Cistanche Deserticola 추출물이 면역 반응을 촉진할 수 있습니까?
Mar 22, 2022
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Shuangshuang Feng a,1, Xiumei Yang a, Xiang Weng a,1, Bin Wang b, Ailian Zhang a,*
a Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, 830046, Xinjiang, China
b 200032 중국 상하이 푸단대학교 상하이 의과대학 기초의학부 의료 분자 바이러스학 핵심 연구실
민족약리학적 관련성:초본 다당류는 면역 강화 잠재력이 뛰어납니다. 면역증강제는 효과적인 백신을 개발하기 위한 핵심 도구입니다. 우리의 이전 연구에서 야생에서 추출한 수용성 다당류시스탄체데저티콜라YC Ma는 강력한 면역자극 활성을 보였다.
연구 목적:이 연구에서 재배된 수성 추출물의 면역 프로파일과 효능시스탄체데저티콜라오브알부민(OVA)에 대한 ICR 마우스의 YC Ma(AECCD)를 조사했습니다. 시험관 내 실험에서 AECCD에 의한 가능한 DC 활성화 메커니즘이 평가되었습니다.
재료 및 방법:AECCD를 뜨거운 물을 사용하여 추출한 후 조 다당류를 에탄올로 침전시켰다. 마우스는 1일 및 14일에 각각 다른 투여량의 AECCD(마우스당 200, 400, 및 800ug)를 함유하는 OVA(마우스당 10ug) 단독 또는 OVA(마우스당 10ug)로 피하 면역화되었고 그런 다음 항체 및 세포 매개 반응을 평가했습니다.
결과:AECCD는 Th1/Th2 반응이 혼합되어 있고 Th 관련 사이토카인(CD4 + IL{6}}, CD4 + IFN- 및 CD8 + IFN-)의 상향 조절된 수준으로 활발하고 장기적인 IgG 반응을 이끌어냈습니다. 또한, AECCD는 강력한 세포면역성 있는응답증가된 비장세포 증식 및 활성화된 T 세포 반응을 특징으로 합니다. 특히, AECCD는 수지상 세포(DC)의 성숙을 상당히 향상시키고 Treg를 억제했습니다. 시험관 내 실험에서 예비 테스트는 AECCD가 표현형 성숙, 사이토카인 섹션 및 동종자극 활성을 촉진하여 DC 활성화를 유도함을 나타냈습니다. Toll-like receptor 4(TLR4)는 DC가 AECCD에 직접 결합하는 데 필수적인 수용체였습니다. NF-κB 억제제는 CD40, CD80, CD{6}}, MHC-II의 발현 수준을 감소시켰고 DCS를 통한 IFN-, TNF-, IL{10}} 생성을 감소시켰습니다.
결론:마지막으로, 이러한 발견은 AECCD가 강력하고 지속적인 항원 특이성을 이끌어낼 수 있음을 시사했습니다.면역성 있는응답TLR{0}}관련 NF-κB 경로를 통한 성숙 마커 및 사이토카인 발현의 조절에 관여하는 DC 활성화를 통해 이 연구는 AECCD가 잠재적인 면역 조절제임을 나타냅니다.
키워드:다당류 보조제 재배,시스탄체데저티콜라, 면역 조절제, 수지상 세포 Toll-like 수용체 4, NF-κB 신호 전달 경로
1. 소개
많은 연구에서 면역증강제가 HIV, 코로나바이러스{0}}, 인플루엔자 및 구제역과 같은 다양한 전염병에 대한 백신의 효능을 향상시킬 수 있다고 제안했습니다(Cao et al., 2020; Giuseppe et al., 2018 ). 보조제는 다양한 유형과 크기를 유도할 수 있습니다.면역성 있는응답, 따라서 적절하게 선택된 보조제는면역성 있는응답주어진 병원체 또는 항원에 필요합니다(Reed et al., 2013). 천연 초본 추출물은 일상 생활이나 건강 관리에서 오랫동안 널리 사용되었습니다. 많은 경우 한의학(TCM)과 그 활성 성분, 특히 여러 TCM 다당류 유래 보조제가 백신의 효능을 크게 향상시켰습니다. TCM 다당류(Advax™, 황기 다당류, 인삼 다당류, Lycium barbarum polysaccharide 및 Ganoderma lucidum 다당류)는 다른 보조제에 비해 더 나은 안전성, 생체 적합성, 강력한 면역 강화 및 낮은 반응성과 같은 몇 가지 이점이 있었습니다(Li and Wang; Schijns 2015 et al., 2020). 따라서 TCM 다당류 기반 화합물 및 제형은 보조제 후보로 잠재력이 있습니다.
시스탄체 데저티콜라YC Ma(중국어로 Roucongrong)는 중국 약전에 기록된 중국 전통 의학이며 중국에서 수백 년 동안 강장제로 사용되었습니다(Chinese Pharmacopoeia Commission, 1992). 현대 약리학 연구는 여러 약리학 및 면역 조절 응용을 보여주었습니다(Dong et al., 2007; Fu et al., 2017). 우리의 이전 연구에서 야생에서 추출한 조다당류는시스탄체데저티콜라YC Ma는 항원 특이적 체액 및 세포 반응을 촉진하고 수지상 세포(DC)의 성숙을 조절했습니다(Zhang et al., 2018; Zhao et al., 2019). 그러나 야생시스탄체데저티콜라YC Ma는 과도하게 탐사되어 멸종 위기에 처한 종으로 지정되었습니다.시스탄체데저티콜라YC Ma는 대규모로 재배되었으며 TCM 자원의 개발 및 적용에 널리 사용됩니다. 그러나 재배의 보조적 잠재력시스탄체데저티콜라YC Ma는 여전히 불분명합니다.
DCS는 전염병에 대한 필수 규제 기관입니다. DC가 활성화된 후 DC의 표면 분자와 전염증성 사이토카인은 해당 수용체와 상호작용하여 T 세포를 활성화하고 항원 특이적 반응을 유도하고 적응성을 지시하는 사이토카인의 생산을 유도합니다.면역성 있는응답(Banchereau 및 Steinman, 1998). DC의 toll-like receptor 4(TLR4)는 중요한 다당류 수용체로 기능하는 것으로 보고되었습니다(Park et al., 2014; Qi et al., 2016). 실제로, 많은 다당류는 DC의 TLR4와 직접 또는 간접적으로 상호작용하여 다운스트림 핵 인자-카파 B(NF-κB)를 활성화할 수 있으며, 이는 IFN-, TNF- 및 IL과 같은 다양한 전염증성 유전자의 발현을 유도할 수 있습니다{11 }} 및 병원체를 제거하기 위한 염증 반응(Tian et al., 2019; Zhou et al., 2017; Zhu et al., 2013). 따라서 DCS와 NF-κB는 질병 치료의 잠재적 표적으로 광범위하게 연구되었습니다.
이 연구에서 생체 내(ICR 마우스) 전략을 사용하여 먼저 배양된 수성 추출물의 면역 자극 효과를 평가했습니다.시스탄체데저티콜라다른 복용량(낮음, 중간 및 높음)을 사용하여 YC Ma(AECCD)를 유도합니다.면역성 있는응답OVA에 반대하고 DC 및 다운스트림 수용체 관련 경로를 활성화하는 시험관 내 방법을 설명합니다. 우리는 마우스 모델을 통해 AECCD가 증가된 IgG 역가와면역성 있는응답. 중요하게도, AECCD는 Th-관련 사이토카인, 특히 IFN-생산을 유도하여 감염에 대한 Th1 반응을 유도했습니다. 유도 효과는 강화된 DC 성숙 및 감소된 Treg와 밀접한 상관관계가 있었습니다. 기계적으로 AECCD는 TLR4-관련 NF-κB 경로를 통해 DC 활성화를 촉진했습니다. 요약하면, 이 연구는 적응 반응을 촉진하는 AECCD의 강력한 보조제 활성을 확인했습니다. 이 연구는 AECCD 다당류 보조제의 개발을 위한 토대를 마련했습니다.
2. 재료 및 방법
2.1. 시약
오발부민(OVA), 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2, 5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT), 폴리믹신 B(PMB), 콘카나발린 A(ConA), 지질다당류(LPS), 미토마이신 C 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)은 Sigma(미국)에서 구입했습니다. 소태아혈청(FBS)은 Biological Industries에서 구입했습니다. 세포 계수 키트{11}}(CCK{12}})는 Biosharp(중국)에서 구입했습니다. 염소 항-마우스 IgG/IgG1/IgG2a-HRP 접합체는 Southern Biotech(USA)에서 구입했습니다. Inject Alum은 Thermo Scientific Pierce(미국)의 제품이었습니다. GM-CSF는 Peprotech(미국)의 제품이었습니다. 형광 표지된 항체(항-CD{20}}PE, 항-CD{22}}APC, 항-CD8a-FITC, 항-CD{27}}PE, 항-CD62L-PE, 항-MHCII -FITC/Percp-cy5.5, anti-IL{37}}PE, anti-IFN- -PE, anti-CD86-APC, anti-CD40-FITC/PE, anti- CD11c-PE/FITC, 항-CD{47}}APC), Golgistop, Cytofix/Cytoperm 및 Perm/Wash 버퍼는 모두 BD Bioscience(USA)의 제품입니다. 규제 T 세포 염색 키트는 eBiosciences(USA)에서 구입했습니다. TAK{49}}는 MedchemExpress(중국 상하이)에서 왔습니다. PDTC는 Beyotime Biotechnology(중국)의 회사였습니다. 다중 분석물 흐름 분석 키트는 Biolegend(미국)에서 구입했습니다.
2.2. AECCD C. 데저티콜라의 제조
(바우처 표본 번호 CD10041602)는 Jiang He 교수가 식별했습니다. AECCD는 물 추출, 에탄올 침전 및 약간의 변형이 있는 탈단백질화 방법으로 얻었다(Zhang et al., 2018). 간단히 말해서 재배시스탄체데저티콜라먼저 물로 여러 번 추출한 다음 1:4의 부피비로 에탄올을 첨가하여 조다당류를 밤새 침전시켰다. 그런 다음 얻은 조 다당류를 Sevag 방법으로 단백질을 제거했습니다(Liu et al., 2012). 안트론-황산법(Dubois et al., 1951)으로 설탕의 총 함량은 76.82%로 검출되었습니다.
2.3. 적외선 분광 분석
유기 작용기를 분석하기 위해 KBr이 있는 AECCD를 적외선(IR) 스펙트럼 측정을 위해 펠렛으로 압축했습니다. 샘플의 IR 스펙트럼은 4000-400cm-1 내에서 결정되었습니다.
시스탄체허브홍보하다면역성 있는응답
2.4. 생체 내 실험
2.4.1. 동물 예방접종
Xinjiang Medical University(Urumqi, China)의 암컷 C57BL/6 마우스와 ICR 마우스(6주령)를 3일 동안 순응시켰다. 모든 실험 절차는 Xinjiang University의 Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering의 동물 실험 윤리 위원회의 규정(BRGE-AE001)에 따라 수행되었습니다.
마우스를 OVA 단독 또는 다른 농도의 AECCD와 함께 OVA로 피하 면역화하고 14일째에 다음과 같이 다른 그룹에 따라 부스팅했습니다(각 그룹에서 6마리 마우스): 대조군(0.9% NaCl), OVA 그룹( 1{19}} ug OVA), AECCD-H 그룹(AECCD 800ug), OVA/AECCD-L 그룹(10ug OVA, AECCD 200ug), OVA/AECCD-M 그룹(10ug OVA, AECCD 400ug) ), OVA/AECCD-H 그룹(10ug OVA, AECCD 800ug) 및 OVA/Alum 그룹(10ug OVA, Alum100ug). 0.9% NaCl 100μL의 백신 제형을 각 마우스의 등 피부의 두 개의 다른 부위(각 부위에서 50μL)에 주사했습니다. 예방 접종 후, 안와 뒤 신경총에서 혈액 샘플을 수집하고 혈청을 수집하여 IgG 검출의 추가 분석을 위해 -80 oC에 보관했습니다. 비장세포 증식 및 사이토카인, T 세포 하위 집합, DC 표면 마커 및 Treg의 검출은 동일한 백신 접종 프로토콜 후에 수행되었습니다.
2.4.2. 항체 분석
OVA에 대한 혈청 내 IgG 역가는 이전에 언급된 1차 백신 접종 후 14, 28, 42 및 56일째에 ELISA에 의해 결정되었습니다(Zhang et al., 2018). 21일째에 IgG1 및 IgG2a를 측정하였다. 450 nm/630 nm에서의 흡광도는 리더기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 구하였다. 항체 반응의 결과는 IgG 역가로 표시되고, IgG1 및 IgG2a 이소타입은 해당 흡광도로 표시됩니다.
2.4.3. 비장세포 증식 분석
마우스의 비장세포 증식 분석은 제조업체의 지침에 따라 CCK{0}} 분석 키트로 수행되었습니다. 첫 번째 면역 후 21일째에 면역된 마우스의 비장에서 비장 세포를 분리하고 분쇄 후 적혈구를 용해시켰다. 비장세포(1 × 106개 세포/웰)를 OVA(10ug/mL), OVA{5}}(10ug/mL), ConA(10ug/mL) 및 LPS(10ug/mL)로 자극했습니다. 이틀 동안 빈 세포를 대조군으로 사용했습니다. 증식 활성은 570/630 nm의 파장에서 자극된 세포와 자극되지 않은 세포의 흡광도 비율을 계산한 자극 지수(SI)로 표현하였다.
2.4.4. 배수 림프절 및 비장의 T-림프구 표현형 분석
면역화된 마우스의 림프절 및 비장으로부터의 비장세포 현탁액을 위에서 언급한 방법에 따라 얻었다(Zhang et al., 2018). 세척 후 샘플(1 x 106 cells/well)을 anti-CD{5}}PE, anti-CD{7}}APC, anti-CD8a-FITC, 항CD{12}}PE 및 항CD62L-PE. T-림프구의 수준은 유세포 분석에 의해 조사되었습니다. T-림프구 표현형의 결과는 CD4 플러스 T 세포(퍼센트), CD8 플러스 T 세포(퍼센트), CD44 플러스 T 세포(퍼센트) 및 CD62L 플러스(퍼센트) T 세포의 백분율로 표시됩니다.
2.4.5. 사이토카인 수준의 유세포 분석
세포내 사이토카인 염색 분석을 위해 비장 림프구를 분리하고 첫 번째 면역 후 21일째에 단일 세포 현탁액으로 처리했습니다(Zhang et al., 2017). OVA(10ug/mL)로 자극된 샘플(2 x 106 cells/mL)을 4시간 동안 인큐베이션했습니다. 이어서 골지스톱을 12시간 동안 첨가하였다. 그런 다음 샘플을 세척하고 차단하고 항-CD{9}}APC 또는 항-CD8a-FITC 항체로 30분 동안 염색했습니다. Cyto fix/Cytoperm으로 고정 및 투과화한 후, 샘플을 항-IL{15}}PE 또는 항 -IFN- -PE 항체로 라벨링했습니다. 사이토카인의 수준을 결정하기 위해 흐름 분석을 수행했습니다.
2.4.6. 비장의 DC 활성화 및 Treg 세포 추정
DC와 Treg가 향상된 기능에서 역할을 하는지 조사하기 위해면역성 있는응답OVA에 대해, 첫 번째 백신 접종 후 3일째에 DC 성숙 평가를 위해 면역화된 마우스의 비장 림프구를 수확했습니다(Zhang et al., 2017). 세포를 각각 차단하고 항-CD11c-PE/FITC, 항-CD{6}}PE, 항-CD86-APC, 항-CD{10}}APC 및 항-MHCII- 30분 동안 FITC. 세포를 유세포 분석에 의해 분석하였다. 첫 번째 면역화 후 21일에 Treg를 마우스 조절 T 세포 염색 키트로 테스트했습니다. 비장세포를 세포 표면 마커용 항-CD{17}}FITC로 염색한 다음, 제조업체의 지침에 따라 항-CD{19}}APC 및 항-Foxp{21}}PE로 세포내 염색을 수행했습니다. CD4 + CD25 + Foxp3 + 세포의 수준은 유세포 분석에 의해 결정되었습니다.
시스탄체 공장 추출물은 촉진면역성 있는응답
2.5. 시험관내 실험
2.5.1. DC 생성, 세포 생존율 및 내독소 수준
C57BL/6 마우스의 골수에서 유래한 DC는 이전에 설명한 방법에 따라 얻었다(Inaba et al., 1992). 간단히 말해서, 세포를 RPMI{3}} 완전 배지(20ng/mL GM-CSF 및 5ng/mL IL-4)로 배양했습니다. 6일 후, 모든 현탁된 세포를 후속 분석을 위해 미성숙 DC로서 수집하였다. 비부착 세포에서 CD11c와 DC의 비율은 유세포 분석에 의해 94%로 결정되었습니다.
제조업체의 지침에 따라 CCK{0}} 키트를 사용하여 AECCD 시 마우스의 DC 및 비장세포의 세포 생존력을 검출했습니다. DCS 및 비장세포로부터 세포를 얻은 다음 다양한 농도의 AECCD(0, 10, 100, 400, 800 및 1600ug/mL)로 자극했습니다. 세포 생존율은 대조군의 흡광도에 대한 처리군의 흡광도의 비율) × 100%로 표현하였다.
AECCD에서 내독소의 영향을 배제하기 위해 AECCD(100, 200 및 400 ug/mL)와 LPS(100 ng/mL)를 60분 동안 PMB(100 ug/mL)로 전처리한 후 DC(5 × 105개 세포/mL)를 전처리된 AECCD(100, 200 및 400ug/mL) 및 LPS와 함께 12시간 동안 인큐베이션했습니다. 위의 처리 후 CD40, CD{13}}, CD80 및 MHCII의 수준을 평가했습니다.
2.5.2. DC 표현형 분석
공동자극 분자의 수준은 시험관내 실험을 통해 성숙을 평가하기 위해 결정되었습니다. 6일째에 DC를 AECCD(20, 100, 200 및 400ug/mL) 또는 LPS(100ng/mL)로 12시간 동안 처리했습니다. 그런 다음 DC를 표면 분자로 염색하고 유세포 분석으로 분석했습니다.
2.5.3. 시험관 내 DC에 의한 사이토카인 생산
세포 배양 상층액을 채취하여 사이토카인 수준을 측정하기 위해 ELISA 키트 또는 CBA 방법이 포함된 다중 분석물 흐름 분석 키트를 사용했습니다. 모든 실험 단계는 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다.
2.5.4. 동종 혼합 림프구 반응(MLR)
BALB/c 마우스의 비장세포를 RPMI{0}} 배지에서 무균적으로 얻었다(Zhang et al., 2018). 성숙한 C57BL/6 DC(다양한 농도의 AECCD 또는 LPS가 있는 상태에서 성숙)를 37℃에서 60분 동안 50ug/mL Mitomycin C로 전처리했습니다. 세척 후 DC를 1:5 또는 1:10의 비율로 비장세포와 2일 동안 혼합하였다. 세포 증식은 MTT 분석에 의해 결정되었습니다.
2.5.5. 억제제 중화 실험
TLR{0}}관련 NF-κB 경로를 조사하기 위해 수집된 DC를 24-웰 플레이트에 로드한 다음 TAK-242(5μM) 또는 PDTC(5μM)로 전처리했습니다. , 각각. 1-시간 배양 후, 세포를 다양한 농도의 AECCD(100, 200 및 400ug/mL) 또는 LPS(100ng/mL)로 24시간 동안 자극했습니다. 그런 다음, 배양 상청액에서 표면 분자 및 사이토카인의 발현 수준을 상기 기술된 방법에 따라 결정하였다.
3. 결과
3.1. FTIR 분광법
그림 1에서 AECCD의 주요 흡수 피크는 3342.95cm-1에서 OH 신축 진동에 해당하는 글리코시드 구조의 특징적인 흡수 피크였다. 1657.39cm-1의 피크는 OH 굽힘 진동에 기인합니다. 1411.{11}} cm-1에서의 흡수는 OH 또는 C-H 및 C-O 신축 진동에 기인합니다. 1018.38 cm-1의 피크는 또한 CO 및 C–O–C 글리코시드 밴드 진동을 나타냅니다.
그림 1. AECCD의 FTIR 스펙트럼.
3.2. OVA 특이적 혈청 항체 반응
면역화된 마우스의 혈청을 테스트하여 OVA에 대해 생성된 항체(IgG, IgG1 및 IgG2a)의 존재를 확인했습니다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, OVA/AECCD-M으로 면역화된 마우스의 IgG 역가는 더 높은 총 IgG를 유도하였다(역가: 220,000, 25{{3{35}}}}, 000 및 250,000) OVA 그룹(역가: 100,{11}}, 100,{13}} 및 120,{15}})에 비해 1차 예방접종 후 28, 42, 56일에 명반 그룹(역가: 250,{17}}, 250,{19}} 및 270,{21}})에 가깝습니다. OVA/AECCD-M/H는 OVA 그룹과 비교하여 IgG1 수준을 유의하게 향상시켰고(P < 0.05),="" ova/aeccd-m/h="" 그룹과="" alum="" 그룹="" 간의="" 차이는="" 유의하지="" 않았습니다(p=""> 0.05). OVA/AECCD-M/H는 또한 OVA 그룹 및 Alum 그룹에 비해 IgG2a 수준을 현저하게 향상시켰습니다(그림 2B 및 C)(P < 0.05).="" 강화된="" igg2a="" 수치는="" igg2a를="" 필요로="" 하는="" 질병을="" 예방할="" 수="">면역성 있는응답.
그림 2. 혈청 내 OVA 특이적 항체 역가 및 IgG 아이소타입. ELISA를 사용한 항체에 대한 1차 및 추가 면역화 후에 혈청 샘플을 수집하였다. (A) 풀링된 혈청의 IgG 역가는 첫 번째 면역화 후 14, 28, 42 및 56일에 평가되었습니다. (B-C) IgG1 및 IgG2a는 첫 번째 면역 후 21일째에 측정되었습니다. 데이터는 평균 ± SD(n=6)로 표시됩니다. *P < 0.05="" ova와="">
3.3. 세포 면역 반응
비장 림프구 증식은 OVA 또는 OVA{0}}로 재자극한 MTT 분석에 의해 조사되었습니다. 증식 분석에서 OVA/AECCD-M은 모두 OVA 그룹에 비해 OVA, OVA{2}}, Con A 또는 LPS에 노출된 후 비장세포 증식을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났습니다. OVA 및 OVA323-339는 Alum 그룹보다 높은 증식 반응을 유의하게 개선했습니다(그림 3)(P <>
그림 3. 생체 내 AECCD 처리 시 비장세포 증식. 비장세포를 OVA, OVA{2}}, ConA 또는 LPS로 재자극하고 첫 번째 면역 후 21일째에 MTT 방법으로 측정했습니다. 세포 증식은 자극 지수(SI)로 표시되었습니다: (A–B) OVA 및 OVA의 자극 지수323-339. (C–D) ConA 및 LPS의 자극 지수. 데이터는 평균 ± SD(n=5)로 표시됩니다. *피<0.05, **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001="" compared="" to="" ova;="" #p="" <="" 0.05="" and="" ##p="" <="" 0.01="" compared="" to="" ova/="">
3.4. 배수 림프절 및 비장에서 T 세포 하위 집합의 활성화
면역화된 마우스로부터 림프절 및 비장을 수확하여 1차 백신접종 후 21일째에 T 세포 서브세트를 검출하였다. OVA/AECCD-M 그룹의 림프절에서 T 세포 하위 집합(CD4 + , CD8 + , CD44 + T 세포)의 백분율은 OVA 그룹 및 Alum 그룹보다 유의하게 높았습니다(그림 4A-D)(P < 0.05).="" 비장에서="" t="" 세포="" 하위="" 집합(cd4="" +="" ,="" cd8="" +="" ,="" cd44="" +="" 및="" cd62l="" +="" t="" 세포)의="" 비율은="" ova="" 그룹의="" 비율보다="" 유의하게="" 높았습니다(그림="" 4e-j)(p="">< 0.05).="" 이러한="" 발견은="" aeccd가="" 세포="">면역성 있는응답.
그림 4. 생체 내에서 림프절과 비장을 배출하는 T 세포 하위 집합의 수준. 첫 번째 백신 접종 후 21일에 림프절과 비장의 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 T 세포 하위 집합을 검출했습니다. (A-D) 림프절에서 CD4 플러스, CD8 플러스 및 CD44 플러스 T 세포의 백분율. (E–J) 비장에서 CD4 플러스 , CD8 플러스 , CD44 플러스 및 CD62L 플러스 T 세포의 백분율. 데이터는 평균 ± SD(n=5)로 표시됩니다. *P < {{10}}.{14}}5,="" **p="">< 0.{18}}1="" 및="" ***p="">< 0.001,="" ova="" 비교.="" ova/명반과="" 비교하여="" #p="">< 0.05="" 및="" ##p=""><>
3.5. 생체 내 재자극된 비장세포에 의해 분비되는 사이토카인
면역화된 마우스의 비장으로부터의 Th1/Th2 사이토카인은 첫 번째 백신 접종 후 21일째에 세포내 염색에 의해 결정되었습니다. CD4 + IL-4, CD4 + IFN- 및 CD8 + IFN-의 수준은 OVA/AECCD-M 그룹에서 OVA 그룹 및 Alum 그룹보다 유의하게 더 높았습니다(P < 0="" .05,="" 그림="" 5).="" 차이점은="" aeccd가="" th1/th2="" 반응,="" 특히="" t="" 세포="" 매개를="" 자극할="" 수="" 있음을="">면역성 있는응답.
그림 5. 생체 내 T 세포의 항원 특이적 사이토카인 분석. 면역화된 마우스로부터의 비장세포를 세포내 사이토카인 염색에 의한 첫 번째 면역화 후 21일째에 검사하였다. (A) CD4와 IL-4의 비율. (B–C) CD4 + IFN- 및 CD8 + IFN-의 백분율. 데이터는 평균 ± SD(n=5)로 표시됩니다. *P < {{10}}.{14}}5="" 및="" **p="">< 0.01,="" ova="" 비교.="" ova/명반과="" 비교하여="" #p=""><>
3.6. 생체 내 DC 성숙 및 Treg
DC 활성화는 적응 면역을 시작할 수 있습니다. 면역화된 마우스에서 DC 성숙에 대한 AECCD의 효과를 첫 번째 면역화 후 3일째에 평가하였다. OVA/AECCD-M은 OVA 그룹에 비해 DC에서 가장 높은 수준의 CD40, CD8{14}}, CD{4}} 및 MHCII를 유도했으며 OVA/AECCD-M 간의 차이 그룹과 명반 그룹은 유의했습니다(그림 6A-D)(P < 0.05).="" ova/aeccd-m="" 그룹에서="" cd4="" +="" cd25="" +="" foxp3="" +="" treg의="" 빈도는="" ova="" 그룹의="" 빈도보다="" 극적으로="" 낮았습니다(그림="" 6e)(p="">< 0.05).="" 이러한="" 데이터는="" aeccd가="" dc를="" 활성화하고="" treg="" 주파수를="" 낮출="" 수="" 있음을="">
그림 6. 생체 내 DC 성숙 및 Treg에 대한 AECCD의 효과. ICR 마우스의 비장세포를 사용하여 첫 번째 면역화 후 3일 또는 21일에 DC 및 Treg에서 공동자극 분자를 검출했습니다. (A–D) CD11c와 DC에 대한 CD4{11}}, CD{4}}, CD8{13}} 및 MHCII의 비율입니다. (E) CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg의 백분율. 데이터는 평균 ± SD(n {{1{15}}}})로 표시됩니다. *P < 0.05="" 및="" **p="">< 0.01,="" ova="" 비교;="" ova/명반과="" 비교하여="" #p="">< 0.05="" 및="" ##p=""><>
3.7. 세포독성 및 내독소 오염 분석
2일 동안 다양한 농도의 AECCD로 처리한 후 DCS의 세포와 마우스의 비장세포를 사용하여 CCK{1}} 키트로 잠재적인 세포독성을 결정했습니다. 대조군과 비교하여 DC 및 비장세포의 세포 생존율에서 억제된 증식 반응은 유의하지 않았다(그림 7A-B)(P > 0.05). 이러한 결과는 10-1600 ug/mL 농도의 AECCD가 대조군과 비교하여 DC 및 비장세포에 유의한 세포독성을 나타내지 않았음을 보여줍니다(P > 0.05). 따라서 후속 실험에서 AECCD의 농도는 1600 ug/mL 미만으로 설정되었습니다.
DC 활성화에 대한 AECCD의 영향에서 내독소 오염의 간섭을 배제하기 위해 LPS 중화 효과로 널리 알려진 항생제인 PMB를 사용하여 내독소 오염을 배제했습니다(Morrison and Jacobs, 1976). 그림 7C–F에서 볼 수 있듯이 PMB가 있는 AECCD 처리된 DC에서 CD40, CD8{15}}, CD{5}} 또는 MHC-II 발현 수준은 유의한 변화를 보이지 않았습니다( P > 0.05). 그러나 PMB가 있는 LPS 처리 DC에서 CD40, CD80 CD{12}} 및 MHC-II 발현 수준의 급격한 감소가 관찰되었습니다(P < 0.001).="" 이러한="" 결과는="" aeccd에="" 내독소="" 오염이="" 없음을="">
그림 7. AECCD에서 유도된 DC 성숙에 대한 PMB의 세포독성 및 효과. (A-B) MTT 방법으로 세포 생존력을 결정하기 위해 마우스의 DCS 및 비장세포를 AECCD의 존재 하에 2일 동안 배양하였다. (C–F) DC는 60분 동안 PMB의 존재/부재에서 전처리된 AECCD 또는 LPS와 함께 12시간 동안 인큐베이션되었습니다. CD11c와 DC에 대한 CD4{11}}, CD80, CD{6}} 및 MHCII의 백분율이 결정되었습니다. 데이터는 평균 ± SD(n =3)로 표시됩니다. **P < 0.01="" 및="" ***p="">< 0.001="" pmb가="" 있는="" 그룹과="">
3.8. 체외에서 DC의 표현형 성숙 및 기능적 활성화
위의 면역화 실험에 기초하여 시험관내 AECCD로 처리한 후 DC의 표현형 성숙을 추가로 조사했습니다. 6일째에 미성숙 DC를 주어진 농도의 AECCD 또는 LPS로 자극하여 표면 분자를 분석했습니다. AECCD 유도 세포 성숙은 CD40, CD80 CD{3}} 및 MHC II의 비율이 용량 의존적으로 크게 증가하는 것을 특징으로 합니다(P < 0.001,="" 그림="" 8a-d).="" 100ng/ml="" lps로="" 자극한="" 후에도="" dc의="" 유사한="" 표현형="" 성숙이="" 관찰되었습니다.="" 분석="" 데이터는="" aeccd가="" dc="" 성숙을="" 향상시키는="" 것으로="">
위의 결과로부터 AECCD는 DC의 표현형 성숙을 향상시켰다. 시험관 내에서 DC 기능에 대한 AECCD의 영향을 관찰하기 위해 AECCD 처리된 DC가 1:5 또는 1:1의 DC-비장세포 비율에서 MLR에서 동종 T 세포 증식을 자극하는 능력을{8}} 조사했다. 다른 농도의 AECCD로 처리된 DC는 처리되지 않은 DC와 비교하여 상당한 T 세포 증식을 유도했습니다(그림 8E-F)(P < 0.001).="" dc="" 성숙은="" 사이토카인의="" 생산을="" 유도할="" 수="" 있습니다.="" 다음으로,="" aeccd="" 또는="" lps로="" 처리된="" dc의="" 상층액을="" elisa="" 키트로="" 검출하였다.="" dc의="" 상등액에서="" il{10}}="" 및="" tnf-의="" 수준은="" 용량="" 의존적="" 방식으로="" 극적으로="" 증가했습니다(p="">< 0.001,="" 그림="">
그림 8. 시험관 내 AECCD 처리 시 DC의 표현형 성숙 및 기능적 활성화. (A-D) 6일째에 DC는 AECCD 또는 LPS의 주어진 농도로 12시간 동안 처리되었습니다. 세포를 항체로 염색하고 유세포 분석으로 측정했습니다. CD11c 및 DC에서 CD4{17}}, CD8{19}}, CD{5}} 및 MHCII의 평균 형광 강도(MFI)입니다. (E–F) 다른 농도의 AECCD 또는 LPS로 처리된 C57BL/6 DC를 BALB/c 마우스의 비장세포와 MLR에서 1:5 또는 1:1의 비율로{21}} 2일 동안 혼합했습니다. 세포 증식은 MTT 분석에 의해 결정되었습니다. (G–H) DC의 배양 상등액을 ELISA 키트로 IL{14}} 및 TNF-a에 대해 분석했습니다. 데이터는 평균 ± SD(n =3)로 표시됩니다. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01="" 및="" ***p="">< 0.001:="" 미처리="" dc에="" 비해;="" lps와="" 비교하여="" #p=""><>
3.9. TLR4, DC의 AECCD 수용체
DCS는 막 수용체에 의한 세포 신호 전달을 시작할 수 있습니다. 에게결정하다AECCD 처리된 DC 성숙에 참여하는 TLR4의 역할, TLR4 억제제 TAK-242로 전처리한 후 DC를 AECCD의 주어진 농도로 자극한 다음 DC의 활성화 상태를 유세포 분석기로 조사했습니다. . 배양 상청액에서 사이토카인의 발현 수준은 다중 분석물 흐름 분석 키트로 분석되었습니다. AECCD에 의해 유도된 CD4{11}}, CD8{19}}, CD{8}} 및 MHC-II의 상향 조절은 TLR4 경로를 차단함으로써 유의하게 억제되었습니다(P < 0.01,="" 그림="" 9a-d).="" 또한,="" 처리되지="" 않은="" 대조군과="" 비교하여="" tak{15}}로="" tlr4를="" 차단하면="" ifn-,="" tnf-="" 및="" il{18}}="" 생성에="" 더="" 유의한="" 억제="" 효과가="" 있었습니다(p="">< 0.01,="" 그림="" 9e-g).="">
그림 9. AECCD 처리된 DC에서 TLR4 신호의 활성화. 미성숙 DC를 12시간 동안 TAK-242의 부재 또는 존재 하에 AECCD로 처리한 후, 표현형 성숙을 유세포 분석기로 조사하고 상청액의 사이토카인 수준을 CBA 방법으로 측정했습니다. (A–D) CD11c와 DC에 대한 CD4{13}}, CD80, CD{7}} 및 MHCII의 백분율. (E–G) IFN-, TNF- 및 IL{11}} 수준. 데이터는 평균 ± SD(n=3)로 표시됩니다. **P < 0.01="" 및=""><0.001 compared="" to="" the="" group="" with="">
3.10. TLR4-관련 NF-κB 경로를 통한 AECCD에 의한 DC 활성화
NF-κB 억제제 PDTC로 전처리된 미성숙 DC를 AECCD로 12시간 동안 자극한 후 AECCD 처리된 DC의 표면 분자 및 사이토카인의 발현이 NF-κB에 의해 조절되는지 여부를 조사하기 위해 다음으로 공동자극 분자 및 사이토카인의 발현 수준을 측정하였다. 유세포분석기. AECCD에 의해 유도된 CD40, CD8{15}} CD86 및 MHC-II의 수준은 상응하는 억제제로 NF-κB 경로를 차단함으로써 처리되지 않은 대조군에 비해 유의하게 감소했습니다(P < 0.001,="" 그림="" 10a-d).="" 동시에="" ifn-,="" tnf-="" 및="" il{14}}의="" 발현도="" pdtc에="" 의해="" 유의하게="" 억제되었습니다(p="">< 0.05,="" 그림="">
그림 10. AECCD 유도 DC 활성화에서 NF-κB의 관련. DC는 PDTC의 부재 또는 존재 하에 24시간 동안 AECCD로 처리되었다. (A–D) CD11c와 DC에 대한 CD4{14}}, CD8{16}}, CD{6}} 및 MHCII의 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되었습니다. (E–G) 상청액의 IFN- , TNF- 및 IL{10}} 수준은 CBA 방법으로 측정했습니다. 데이터는 평균 ± SD(n=3)로 표시됩니다. PDTC가 있는 그룹과 비교하여 *P < 0.05,="" **p="">< 0.01="" 및="" ***p=""><>
4. 토론
현재 TCM의 다양한 다당류가 인간 및 동물 백신의 보조제로 조사되었습니다(Sun et al., 2018; Rey-Ladino et al., 2011). 이 연구에서는 AECCD의 면역 조절 효과와 DC의 1차 활성화 기전을 일련의 실험을 통해 생체 내 및 시험관 내에서 조사하여 적응성을 평가했습니다.면역성 있는응답OVA 및 DCS의 활성화 상태에 대한. 생체 내 실험은 AECCD가 OVA 특이적 IgG 및 IgG 이소타입의 생성을 현저하게 촉진하고, 비장세포 증식을 강화하고, T 세포 활성화 및 사이토카인(IL{1}}/IFN-)을 유도함을 보여주었습니다. 게다가 AECCD는 DC 성숙을 개선하고 Treg를 감소시켰습니다. 이러한 발견은 AECCD의 효율적인 보조제로서의 기능이 DC 성숙을 촉진하고 Treg를 억제함으로써 실현되었음을 시사하였다. 시험관 내 실험은 AECCD가 TLR4-관련 NF-κB 경로를 통해 DC의 표현형 성숙, 사이토카인 섹션 및 타자극 활성을 촉진하는 것으로 나타났습니다. 이러한 실험 결과는 AECCD가 면역 강화 자극제로서 상당한 잠재력을 가지고 있음을 나타냅니다.
각 보조제는 다른 항원에 대한 고유한 면역 특성을 가지며, 이는 보조제가 다른 질병에 적용 가능성이 있음을 나타냅니다. 첫째, AECCD와 OVA의 동시 투여의 보조제 특성은 적응에 미치는 영향을 결정함으로써 테스트되었습니다.면역성 있는응답쥐에서. 많은 연구에서 면역 자극 활성이 특정 범위 내에서 용량에 정비례하는 것으로 나타났습니다(Li et al., 2020; Reed et al., 2020; Zhang et al., 2017). 유사하게, 연구에서 항체 및 이소타입의 분석은 특정 용량 범위에서 AECCD가 OVA-특이적 IgG, IgG1 및 IgG2a 반응을 향상시켰고 AECCD의 중간 용량이 최적 용량인 것으로 밝혀졌다. 후속 실험에서 우리는 주로 최적의 중간 용량에서 AECCD의 자극 효과를 조사했습니다. 중간 용량의 AECCD는 면역된 마우스에서 비장세포 증식 반응을 유의하게 증가시켰으며, 이는 AECCD가 세포를 촉진한다는 것을 나타냅니다.면역성 있는응답OVA 반대. 이러한 결과는 AECCD가 체액 및 세포면역성 있는응답, 이는 보조제 잠재력과 관련이 있습니다.
유발된 실질적인 T 세포 활성은 질병 근절에 도움이 될 수 있습니다. 동안면역성 있는응답, 활성화된 T 세포는 비장과 림프절을 포함한 이차 림프 조직에 도달할 수 있습니다(Steinman, 2012). 중간 용량의 AECCD는 배수 림프절과 비장에서 CD4, CD8, CD44 및 CD62L T 세포 반응을 상당히 향상시킬 수 있기 때문에 백신 효능을 효과적으로 개선했습니다. 활성화된 CD8 T 세포는 IFN-를 분비하여 병원체 박멸을 매개합니다. 증식된 CD4 T 세포는 Th1 세포와 Th1 세포로 분화되었다. Th1 세포는 Th1 사이토카인을 분비하여 림프구 증식을 자극하고 Th2 세포는 Th2 사이토카인을 분비하여 항체 생산을 향상시킵니다(Seder et al., 2008). 연구에서 CD4 + IL{16}}, CD4 + IFN- 및 CD8 + IFN-의 수준은 중간 용량에서 AECCD에 의해 증가했습니다. AECCD는 균형 잡힌 Th1/Th2 반응을 유도하고면역성 있는응답사이토카인 네트워크를 변경함으로써
면역증강제는 특정 면역을 유도하고 결과를 조절해야 합니다.면역성 있는응답여러 지점에서 DC 상태를 규제함으로써(Carrera Silva et al., 2013). DC에서 표면 분자의 발현은 DC 성숙을 평가하기 위한 중요한 지표이며 일반적으로 T 림프구 분화와 상관관계가 있습니다(Steinman, 2012). 이 연구에서 AECCD는 OVA에 대한 보조제로 사용될 때 공동자극 분자의 발현을 향상시키고 DC 성숙을 촉진했습니다. 이것은 AECCD가 체액과 세포를 촉진하는 방법 중 하나일 수 있습니다.면역성 있는응답. 한편, AECCD는 또한 백신 접종 후 균형 잡힌 면역을 제공하는 CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg의 빈도를 감소시켰습니다. 우리의 결과는 TCM의 다양한 다당류가 DC 성숙의 조절자라는 최근 발견을 뒷받침했습니다(Bo et al., 2019; Li et al., 2015; Zhu et al., 2016).
적응 활성화면역성 있는응답다당류 보조제에 의한 면역은 주로 DC의 특정 수용체에 의한 인지를 통해 매개됩니다(Akira, 2004). TLR 관련{1}경로를 통해 활성화된 DC는 감염에 대한 중요한 매개체로서 다양한 면역조절제를 분비할 수 있습니다(Akira, 2007). 따라서 후속 실험에서 우리는 시험관 내에서 DC에 대한 AECCD의 자극 효과의 분자 메커니즘을 예비 조사했습니다. AECCD의 세포 독성을 관찰하기 위해 먼저 마우스의 DC 및 비장 세포의 세포 생존력을 결정했습니다. 10–1600 ug/mL의 AECCD는 DC와 비장세포에 세포독성을 나타내지 않았습니다. LPS 오염을 배제하기 위해 AECCD를 PMB로 전처리했습니다. AECCD 처리된 DC에서 CD40, CD80 CD86 및 MHC-II의 발현 수준은 감소하지 않았지만 PMB는 LPS 처리된 DC에서 공동자극 분자의 발현을 효과적으로 억제했습니다. 이것은 AECCD에 내독소 오염이 없음을 입증했습니다. 다음으로 DC의 활성화 상태를 추가로 조사했습니다. LPS로 처리된 DC와 유사하게, AECCD로 처리된 DC는 CD40, CD80 CD{17}} 및 MHC II의 수준을 증가시켰을 뿐만 아니라 염증을 유발하는 사이토카인의 생성을 용량 의존적으로 증가시켰습니다. DC의 기능적 성숙의 매개변수. MLR에서 동종 T 세포의 증식 능력은 AECCD 처리된 DC에서 평가되었습니다. AECCD는 동종 T 세포를 프라이밍하고 활성화할 수 있습니다. DC는 먼저 Mitomycin C로 사전 처리된 다음 이 시약을 제거하기 위해 완전히 세척되었으므로 DC에 대한 AECCD의 효과는 유사분열 활성에 기인하지 않을 수 있습니다. 실험 데이터는 DC의 표현형 성숙 및 기능적 활성화가 AECCD의 자극에 기인할 수 있음을 보여주었습니다.
많은 TCM 다당류가 TLR4를 통해 DC 성숙을 자극할 수 있습니다. TLR{2}}관련 다운스트림 경로의 구성원인 NF-κB는 DC의 표현형 및 기능적 성숙을 조절하고 이에 관련된 다양한 유전자의 발현을 유도하는 데 중요한 역할을 합니다.면역성 있는응답(Qi et al., 2016; Re and Strominger, 2001; Wei et al., 2016; Zhu et al., 2013). 시험관 내 실험을 통해 AECCD가 DC 성숙을 촉진하고 TAK-242(TLR4 억제제) 및 PDTC(NF-κB 억제제)가 CD40, CD80, CD{9}} 및 MHC의 발현 수준을 감소시킨다는 것을 발견했습니다. -II 및 AECCD 처리된 DC에서 IFN-, TNF- 및 IL{13}}의 분비 수준, 이러한 결과는 TLR4 및 NF-κB가 AECCD로 유도된 DC 활성화 및 사이토카인 분비에 관여함을 나타냅니다. 이러한 결과는 AECCD가 보조제로서 DC에 대한 항원 표적화를 개선했기 때문에 이전에 보고된 연구와 일치했습니다.
요약하면, 우리의 결과는 AECCD가 지속성 및 Th1/Th2 반응, 특히 T-세포 매개된 반응을 유도함을 보여주었습니다.면역성 있는응답OVA 반대. AECCD는 TLR{0}}매개 NF-κB 경로를 통해 DC를 활성화하여 면역조절제의 생산과 동종 T 세포 증식을 향상시킵니다. AECCD는 백신 개발에서 효과적인 보조제로 사용될 수 있습니다. 그러나 AECCD 활성화 DC의 구성 요소를 결정하기 위해 정확한 구성 요소 분석이 수행됩니다. AECCD가 면역원성을 향상시키는 방법에 관한 메커니즘에 초점을 맞추고, 면역증강제 제형 및 백신 투여 경로의 최적화를 포함하여, 감염성 질병에 대한 효과적인 백신 면역증강제를 설계하기 위한 목적으로 AECCD의 면역조절 성분 및 특정 면역증강제 특성을 추가로 탐구할 것입니다.
시스탄체 데저티콜라 혜택촉진하다면역성 있는응답
저자 기여
데이터 수집, 분석 및 해석: Shuangshuang Feng, Xiumei Yang, Xiang Weng. 원본 초안 작성: Shuangshuang Feng, Xiang Weng.
자금 조달:장 에일리언.
조사:장 에일리언.
방법론:Ailian Zhang, 빈 왕.
감독:장 에일리언.
경쟁적 이해관계 선언
저자는 이 연구와 관련된 이해 상충이 없습니다.
감사의 말
이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단(National Natural Science Foundation of China)의 지원을 받았습니다[보조금 번호 31960164 및 31660259]. 기금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정, 준비 또는 원고에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
저자는 친절하게 자료와 신분증을 제공한 Xingguo Zheng 교수와 Jiang He(중국 우루무치)에게 감사드립니다.
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