되었으며 Six2 이전에 발표된 E16.5 네프론 전구체 ChIP-seq 데이터 세트의 결합 부위(그림 7A)(Guo et al., 2021). Let{13}}c{14}}p는 우리가 감지하는 가장 높게 발현되는 let{16}} miRNA 중 하나이며 let{17}} 계열은 Lin28btranscripts도 억제하는 것으로 알려져 있습니다(Slack & Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). Hmga2와 Meis2는 또한 네프론 전구 세포에서 let{23}} 계열의 잠재적인 새로운 표적으로 식별됩니다(그림 2). miR-125b-5p는 또한 마우스 조혈 및 전구 세포 유형에서 Lin28 전사체를 억제하는 것으로 나타났습니다(Chaudhuri et al., 2012). 둘째, miR{29}}p는 miR{30}}p에 대한 역보체입니다. miRNA는 최근에 다음으로부터 보호하는 것으로 밝혀졌습니다.신장대사 경로를 표적으로 하여 섬유증을 억제합니다(Fierro‐Fernández et al., 2020). 우리는 E14.5와 P0 네프론 전구체 사이의 miR{2}}ptranscripts에서 10-배 이상의 감소를 감지했으며 약 249kb 떨어진 곳에서 잠재적인 조절 요소를 확인했습니다(그림 7B). 우리는 관련 DAR에서 Snai1 및 Snai2에 대한 전사 인자 발자국을 관찰하며, 이는 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)를 촉진하는 것으로 나타났습니다(Sundararajan et al., 2019). 마지막으로 miR{13}}a{14}}p를 염색체 2의 가능한 유전자간 시스 조절 유전자좌 131kb 업스트림과 일치시켰습니다. 여기에서 네프론 전구체의 주요 조절자인 전사 인자 Wt1의 전사 인자 발자국을 기록합니다. 공개된 E16.5 네프론 전구체 ChIP-seq 데이터 세트(그림 7C)에서 생존(Kreidberg et al., 1993) 및 Six2 결합(Guo et al., 2021).
표 1. 동일한 TAD에서 하나 이상의 DAR과 일치하는 miRNA 발현 변화.
그림 6. 후보 인핸서 - 표적-miRNA 쌍 찾기.A) miRNA 발현의 가능한 조절을 위해 접근성 영역의 우선 순위를 지정하는 방법을 나타내는 순서도. B) 후보 인핸서(주황색 세로 줄무늬)와 관련된 각 스크리닝된 miRNA의 게놈 위치. log2 배 변화의 규모는 y축에 표시되며 발현이 증가하거나 감소하는 miRNA는 각각 녹색과 빨간색으로 강조 표시됩니다.
그림 7. 4개의 잠재적인 인핸서 - 타겟 miRNA 쌍 Ensembl의 알려진 유전자는 보라색으로 표시되고 어두운 영역은 엑손을 나타냅니다. E14.5 및 P0에서의 상대적 접근성은 각각 검은색 가로선 위 및 아래에 막대 플롯으로 표시되며 Guo et al이 게시한 ChIP-seq 데이터와 함께 지정된 DAR의 누적을 보여주는 삽입 플롯으로 표시됩니다. . 알. (Guo et al., 2021). HINT로 식별된 전사 인자 발자국은 주황색 배너에 나열됩니다. 오른쪽의 별도 패널에 있는 막대 플롯은 miRNA 발현(녹색) 및 제안된 인핸서 영역(주황색)에서 정규화된 Tn5 삽입 이벤트를 나타냅니다. A) let-7 가족 구성원 let-7c-5p는 다음에서 매우 높게 표현됩니다.네프론 전구 세포유전자간 영역에서 119kb 떨어진 '피크_54636'와 일치합니다. B) miR-9-3p는 249kb 떨어진 DAR과 일치합니다. C) miR-181a 2-3p는 가능한 유전자간 인핸서인 "피크_5887"에서 131kb 떨어져 있습니다.
논의
이 연구에서 우리는 잠재적인 시스 조절 기능과 함께 신생의 중단에 기여하는 새로운 miRNA를 동시에 식별하고자 했습니다. 우리는 P0과 비교하여 E14.5에서 네프론 전구 세포에서 차등적으로 발현되는 114개의 miRNA와 2,1{6}}3 DAR을 확인했습니다.신장. 우리는 Eya1 및 Pax8 유전자에 대한 새로운 추정 인핸서를 예측하는 여러 기능을 관찰합니다.네프론 전구 세포. 마지막으로 일관된염색질 접근성let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{5}}p를 포함한 33쌍의 miRNA 및 DAR에 대한 miRNA 발현 변화 miR-9-3p, 그리고 차등적으로 발현된 miRNA에 대한 네프론 전구세포에서 발현되는 현재의 추정 표적 유전자. 함께, 우리의 데이터는 네프론 전구 세포에 고유하고 신장 생성 단계에 의존하는 변화가 전구 세포의 염색질 환경과 miRNA 전사체에 반영된다는 것을 보여줍니다.
nephron progenitor miRNA transcriptome에서 관찰한 변화 중 progenitors가 노화됨에 따라 let{0}} 계열에서 발현이 광범위하게 증가하는 것을 확인할 수 있습니다. 이는 이전 보고서와 일치합니다. Lin28b 단백질과 miRNA의 let{2}} 계열은 상호 적대적이며 포유류에서 let{3}} 발현을 제어하는 쌍안정 스위치를 형성합니다(Zhu et al., 2011). nephron progenitors에서 let{5}} 발현 증가로의 전환은 nephrogenesis 정지 시기에 직접적인 영향을 미칩니다(Yermalovich et al., 2019). 또한 다른 세포 상황에서 Lin28b의 발현을 억제하는 것으로 알려진 miR-125b-5p의 발현 증가를 관찰했습니다(Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). let{12}} family와 miR{13}}b{14}}p는 네프론 전구체에서 E14.5와 P0 사이에 차등적으로 발현되는 114개의 miRNA 중 하나이며, 이는 네프론 전구체 발달에서 miRNA의 역할을 시사합니다. let{19}}/Lin28b에 국한되지 않습니다. 예를 들어 발현이 감소하는 miRNA에는 족세포 분화에 역할을 하는 것으로 보고된 miR{21}} 계열의 두 구성원이 포함됩니다(Z. Li et al., 2016):miR{23}}b -3p 및 miR-429-3p. 더 나아가 우리는 혈관 형성을 촉진하는 것으로 알려진 miR{26}}5p의 발현 감소를 관찰합니다(Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008). 이것은 vasculogenic 및 nephron progenitors의 일반적인 중간 엽 계통과 nephron progenitors가 되는 이들 세포의 하위 집합의 헌신을 반영할 수 있습니다.
DIANA miRPath(Vlachos et al., 2015)를 사용하여 변화하는 miRNA의 예측된 유전자 표적에 대한 경로 분석은 농축 MAPK 및 TGF-신호전달을 보여줍니다. 둘 다 네프론 전구체의 주요 조절인자입니다(Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella et al., 2018). ). 세포 외 기질, 액틴 세포골격 및 국소 접착과 관련된 경로를 포함하여 상향 조절된 miRNA의 예측된 유전자 표적 중에서 여러 다른 KEGG 경로도 과도하게 나타납니다: 세포 이동, 분화, 분기, 부착, 분극 및 증식의 모든 중요한 측면 (Rozario & Desimone, 2010). ECM 관련 유전자는 우리가 감지하는 가장 높게 발현되는 전사체(miR-196a-5p)를 포함하여 가장 많이 발현되고 크게 증가하는 miRNA의 표적이 됩니다. miR{10}}a{11}}p는 Col1a1, Col1a2 및 Col3a1을 표적으로 하는 것으로 알려져 있습니다. 이 유전자는 Pax 결핍 네프론 전구체에서 상향 조절되어 신장 기질로 전환분화됩니다(Naiman et 알., 2017). 따라서 증가된 miR{21}}a{22}}p발현은 선조의 나이에 따라 혈통 경계를 강화하는 역할을 할 수 있습니다. 또한, 우리는 Hmga2 및 Meis2(세포 증식과 관련됨)를 표적으로 할 수 있는 let{25}} 패밀리의 상향 조절을 포함하여 신생식의 중단에 기여할 수 있는 새로운 잠재적인 miRNA-mRNA 표적 상호작용을 식별합니다(Abruzzese et al ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014; Mugford et al., 2009) 네프론 전구 세포가 노화됩니다. Hmga2는 알려진 역할이 없습니다.신장개발. 그러나 Meis2는 신장 발달에 필요한 것으로 알려진 관련 전사인자 Meis1과 기능적으로 중복되는 것으로 생각된다(Hisa et al., 2004). 우리는 또한 목표로 삼을 수 있는 miR(miR-34b-5p, miR-983p 및 miR-200a-3p)의 하향 조절을 관찰합니다. Jag1은 상향 조절되고 네프론 분화에 중요한 것으로 알려져 있습니다(Chung et al., 2016).
변화하는 miRNA transcriptome과 함께 우리는 E14.5와 P{2}} 사이의 nephron progenitor cell의 염색질 환경 변화를 동시에 측정했습니다. 우리는 (i) 이러한 유전자 프로모터에 대한 근접성, (ii)염색질 접근성분화 동안 pseudotime 유전자 발현 변화와 일치하는 발달 동안, (iii) 발자국신장개발 전사 인자, (iv) 서열 보존, (v) Enhancer Atlas2의 다른 조직/세포 유형에서 인핸서 기능의 증거.{1}}(Gao & Qian, 2020), (vi) E16의 ChIP-seq 데이터 .5 활성 인핸서(H3K27ac) 표시 및 Ctnnb1, Lef1, Six2 및 Tcf7의 전사 인자 결합에 대한 네프론 전구체. 우리는 Eya1 인핸서에 대한 염색질 접근성의 감소를 관찰했는데, 이는 네프론 전구체 다분화능을 촉진하는 Eya1의 역할과 일치하며 Eya1의 손실이 전구체 집단의 조기 상피화를 초래한다는 보고와 일치합니다(J. Xu et al., 2014; PX Xu et al., 1999). Pax8과 그 상동체 Pax2는 네프론 전구체의 계통 사양에 기여하며(Bouchard et al., 2002), 이러한 유전자 중 적어도 하나가 없는 네프론 전구체는 MET를 겪지 않을 것입니다(Narlis et al., 2007). 추정 Pax8 인핸서에 대해 감지한 염색질 접근성 증가는 네프론이 분화함에 따라 신장 상피에서 증가된 Pax8 발현과 일치합니다.
DAR의 농축 분석(McLean et al., 2010)은 "상피 분화의 조절"을 개방 염색질 영역 중에서 가장 많이 농축된 용어로 밝혔으며, 이는 우리가 감지하는 DAR이 세포의 분화 및 발달을 위한 신호를 유도하거나 이에 반응하는 조절 기능을 포함할 수 있음을 나타냅니다.네프론 전구 세포상피 세포 유형으로. 노치 신호전달은 개방 DAR 중에서 확인된 가장 풍부하게 농축된 GO 용어 중 하나이며, 네프론 전구체에서 이 경로는 Six2 발현을 억제하고 네프론 전구체 세포 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있습니다(Chung et al., 2016). 이 경로와 관련된 유전자 중에는 Notch 신호 전달의 핵심 리간드인 Jag1이 있으며, 이의 발현은 Six2 및 Hes1의 발현과 반비례하는 것으로 보고되었습니다(Chung et al., 2016). Jag1은 발현이 증가하는 3개의 miRNA에 대한 주석이 달린 표적입니다(miR34b-5p, miR98-3p 및 miR200a{11}}p, 그림 2). 마지막으로, Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 및 Hey2를 포함하여 이러한 발달 경로와 상피 세포 분화 간에 공유되는 유전자의 결과인 것으로 보이지만 DAR을 여는 데 있어 혈관 리모델링 및 형태 형성과 관련된 유전자의 농축을 관찰합니다.
변경 사항염색질 접근성의 사이에네프론 전구 세포이전 연구에서 측정되었습니다(Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019).
전반적으로 우리의 결과는 Notchsignaling 및 Pax{0}}관련 유전자를 강조하는 이러한 이전 연구와 일치합니다. 그러나 이 보고서와 비교할 때 이러한 선행 연구에는 몇 가지 실험적 차이점이 있습니다. Six2-TGC 이식유전자 리포터 마우스에서 형광 활성화된 세포를 사용하여 GFP 발현 네프론 전구 세포를 분리하는 것은 이 대립 유전자가 보고된 네프론 수의 감소가 약 45%라는 발견에 의해 잠재적으로 혼란스럽습니다(Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). 또한, 배양된 네프론 전구체(저용량 또는 고용량 CHIR로 성장)는 1차 네프론 전구체와 구별되는 전사체를 갖는 것으로 나타났으며, 이는 염색질 접근성도 다를 것임을 시사합니다(Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). 우리 연구의 목표는 염색질 풍경의 변화가 초기 네프론 전구체와 후기 네프론 전구체에서 miRNA 발현에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것이었으므로 1차 네프론 전구체에 대한 분석이 필요했습니다.
신장에 좋은 시탕슈
염색질 환경에서 관찰된 이러한 변화를 miRNA 발현의 일치된 변화와 결합함으로써 우리는 추가 연구를 위해 신생의 중단에 몇 가지 새로운 추정 miRNA-인핸서 쌍을 연루시킵니다. 예를 들어 miRNAs miR{1}}a-5p 및 let-7c-5p는 E14.5와 P0 사이에서 발현이 크게 증가하는 것을 볼 수 있습니다. , 이는 동일한 TAD에서 DAR(chr16:77,719,{11}},720,407)의 액세스 불가능성 증가로 요약됩니다. 이 DAR은 Six2 결합 부위와도 관련이 있으며(Guo et al., 2021) miR{16}}a{17}}p 및/또는 let{18} }c{19}}p, 이는 차례로 Lin28b의 억제를 통해 분화를 촉진할 수 있습니다. 유사하게, 우리는 인간에서 레닌 발현을 조절하는 것으로 알려져 있고(Marques et al., 2015) miR 181a에 대한 가능한 인핸서를 관찰하고 BIRC6 및 세포자멸사를 억제하는 능력으로 인해 신독성을 감소시키는 치료 표적으로 간주되었습니다(Liu et al. 알., 2018). 마지막으로, Wnt 신호 반응성 단백질 Snai1 및 Snai2.miR{29}}p의 역보체 miR{30}}p에 대한 전사 인자 발자국이 있는 miR{25}}p와 관련된 닫는 DAR을 관찰합니다. 로부터 보호하는 것으로 알려져 있습니다.신장섬유증(Fierro‐Fernández et al., 2020), Snai1 및 Snai2는 마우스 피부암 세포에서 암종 전이를 촉진하고(Olmeda et al., 2008) 암 환자의 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)를 촉진하는 것으로 나타났습니다. (Sundararajan et al., 2019) 반면 miR{7}}은 종양 내피 세포의 혈관신생 및 이동을 촉진하는 것으로 알려져 있습니다(Zhuang et al., 2012). Wnt 신호가 증가하면 Snai1 및 Snai2의 발현이 감소하고, 이는 차례로 miR{11}p 발현을 감소시켜 네프론 전구체 분화를 지원하는 메커니즘이 존재할 수 있습니다.
우리의 연구는 배아 발달 동안 네프론 전구체의 염색질 풍경과 miRNA 전사체의 변화를 포괄적으로 확인했으며, 신생의 정지에 역할을 할 수 있는 후보 cis-조절 영역과 miRNA를 확인했습니다. mRNA-seq 및 ATAC-seq 데이터 모두에 대한 농축 분석은 Notch 및 TGF-를 포함하여 네프론 전구체 분화를 조절하는 경로와 같이 관련될 수 있는 메커니즘에 대한 매력적인 단서를 제공합니다. 우리는 또한 Eya1 및 Pax8에 대한 두 가지 새로운 추정 조절 요소를 보고합니다.신장개발, 그리고 신생식의 중단에 연루된 주요 miRNA에 대한 잠재적인 조절 서열.
행동 양식
마우스 계통
야생형 CD{0}} 시간 교미 임신한 암컷은 Charles River Laboratories, Inc.(Wilmington, MA, USA, RRID: MGI:5659424)에서 입수했으며신장배아일 E14.5 또는 P0에 한배 새끼에서 수집되었습니다. 모든 동물은 UPMC 아동 병원 피츠버그(미국 펜실베니아주 피츠버그)의 랑고스 연구 센터(Rangos Research Center) 사육장에 수용되었으며 모든 동물 실험은 University of the University of Institutional Animal Care and Use Committee의 정책에 따라 수행되었습니다. 피츠버그. 각 배 또는 새끼의 성은 Y-염색체 유전자 Sry에 대한 다음 프라이머를 사용하여 꼬리 자르기에서 분리된 게놈 DNA에 PCR을 수행하여 확인되었습니다. 이전에 게시됨(McFarlane et al., 2013).
Small RNA 시퀀싱 및 분석
에서 분리된 총 RNA네프론 전구 세포ATAC-seq를 제거한 후 남은 세포 분획은 QIAseq miRNA 라이브러리 준비 키트(Qiagen 3315{{1{18}}}}2)를 사용한 라이브러리 준비를 위해 UPMC 피츠버그 아동 병원의 Health Sciences Sequencing Core에 제출되었습니다. mRNA-seq 라이브러리의 단일 종단 시퀀싱은 Illumina NextSeq500에서 수행되었으며 라이브러리는 라이브러리당 약 5천만 개의 단일 종단 읽기 깊이까지 시퀀싱되었습니다. 그런 다음 시퀀싱된 읽기를 Rsubread 패키지(Liao et al., 2019)(버전 2.0.1)를 사용하여 마우스 mm10 게놈에 정렬하고 miRBase(버전 22)에 나열된 알려진 miRNA에 주석을 달았습니다(Kozomara & Griffiths-Jones, 2014). Rsubread 패키지의 featureCounts 함수를 사용합니다. 알려진 miRNA의 차등 발현은 DESeq2 R 패키지(버전 1.26.0)를 사용하여 측정되었습니다(Love et al., 2014). 알려진 miRNA에 주석이 달린 정렬된 읽기의 비율과 샘플당 여성 배아의 비율은 DESeq2에 제출된 테스트 모델의 보조인자로 포함되었습니다. 그런 다음, 거짓 발견 비율을 5%로 제어하면서 차등적으로 발현된 miRNA를 식별하고, 배수 변화 값(E14.5에 비해 P0에서 더 높은 발현을 나타내는 "증가"를 나타냄)을 기반으로 변화 방향(증가 대 감소)을 결정했습니다. . DIANA 도구 miRPath 버전 3.0(Vlachos et al., 2015)을 사용하여 발현이 크게 증가 및 감소하는 예측된 miRNA의 유전자 표적 중 조절 경로의 강화를 계산했습니다. miRNA에 대한 예측된 표적 전사체는 TargetScan(Agarwal et al., 2015) 및 miRDB(Y. Chen & Wang, 2020) 리포지토리에서 검색되었습니다.
네프론 전구체 분리
신장{{0}} E14.5 배아 또는 P0 새끼에서 해부되었으며 각 새끼는 하나의 샘플로 간주되었습니다. 샘플당 하나의 신장은 후속 분석에서 "전체 신장 대조군"으로 사용되는 전체 RNA 분리에 사용되었습니다(아래 참조). 각 시점에서 총 3개의 샘플을 수집했습니다. 그런 다음 이전에 발표된 바와 같이 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 각 샘플에서 피질 세포를 분리했습니다(Brown et al., 2011). 간단히 말해서, 신장은 37도에서 15분 동안 인산완충식염수(PBS)에서 2mM 콜라게나제 A(Roche 11088793001) 및 3.5mM 판크레아틴(Sigma P1625)으로 부분 소화를 거쳤습니다. 소화 반응은 차가운 100% 소 태아 혈청(FBS)을 사용하여 중단되었고 세포 현탁액을 수집하고 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) 프로테아제 억제제(Sigma-Aldrich 108370910)가 포함된 차가운 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에 재현탁했습니다. 세포를 세척하고 PBS 중 2% FBS로 구성된 얼음처럼 차가운 분리 완충액에 재현탁한 다음 Integrin 알파 8(Itg 8, R&D Systems AF4076)에 대한 항체에 비오틴화된 자기 비드(Dynabeads FlowComp Flexi 키트, ThermoFisher 11061D)와 함께 인큐베이션했습니다. DSB-X 비오틴 단백질 라벨링 키트(ThermoFisher D-20655)를 사용합니다. 이 비드에 결합된 네프론 전구 세포는 이전에 발표된 대로 분리되었고(Hemker et al., 2020) 각 샘플에 대해 신장 전체에 걸쳐 풀링되었습니다. 50,{29}} 네프론 전구 세포의 분취물을 즉시염색질 접근성라이브러리 준비 프로토콜(아래 참조)을 따르고 Qiagen miRNeasy Mini Kit(Qiagen 217004)를 사용하여 나머지 세포 현탁액에서 총 RNA를 추출했습니다.
농축을 확인하기 위해네프론 전구 세포다른 세포 유형에 비해 전체 RNA는 네프론 전구 세포 및 전체 세포로부터 분리되었습니다.신장(전체 신장 대조군, 위 참조) 및 다음 마커에 대한 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)을 수행했습니다: 네프론 전구체 마커 Six2 및 Cited1(L. Huang et al., 2016) 및 Lhx1, Pdgfr, 신장 소포(Brunskill et al., 2014), 신장 기질(S. Chen et al., 2015), 내피(Kobayashi et al., 2008) 및 요관 봉오리(Cebrian et al., 2014a)를 표시하는 Pecan 및 Caleb ) 세포, 각각; 또한 보충 그림 1을 참조하십시오. Gapdh(Barber et al., 2005)는 하우스키핑 유전자로 사용되었으며 상대 정량화는 2-ΔΔCt 방법(Livak & Schmittgen, 2001)을 통해 계산되었습니다. 이 성적표에 대한 프라이머는 표 2에 포함되어 있습니다.
표 2. RT-PCR 프라이머.
염색질 접근성도서관 준비
약 50,000네프론 전구 세포이전에 게시된 방법(Buenrostro et al., 2{10}}13)에 따라 수정된 Nextera DNA Flex Library Prep Kit(Illumina FC{1}})를 사용하여 ATAC-seq용 각 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 데 사용되었습니다. 간단히 말해서, 세포를 10분 동안 10mM Tris, 10mM NaCl, 3mM MgCl2, 1mM PMSF 프로테아제 억제제 및 0.05% Triton X{12}}로 구성된 얼음처럼 차가운 비이온성 용해 완충액에 현탁시켜 세포를 용해했습니다. 핵막은 그대로 두면서 막. 온전한 네프론 전구체 핵을 트랜스포사제 효소를 함유하는 전위 완충액에 재현탁시키고 37도에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 전위 과정에 의해 방출된 유리 게놈 DNA는 MinElute PCR 정제 키트(Qiagen 28004)를 사용하여 정제한 다음 Nextera Index Kit(Illumina FC{19}})의 정방향(i7) 및 역방향(i5) 색인 프라이머를 사용하여 색인을 생성했습니다. 이 방법의 PCR 증폭 열 순환 프로그램을 사용하여 인덱스 결찰 및 단편 증폭을 달성했습니다.
ATAC-seq 라이브러리에 필요한 최적의 증폭 주기 수를 결정하기 위해 SsoAdvanced SYBR Supermix(BioRad 1725274) 및 96-well C100 Thermal Cycler(Bio-Rad)를 사용하여 qPCR 부반응을 수행하여 정규화된 각 주기에 대한 리포터 값(Rn). 반응이 최대 형광의 3분의 1에 도달한 사이클 수를 남은 증폭 사이클의 최적 수로 확인하고, 색인된 ATAC-seq 전위 반응의 나머지 부피는 최종 증폭에서 해당 수의 추가 사이클을 거쳤습니다. 프로그램. Ampure XP 자기 비드(Beckman Coulter A63881)를 사용하여 최종 라이브러리를 정제했습니다.
염색질 접근성시퀀싱
ATAC-seq 라이브러리의 paired-end 시퀀싱은 UPMC Children's Hospital of Pittsburgh의 Health Sciences Sequencing Core에 의해 Illumina NextSeq500에서 수행되었으며, 샘플당 9천만 개의 paired-end 읽기를 생성할 것으로 예상되는 라이브러리 농도로 다중화되었습니다. . 읽기는 TrimGalore(BabrahamLab, 2014)(버전 0.4.3)를 사용하여 "--페어링" 모드 및 기본 설정으로 품질 트리밍되었습니다. 읽기는 "--local -q -X 2000 -- 중". 동일한 DNA 단편의 PCR 복제 결과 판독은 기본 설정으로 Picard 도구(Broad Institute, 2016) MarkDuplicates 기능(버전 2.10.9)을 사용하여 표시되었습니다. 게놈에서 둘 이상의 위치에 모호하게 매핑된 읽기는 가능성이 4개 미만인 경우 이러한 위치 중 하나에 무작위로 할당되고, 그렇지 않으면 제거되었습니다(ENCODE, nd)(https://github.com에서 제공되는 Python 스크립트 사용). com/kundajelab/atac{25}}dnase{26}}파이프라인, (Lee, 2017) '--paired-end -k" 설정). Samtools(H. Li et al., 2009)(버전 1.3.1)는 BAM 파일의 정렬 및 인덱싱뿐만 아니라 중복, 매핑되지 않은, 고아 및 미토콘드리아 읽기를 필터링하는 데 사용되었습니다. ATAC-seq 데이터의 품질 관리는 ENCODE 프로젝트의 ATAC-seq 지침(ENCODE, nd)을 따랐고 샘플 라이브러리는 라이브러리 크기의 차이를 정규화하기 위해 각각 3,100만 쌍의 말단 읽기를 포함하도록 무작위로 다운 샘플링되었습니다.
Cistanche는 신장 감염을 예방할 수 있습니다
접근 가능한 염색질 영역 식별
필터링된 ATAC-seq 읽기가 포함된 BAM 파일은 Bedtools'(Quinlan & Hall, 201{{2{38}}}})(버전 2.26.0) 'bombed를 사용하여 페어드 엔드 BED 형식으로 변환되었습니다. ' 설정 "- 침대 pe -mate1" 기능. 접근 가능한 염색질 영역은 '{17}}형식 BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --넓은 --이동 37 --텍스트 크기 75 --모든 --모델 유지". 높은 신뢰도의 접근 가능한 영역을 식별하기 위해 쌍별 비교(주어진 시점에서 복제의 각 조합)를 수행하고 재현 불가능한 발견률(IDR)(Q. Li et al., 2011)을 공개적으로 사용 가능한 방법을 사용하여 계산했습니다. Python 구현(GitHub https://github.com/nboley/idr)(Boleu et al., 2015) '--입력 파일 유형 브로드 피크 --순위 p.값 {{ 35}}soft-IDR-threshold 0.{39}}출력 파일 유형 침대". 특히, 각 시점에 대해 액세스 가능한 모든 지역의 연결된 BED 파일이 각 비교에 대한 "{42}}peak-list" 인수를 통해 제출되었습니다(예: 두 개의 E14.5 샘플을 비교할 때 모든 E14.5 넓은 피크 세 복제 모두 사용됨). 최소 2개의 쌍별 복제 비교(최소 20% 중첩 포함)에서 IDR에 의해 일관성이 있었던 접근성 영역은 높은 신뢰도의 접근 가능한 영역("IDR 영역")의 통합 세트로 결합되었습니다.
접근 가능한 염색질 영역의 변화
주어진 샘플 내 각 IDR 영역의 접근성은 샘플 전반에 걸쳐 시퀀스 GC 함량에 대해 정규화하는 동안 발생하는 전위 이벤트의 수를 계산하여 정량화되었습니다. 이것은 사용자 정의 스크립트를 사용하여 달성되었습니다(동봉된 소프트웨어 리포지토리에서 사용 가능, 추가 데이터 참조). 이 접근성의 변화는 Limma-voom(버전 3.42.2) 소프트웨어 패키지(Ritchie et al., 2006)를 사용하여 여러 시점에서 이러한 값을 비교하여 결정되었습니다. 배아 성별을 설명하기 위해 각 샘플의 여성 배아 비율은 차등 접근성 분석에 사용되는 선형 모델의 보조인자로 포함되었으며 Limma 패키지의 일괄 제거 제거 기능을 사용하여 시각화에서 일괄 효과로 제거되었습니다. 오탐률을 10%로 제어할 때 염색질의 차별적으로 접근 가능한 영역(DAR)은 크게 열리거나(E14.5와 P{18}} 사이에 접근 가능성이 증가함) 닫히거나(E14.5와 P0 사이에 접근이 감소됨) 간주되었습니다. . 개방 및 폐쇄 게놈 영역의 기능 강화 분석은 각각의 좌표를 Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool(GREAT, http://great.stanford.edu/public/html/에서 사용 가능)에 제출하여 결정되었습니다(McLean et al., 2010 ). FANTOM5(Andersson et al., 2014), VISTA(Visel et al., 2007) 및 EnhancerAtlas 2.0(Gao & Qian, 2020) 리포지토리에서 알려진 및 예측된 인핸서의 주석을 검색했습니다.
전사 인자 발자국
전사 인자 발자국은 동일한 시점에서 모든 BAM 파일을 풀링한 다음 Regulatory Genomics Toolbox의 Hmm 기반 TF 발자국 식별(HINT) 소프트웨어(버전 0.12.3), 특히 ATAC의 발자국 모델을 실행하여 식별되었습니다. -seq 데이터(www.regulatory-genomics.org에서 사용 가능)(Z. Li et al., 2{31}}18). 이 소프트웨어는 'right-hint Footprinting --organism=mm{10}}at-seq --paired-end' 설정으로 실행되었습니다. 그런 다음 'right-motif analysis matching --organism{18}}mm10' 설정과 함께 HINT의 모티프 일치 기능을 사용하여 HOCOMOCO 11 데이터베이스(Kulakovskiy et al., 2018)의 알려진 마우스 결합 모티프로 발자국에 주석을 달았습니다. HINT 점수가 10 미만인 발자국은 제외되었습니다. 마지막으로 "right-hint Differential --organism=mm10 --bc {{27} }NC 12 --출력 프로필". 유의하게 변화하는 활동 수준은 0.05의 p-값 컷오프(Friedman-Nemeny 방법)를 기반으로 식별되었습니다.
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뉴클레오솜 구성
동일한 시점에서 정렬된 읽기를 단일 BAM 파일로 통합하고 NucleoATAC 패키지(버전 0.3.4)를 사용하여 결합된 뉴클레오솜 쌍과 뉴클레오솜이 없는 영역( NFRs)(Schep et al., 2015). 이 소프트웨어는 기본 설정을 사용하여 실행되었습니다. 뉴클레오솜은 각각의 뉴클레오솜 쌍이라고 불리는 주위를 중심으로 하는 146bp 영역으로 주석을 달았습니다.
단일 세포 RNA 발현
단일 세포 유전자 발현 데이터는 이전 원고(BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1)에 대해 처리되었으며(Bais et al., 2020), Gene Expression Omnibus에서 검색했습니다. (GEOID GSE158166). 보충 그림 7에 통합된 처리 데이터에는 세포 유형, 유전자 발현 수준, 저차원(tSNE) 임베딩, 증식 및 분화하는 네프론 전구체 클러스터 사이에 설정된 궤적과 관련된 의사시간 주석이 포함됩니다. SingleCellExperiment R 패키지(Lun & Risso, 2019)를 사용하여 데이터에 액세스하고 구성했습니다.
네프론 전구 세포 노화 및 분화에서 miRNA-mRNA 상호 작용
자가 재생, 프라이밍 및 분화 사이에서 발현이 변화하는 유전자네프론 전구 세포Bais et al.(FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">
1차 네프론 전구체에서 염색질 면역침전 시퀀싱
1차 네프론 전구체에서 -catenin, Lef1, Six2 및 Tcf7 결합에 대한 염색질 면역침전 시퀀싱(ChIP-seq) 데이터는 Guo et al., 2021에 대한 GEO 저장소(GSE131119) 내의 BedGraph 파일에서 검색되었습니다. 폴드 농축 신호 값의 평균을 구했습니다. 복제 샘플 전반에 걸쳐.
miRNA 발현에 영향을 미치는 조절 요소에 대한 스크리닝
miRNA의 잠재적인 인핸서를 스크리닝하기 위해 3D Genome Browser(http://3dgenome에서 사용 가능)에서 다운로드한 마우스 배아 줄기 세포의 mm10 주석을 기반으로 위치하는 토폴로지 관련 도메인(TAD)으로 miRNA 및 DAR에 주석을 추가했습니다. .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). 지역염색질 접근성miRNA는 후보 인핸서로 간주되었습니다. 동일한 TAD를 점유하고 접근성 및 발현에서 일관된 변화를 나타내는 경우 miRNA 쌍입니다(miRNA 발현 증가로 접근성 증가 및 그 반대). DAR은 알려진 프로모터 또는 엑손 말단과 겹치지 않는 경우에만 가능한 "조절 기능"으로 간주되었습니다. miRNA와 추정 조절 요소의 잠재적 쌍은 1) 동일한 TAD에 속하고 2) E14.5와 P{4}} 사이에 상당한 변화를 경험한 경우 우선 순위가 지정되었습니다(miRNA 발현 증가 및 IDR 영역 접근성 증가, 그 반대의 경우도 마찬가지). .
감사의 말
Shelby Hemker와 Abha Bais는 실험적인 디자인에 기여했습니다. ATAC-seq 및 mRNA-seq에 대한 시퀀싱은 UPMC 피츠버그 아동 병원의 Health Sciences Sequencing Core에서 수행되었습니다.
경쟁 관심
경쟁 관심이 선언되지 않았습니다.
자금 조달
AC는 National Institute of Diabetes and Digestive 및신장국립 보건원(T32DK061296-17)의 질병. DK는 국립 보건원(R01GM115836) 산하 국립 일반 의학 연구소의 보조금으로 지원되었습니다. JH는 국립 보건원(R01DK103776 및 125015)의 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소의 보조금으로 지원되었습니다. DMC는 신증후군 연구 네트워크(NEPTUNE) 경력 개발 상과 피츠버그 아동 병원 연구 자문 위원회 박사후 연구원의 지원을 받았습니다. YP는 UPMC 피츠버그 아동 병원과 북미 미토콘드리아 질병 컨소시엄의 보조금으로 지원되었습니다.
데이터 가용성
예상 마우스 인핸서는 FANTOM5(DOI: 10.1038/nature12787, 파일은 여기에서 사용 가능), Vista(DOI: 10.1093/var/gkl822, 파일은 여기에서 사용 가능) 및 EnhancerAtlas(DOI: 10.1093/var/gkz980에서 사용 가능한 마우스)에서 검색되었습니다. 데이터베이스. 마우스 mm10 게놈 및 해당 주석은 Illumina 게놈 프로젝트(여기에서 사용 가능)를 통해 다운로드되었습니다. mm9 좌표를 mm10으로 올리기 위한 오버체인 파일은 UCSC 게놈 브라우저에서 검색되었습니다(DOI: 10.1101/gr.229102; 파일은 여기에서 사용 가능). 마우스 배아 줄기 세포의 TAD 주석은 3D 게놈 브라우저(DOI: 10.1186/s{20}}, 여기에서 파일 사용 가능)에서 검색했습니다. 예상되는 miRNA 전사물 표적은 TargetScan(DOI: 10.7554/eLife.05005, 파일은 여기에서 사용 가능) 및 miRDB 버전 6(DOI: 10.1093/var/gkz757, 파일은 여기에서 사용 가능)에서 검색되었습니다. IDR/DAR 위치, 주석 및 차등 농축 결과를 포함한 ATAC-seq 데이터는 GEO(GSE168339)에서 사용할 수 있으며, 주석 및 차등 발현 결과(GSE168342)를 포함한 mRNA-seq 데이터도 마찬가지입니다. 데이터를 처리 및 분석하고 수치를 생성하는 데 사용되는 컴퓨터 코드는 https://bitbucket.org/clugstonA/mirna{32}}enhancers에서 확인할 수 있습니다.
서지
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보낸 사람: 저널 사전 교정
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