5 장 효소 발효 동안 효소 활성의 변화

5 장 효소 발효 동안 효소 활성의 변화

 

프로테아제, 리파제 및과산화물 디스 뮤 타제 (SOD)주요 기능적 효소입니다미생물 효소 건강 식품. 그들 중에서,프로테아제역할을합니다음식에서 단백질의 가수 분해를 촉진합니다인체에서. 또한 일부 죽어가는 세포를 분해하고 피부 표면과 모공의 먼지를 제거하고 각질 제거에 역할을 할 수 있으므로 목욕 제품에 널리 사용됩니다. 리파제는 지방산과 글리세롤 사이의 에스테르 결합에 작용하고, 가수 분해 기질은 일반적으로 천연 오일이다. 따라서 많은 체중 감량 식품 및 건강 제품에서 볼 수 있습니다. 많은 여성들이 체중 감량 주제에 대해 매우 우려하고 있기 때문에 효소가 전 세계적으로 빠르게 인기를 얻었습니다.효소는 리파제가 풍부합니다이는 높은 연구 가치와 응용 프로그램 전망을 가지고 있음을 의미합니다.잔디의 분리 반응을 촉진하는 특수 금속 효소입니다.과산화물 음이온 라디칼따라서과산화물 음이온 라디칼 제거몸에. 유기체의 보호 장벽이므로 의료 분야에서 널리 사용됩니다.
이 장에서는 사과 효소를 예로들 수 있습니다. 발효 초기 단계에서 시작하여과산화물 디스 뮤 타제의 활동실험 그룹 및 대조군에서 아밀라제, 리파제, 프로테아제 및 셀룰라아제를 15 일마다 측정하여 전체 발효 과정 동안 효소 활성의 변화하는 경향을 포괄적으로 그리고 체계적으로 반영 하였다.

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5.1 재료 및 방법

5.1.1 재료

(1) 실험 재료

멸균 조건 하에서 멸균 물로 신선한 사과를 씻고 멸균 수술 테이블에서 자연적으로 말린 후 껍질을 벗기고 나중에 사용하십시오. 1 : 1의 질량 비율로 멸균 유리 항아리에 백설탕과 사과를 첨가하십시오. 실험에 필요한 박테리아를 활성화하고 최적의 체계 (이 작동 단계는 대조군에 대해 생략)에 따라 효소에 접종하고 밀봉하여 시원하고 건조한 장소에 놓습니다. 3 개월간의 실온 발효 후, 샘플을 섭취하여 펄프를 함유하는 전체 효소 액체를 얻고 필터링하십시오. 상청액을 실험 샘플로 취하십시오. 샘플을 10에서 원심 분리 한 후 고속 원심 분리기에서 15 분 동안 000 rpm을 원심 분리 한 후, 관련 데이터를 측정하는 데 사용됩니다. 불필요한 오염을 피하기 위해 효소를 만드는 과정에서 모든 작업은 멸균 조건 하에서 수행되었다는 점에 주목할 가치가 있습니다.

(2) 주요 기기
실험에 필요한기구는 3.1.1 (2)과 동일합니다.

 

5.1.2 방법

(1) 과산화물 디스 뮤 타제 (SOD) 활성의 결정 [66]
피로 갈롤 용액을 일정 기간 동안 25도 일정한 온도 수조에서 예열시켰다. 표 5.1에 따르면, 적절한 양의 완충액, 증류수 및 동일한 부피의 염산 또는 피로 갈롤 용액을 시험관에 첨가 하였다. 일정한 온도 수조는 2 0 분에 대해 25 도로 설정되었습니다. 혼합 액체가 빨리 흔들린 후, 즉시 큐벳에 주사되었습니다. 샘플의 흡광도 값 A0은 분광 광도계를 사용하여 325nm의 파장에서 30 초마다 측정되었습니다.

Tab.5.1 인접한 벤젠의 양을 추가

 

SOD 활성을 결정하는 방법은 기본적으로 위의 작업과 동일합니다. 유일한 차이점은 Pyrogallol을 첨가하기 전에 {{0}}. 5 mL의 다른 농도의 효소 샘플 용액을 먼저 첨가해야한다는 것입니다. 동시에, 동일한 양의 증류수가 첨가된다. 측정 된 흡광도는 ASOD입니다. 억제 속도 및 SOD 효소 활성은 공식 5.1 및 공식 5.2에 따라 계산됩니다 : 억제 속도 (%)=(△ a 0- △ ASOD)/0} × 100 (5.1) 효소 활성 (u/ml) =}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}=====(5.2) 여기서 : V1은 용액의 총 부피, ML; V2는 효소 샘플 용액, ML의 부피; △ A0은 피로 갈롤의자가 산화 속도입니다. ASOD는 샘플 흡광도 값의 변화율입니다. N은 아밀라제 활성의 희석 다중 (2) 측정이다.이 연구는 요오드-전략 비색 방법을 사용하여 아밀라제 활성을 결정했다. 특정 운영 단계는 "국가 임상 실험실 운영 절차"를 나타냅니다 [67]. 주로 다음 두 가지 점으로 나뉩니다.

 

solless 용액 준비
완충 전분 용액 ({{0}}}. 4g/l) : 염화나트륨 9g의 9g, 22.6g의 무수 단 디움 수소 포스페이트 및 12.5g의 무수 칼륨 dihydrogen 포스페이트 12.5g, 5 {}}}}}}}}}}}}}}}}} {}}} {}}} 용액이 끓을 때까지; 정확하게 0.4g의 가용성 전분 무게를 측정하고 10ml의 증류수에 용해시키고 골고루 섞은 다음 페이스트에 적응합니다. 상기 비등 용액에 페이스트에 조정 된 전분 용액을 주입하고, 전분이 끓는 물 용액으로 완전히 옮길 때까지 비이커를 반복적으로 씻으십시오. 유리 막대로 균등하게 교반 한 후 실온으로 냉각하고 5ml의 37% 모발 포름 알데히드 용액을 첨가하고 증류수로 1L로 희석합니다. 용액의 pH 값은 7.0 ± 0.1이며, 사용하기 위해 냉장고에 배치됩니다.
요오드 스톡 솔루션 (0. 1 mol/l) : 깨끗한 500ml의 1.7835g 칼륨 요오드와 22.5g의 요오드 라이드 무게
비이커는 천천히 그리고 균일하게 4.5ml 농축 염산을 첨가하고, 첨가 과정에서 연속적으로 저어주고, 증류수로 스케일로 희석하고, 균등하게 저어줍니다. 사용하기 위해 냉장고에 넣고 갈색 시약 병에 보관하십시오.
요오드 애플리케이션 솔루션 ({{{0}}. 01mol/L) : 일정량의 요오드 스톡 솔루션 (0.1 mol/L)을 복용하고 증류수로 10 번 희석하고 냉장고에 넣고 최대 1 개월 동안 보관하십시오.

② 실험 작동 단계
효소 용액을 가져 와서 생리 식염수로 10 번 희석하고 표 5.2에 따라 작동합니다. 분광 광도계의 파장은 660nm이고 비색 컵의 빛 경로는 10mm입니다. 증류수로 0을두고 각 튜브의 흡광도를 읽으십시오. 기본 계산 공식 5.3에 기초하여 아밀라제 활성을 계산하십시오.

 

탭 .5.2 아밀라아제 결정 단계

 

(3) 리파제 활성의 결정

결정 방법은 qb/t {{0}} [68]에 따라 수행되었다. 2% 효소 시험 용액을 0. 리파제 활성은 실험에서 소비 된 수산화 나트륨의 부피에 기초하여 계산되었다. 규칙은 : pH 7.5 및 주변 온도에서 40 도의 주변 온도에서, 1 mL의 액체 효소 용액은 1 분 동안 리파아제를 가수 분해하여 1 μmol의 지방산을 생성하며, 이는 하나의 리파제 활성 인 U/mL로 발현된다. 이어서, 리파제 활성은 공식 5.4에 따라 계산되었다 : 효소 활성 (U/ml)=(ba) × C/0.05 × 50 × 1/15 × N=200/3 × (BA) × C × N (5.4) 여기서 BA의 부피는 ML; A는 블랭크 대조군 ML에 소비 된 수산화 나트륨 표준 용액의 부피이다; C는 수산화 나트륨 표준 용액의 농도 인 mol/L이고; 0.05는 수산화 나트륨 표준 용액의 농도의 전환 계수이며; 50은 수산화 나트륨 용액의 지방산 함량이다; 15 분은 반응 시간입니다. N은 희석 다중입니다.

(4) 프로테아제 활성의 결정

약간의 수정으로 gb/t 23527-2009 [69]를 참조하십시오.
① 표준 곡선의 준비
0, 1 0, 20, 30, 40 및 50mg/L 인 상이한 질량 농도로 1ml의 티로신 표준 용액을 섭취하고 5ml의 0.4mol/L 탄산나트륨 용액 및 1ml의 Folin 시약 용액을 첨가하십시오. 40 도의 온도에서 20 분 동안 반응합니다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 제거하고 분광 광도계를 사용하여 680nm의 파장에서 용액의 흡광도 값을 측정하십시오. 수평 축로 티로신 농도로 티로신 표준 곡선을 그립니다.

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protease 프로테아제 활성의 결정
실험 그룹 : 10 g/L의 농도로 1ML의 카제인 용액을 복용하고 테스트 할 샘플 용액 1ml과 골고루 혼합하고, 40 도의 주변 온도에서 10 분 동안 반응합니다. 서있는 후 여과제를 여과하고 얻은 후, 여과 액을 1ml, 5ml의 탄산나트륨 용액 및 1ml의 폴린 시약을 복용하고, 균일하게 혼합하고, 40 도의 주위 온도에서 20 분 동안 반응하고; 분광 광도계를 사용하여 680nm의 파장에서 용액의 흡광도 값을 측정하십시오.
블랭크 대조군 : 샘플 용액 1ML을 테스트하고, 트리클로로 아세트산을 첨가하고, 프로테아제를 불 활성화시키기 위해 완전히 반응하며, 다른 작동 방법은 실험 그룹과 동일하다.

포뮬러 5.5에 따라 프로테아제 활성을 계산하십시오.
프로테아제 활성 (u/ml)=Ak × 4/10 (5.5) 여기서 : A는 실험 그룹에서 효소 용액의 흡광도; K는 흡광도가 1과 같을 때 티로신의 양입니다. 도 4는 반응 용액의 총 부피, ML이다; 10은 반응 시간, 최소입니다.

(5) 셀룰라아제 활성의 결정 [70]

효소에서 셀룰라아제의 활성은 일반적으로 단위 시간당 일정량의 효소 용액에 의해 방출 된 포도당의 양에 의해 발현된다. 셀룰라아제 활성을 측정하기 위해 여과지 방법을 사용하는 원리는 셀룰라아제가 필터 종이에서 셀룰로오스를 분해하여 포도당과 같은 2 차 대사 산물을 생성 할 수 있고 포도당은 3, 5- 공룡 복합체를 형성 할 수 있다는 것입니다. 이 반응의 색은 비교적 밝으며, 이는 포도당의 양과 생산 된 다른 환원 설탕의 양을 잘 결정할 수 있습니다.

 

①3, 5- Dinitrosalicylic acid 비색제
정확하게 무게 1 0 g의 3, 5- 5- Dinitrosalicylic acid 168-169 도로 증류수로 용해시키고, 수산화 나트륨과 200g의 칼륨 소다수량 타르트 레이트를 첨가하고, 고체가 완전히 용히질이 될 때까지 계속 가열 될 때까지 계속 가열됩니다. 0.5g의 무수 황산 나트륨 황산 나트륨, 첨가 과정에서 완전히 용해 될 때까지 연속적으로 저어주고, 균일하게 혼합 한 후 가열을 중단하고, 실내 온도로 냉각하고, 1000ml의 부피 플라스크로 옮기고, 증류수로 마크로 옮기고, 일주일 동안 실내 온도에 놓고, 감독제를 획득하고, 갈색 재 겔 병에 보관합니다.율의 동성애 가수 분해
정확하게 피펫 {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1.5, 2.0ml의 2ml의 Acetic acid-sodium acetate 완충액 용액 4.5 인 2.0ml. 40도에서 5 분의 일정한 온도 수조 후, 각각 1 × 1cm2의 면적이있는 6 조각의 크로마토 그래피 여과지를 추가하고 즉시 타이밍을 시작하여 반응 시간을 60 분으로 정확하게 만듭니다. 10 분 동안 반응을 위해 끓는 수조로 즉시 옮기면 셀룰라아제는 활성을 잃게됩니다.

 

 

③ 색 반응
효소 샘플 용액을 가져 가서 3ml의 3ml, 5- Dinitrosalicyl acid incad alicetric agent al alcon al alcent al alcent al alcent al alcent al alcent al alcent al alcent al alcent al alcent al alcent al alcent al alcent a in al in all in weal in al
plucose 포도당 표준 곡선의 그림
1mg/ml 농도의 포도당 표준 용액을 정확하게 준비하고 증류수를 사용하여 0, 0. 2, 0. 4, 0. 6, {8}}. 3, 5- Dinitrosalicylic Acid Ancolimetric Agent는 색상 발달 반응을 수행하기 위해 ①에서 제조된다. 포도당 농도로 표준 곡선을 수평 축으로, 수직 축으로 흡광도를 플로팅하십시오.
계산
효소 용액으로 색상 발달 후 흡광도 값 A를 사용한 다음 포도당 표준 곡선에 따라 포도당 방출량 M을 계산 한 다음 공식 5.6에 따라 계산하십시오.
셀룰라아제 활성 (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) 여기서 : m은 포도당 방출량, ug; t는 효소 가수 분해 시간, 최소이다; M은 반응의 효소 함량, UG/mL이다.