신경퇴행성 질환과 중추신경계의 급성 신경학적 손상에서의 샤페론 매개 자가포식 2부
Aug 05, 2024
4. CMA 활동을 분석하기 위한 실험적 연구 도구
이 섹션에서는 in vitro 및 in vivo에서 CMA 활성을 분석하는 데 사용할 수 있는 실험 연구 도구에 대해 설명합니다. CMA 기능 분석뿐만 아니라 CMA 활동과 관련된 정보를 얻기 위해 일반적으로 사용되는 방법.
CMA(Certified Management Accountant)는 전문관리회계사 자격증으로, 관리회계 분야에 대한 충분한 운영능력과 전문지식을 갖춘 사람을 인증하는 것을 목표로 합니다. 인간의 두뇌 능력인 기억은 정보, 지식 또는 경험을 기억하는 능력을 말합니다.
CMA와 메모리 사이에는 특정한 관계가 있습니다. 우선, CMA 시험에서는 응시자가 많은 지식과 개념을 기억해야 하며 동시에 이러한 지식을 적용할 수 있는 기술을 숙달해야 합니다. 따라서 뛰어난 기억력은 CMA 시험에서 좋은 결과를 얻기 위해 매우 중요한 역할을 할 것입니다.
둘째, 기억력은 학습과 연습을 통해 향상될 수 있으며 이는 CMA 시험 공부에도 도움이 됩니다. 예를 들어, 지식 포인트를 반복적으로 검토하고, 다양한 방법으로 정보를 학습 및 암기하고, 기억 기술을 사용함으로써 기억력을 향상시키고 응시자가 CMA 시험에 필요한 지식 포인트와 기술을 더 잘 습득하도록 도울 수 있습니다.
마지막으로, CMA를 공부하는 것은 단순한 시험이 아니라 전문적인 자질의 향상이기도 합니다. 경력 개발에서 전문적인 능력을 더 잘 발휘하려면 업무를 더 잘 완료하는 데 도움이 되는 특정 기억 능력이 자연스럽게 필요합니다.
즉, CMA와 메모리 사이에는 밀접한 관계가 있습니다. 기억력을 향상시키려는 노력은 좋은 성적을 받는 데 도움이 될 뿐만 아니라 업무를 더 잘 완수하고 경력이 발전함에 따라 개인적인 가치와 경력 성취를 실현하는 데도 도움이 됩니다. 기억력 향상이 필요하다고 볼 수 있는데, 시스탄체 데세르티콜라에는 항산화, 항염증, 항노화 효과가 있어 뇌의 산화와 염증을 줄여주어 건강을 보호할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 신경계. 또한 Cistanche Deserticola는 신경 세포의 성장과 복구를 촉진하여 신경망의 연결성과 기능을 향상시킬 수 있습니다. 이러한 효과는 기억력, 학습능력, 사고속도 향상에 도움을 줄 수 있으며, 인지기능 장애 및 퇴행성 신경질환의 발생을 예방할 수도 있습니다.
4.1. CMA 활동 모니터링을 위한 유용한 분석
CMA의 주요 분자 성분 양의 변화를 평가하는 것은 CMA 활성을 평가하는 간접적인 방법으로 사용될 수 있습니다[46]. 또한, CMA 활성 리소좀의 수와 분포를 분석하여 CMA 활성의 변화를 추론할 수 있습니다[46].
그러나 이러한 분석은 CMA 상태와 관련된 데이터만 제공합니다. 따라서 이러한 분석은 기능적 분석으로 보완되어야 합니다[47]. 주요 CMA 구성 요소의 변화를 평가하기 위한 면역블로팅 및 영상화는 CMA 활동을 평가하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다.
LAMP2A의 리소좀 수준은 CMA에 대해 제한되어 있기 때문에[48], 리소좀 내 LAMP2A 단백질의 풍부함 변화는 일반적으로 CMA의 활성과 상관관계가 있습니다. 따라서 영상 평가에서 리소좀 막의 LAMP2A 존재를 분석해야 합니다[47].
리소좀이 풍부한 분획 또는 적어도 막세포 분획을 사용하는 LAMP2A에 대한 면역블로팅은 전체 전체 세포 용해물을 사용하는 것보다 더 유익합니다[46]. 리소좀-hsc70의 수준도 CMA 활성과 관련이 있습니다[49].
그러나 hsc70은 가장 풍부한 세포 샤페론 중 하나이며 리소좀에 위치한 분획은 소량입니다. 따라서 전체 세포 용해물에서 hsc70에 대한 면역블롯팅은 CMA에 대한 정보가 없습니다[46]. 리소좀 마커(예: LAMP1)와 hsc70의 동일 위치화를 사용하여 CMA 활성 리소좀을 검출할 수 있습니다[49].
CMA가 활성화되면 전체 리소좀 풀에 비례하여 hsc70과 함께 공존하는 이러한 리소좀의 수가 증가합니다[12]. 또한, hsc70에 대한 면역금 염색을 사용한 전자 현미경 분석은 CMA 활성 리소좀 풀에 대한 정보도 제공할 수 있습니다[49].
세포나 조직에서 분리된 리소좀을 사용한 분석에서 잘 알려진 CMA 기질(예: GAPDH)의 수준 증가는 CMA의 활성 감소를 나타낼 수 있습니다[46].
일반적으로 CMA 기질은 전위 후 급속히 분해됩니다[6]. 따라서, 리소좀 프로테아제 억제제(즉, 류펩틴)로 처리되거나 처리되지 않은 모델 사이에서 세포 또는 동물의 CMA 기질의 리소좀 수준을 비교하면 CMA 값의 플럭스를 측정할 수 있습니다[24].
4.2. 기능적 분석
여러 기능 분석을 통해 세포, 조직 및 분리된 소기관에서 시간 경과에 따른 CMA 활동을 추적할 수 있습니다.
4.2.1. 세포내 단백질 분해 평가
총 세포질 단백질의 약 30%가 CMA에 의해 분해될 수 있습니다. 그러나 CMA에 의해 분해되는 세포질 단백질의 실제 분율은 세포 유형 및 세포 상태에 따라 다릅니다[6].
따라서 CMA를 통해 분해되는 세포 단백질 풀을 측정하는 것은 CMA 경로의 전반적인 활성을 결정하는 일반적인 방법입니다[46].
방사성 표지된 아미노산과 리소좀 프로테아제 또는 기타 자가포식 경로의 억제제를 사용하는 펄스 및 추적 실험을 사용하여 다른 경로에 의해 관리되는 단백질과 CMA 분해를 겪는 단백질을 구별할 수 있습니다[50].
4.2.2. 포토컨버터블 CMA 리포터
또한, 인공 형광 CMA 리포터의 리소좀 결합을 모니터링하는 방법은 CMA를 통한 기질 전달 및 분해를 추적하는 데에도 유용할 것입니다[51].
광전환 형광 리포터를 사용하여[51], 광전환된 단백질과 다른 형광 채널의 리소좀의 연관성을 추적하는 것이 가능합니다. 세포당 형광점 수의 증가는 CMA 활성화의 좋은 지표가 될 것입니다[46].
4.2.3. 분리된 리소좀을 사용한 CMA의 시험관 내 분석
서로 다른 자가포식 경로 사이의 혼선으로 인해 손상되지 않은 세포에서 CMA 활동을 정확하게 평가하기가 어렵습니다[41]. 따라서 CMA 경로의 동적 분해 과정과 관련된 모든 기능적 단계를 별도로 분석해야 합니다[46,49].
CMA 활성을 분석하기 위한 가장 신뢰할 수 있는 접근법은 분리된 리소좀을 사용하여 CMA를 시험관 내에서 재구성함으로써 얻어집니다[52]. CMA에서 활성인 리소좀의 특정 부분을 분리하면 CMA 구획에 있는 내인성 CMA 기질의 함량을 분석할 수 있습니다[47].
분리된 리소좀은 또한 CMA 공정-기질 결합, 리소좀 흡수 및 리소좀 분해와 관련된 단계를 따르기 위해 시험관 내에서 CMA의 재구성을 허용합니다[50].
리소좀 프로테아제 억제제로 처리한 후 CMA 기질과 함께 배양하면 기질에 결합되어 리소좀으로 전위된 물질(결합 및 흡수)을 측정할 수 있습니다[39].
단백질 분해가 예방되지 않은 리소좀신에 결합된 기질의 양을 할인함으로써 흡수량을 계산하는 것이 가능할 것입니다[39,53].
분리된 리소좀 분획은 또한 리소좀 막에서 CMA 구성 요소의 함량, 번역 후 변형 및 구성의 변화를 직접 비교할 수 있게 해줍니다. 분리된 리소좀에서 리소좀 LAMP2A 또는 lys-hsc70 수준의 감소는 CMA 활성 감소를 나타내는 반면[54,55], LAMP2A 수준의 증가는 CMA 활성의 상향 조절을 시사합니다[56].
또한, 주어진 시간에 다량체 복합체로 조립된 리소좀 LAMP2A의 비율은 분리된 리소좀의 청색 전기영동 및 LAMP-2A에 대한 면역블롯을 사용하여 결정할 수 있습니다[57].
5. 신경퇴행성 질환과 CMA
뉴런은 유사분열 후 세포이며 스트레스 조건 하에서 세포 항상성을 유지하기 위해 효율적인 단백질 분해 기계가 필요합니다[58,59]. CNS의 단백질 분해 과정이 손상되면 이상 또는 손상된 단백질의 응집이 발생하는데, 이는 많은 신경퇴행성 질환의 뚜렷한 특징입니다.
CMA의 기능 장애가 CNS에 영향을 미치는 다양한 신경퇴행성 질환의 다양한 병리 현상과 연관되어 있다는 실질적인 증거가 수집되었습니다[1,14].
이러한 질병에서는 PD의 α-synuclein[60], AD의 Tau단백질[61], HD의 헌팅틴(Htt)[62,63] 및 TDP와 같은 다양한 병원성 단백질이 CMA의 기질로 확인되었습니다.{{5} } ALS 및 FTLD [64,65].
5.1. 파킨슨병
PD는 가장 흔한 신경퇴행성 질환 중 하나입니다. PD의 주요 병리학적 특징은 흑색질 내의 도파민성 뉴런의 점진적인 손실과 루이소체의 단백질-시누클레인의 응집입니다.
수많은 연구에서 CMA의 손상이 PD의 주요 발병과 관련이 있음이 나타났습니다[4,66]. PD 환자의 경우 뇌의 LAMP2A 단백질 수준이 감소하여 CMA 활동이 약화되었음을 나타냅니다 [67,68].
이전의 많은 연구에서는 CMA분해 경로의 억제가 α-synuclein의 축적을 유발하고 이는 도파민성 뉴런의 점진적인 손실과 관련이 있음을 시사했습니다[8].
중요하게도, 가족성 PD에서 확인된 α-시누클레인의 돌연변이 형태 A53T 및 A30P는 CMA에 의해 분해될 수 없습니다. 더욱이, 이러한 돌연변이 형태는 리소좀 막의 LAMP2A에 단단히 결합하여 결과적으로 시험관 내에서 다른 CMA 기질의 정상적인 분해를 억제합니다[60,69]. 류신 풍부 반복 키나제 2 단백질(LRRK2)의 G2019S 돌연변이는 가족성 PD의 병리학적 원인이 될 수 있습니다. [70].
G2019S 돌연변이는 리소좀 막에서 CMA 전위 복합체의 동적 조립을 억제하여 PD의 마우스 모델과 돌연변이 LRRK2 PD 환자의 뇌에서 CMA의 기능 장애를 유발합니다[25]. 또한, LRRK2의 병원성 돌연변이 형태는 세포질 Hsc70에 결합하고 CMA 구성 요소와 비정상적으로 상호 작용하여 시험관 내에서 다른 CMA 기질의 분해 및 신경 세포 단백질 항상성을 차단합니다 [25,71].
유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 L1(UCH-L1)은 LAMP-2A, Hsc70 및 Hsp90과 물리적으로 상호작용하며 CMA 경로의 조절 메커니즘에 관여합니다[72]. 이전 연구에서 I93M 돌연변이 형태 UCH-L1의 유전자는 단일 PD계열에서 확인되었습니다[73].
또한 UCH-L1의 I93M 돌연변이가 LAMP2A의 세포질 영역과의 상호작용을 비정상적으로 강화하여 시험관 내에서 CMA 경로를 억제하는 것으로 보고되었습니다[74]. 더욱이, UCH-L1 포유류 세포의 I93M 돌연변이 형태의 발현은 시누클레인 양의 CMA 억제와 관련된 증가를 유도했습니다[74].
이러한 발견은 UCH-L1의 I93M 돌연변이 형태와 CMA 기계의 비정상적인 상호작용이 α-synuclein의 응집과 연관된 PD의 병인의 기저에 있을 수 있음을 시사합니다. DJ-1로도 알려진 파킨슨병 단백질 7(PARK7)은 산화 저항성을 포함한 다양한 세포 활동에 관여하는 다기능 단백질.
PARK7/DJ-1는 미토콘드리아 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다[75]. DJ-1 유전자의 돌연변이가 상염색체 열성 및 초기 형태의 PD를 매개하는 것으로 보고되었습니다[76]. DJ-1 결핍은 리소좀에서 LAMP2A의 분해를 가속화하여 -synuclein의 응집을 초래합니다[77 ].
대조적으로, DJ-1는 CMA를 조절하여 α-synuclein의 축적을 억제할 수 있었습니다[78]. 전반적으로 CMA의 기능 장애를 일으키는 다양한 분자 메커니즘이 PD의 발병 기전의 기초가 되는 것으로 간주됩니다.
그러나 CMA와 관련된 병리학적 기전은 대체로 불분명한 상태로 남아 있습니다. CMA 과정과 PD의 실제 병리 사이의 관계를 명확히 하기 위해서는 추가 연구가 필요할 것입니다.
5.2. 알츠하이머병
AD는 노인에게 가장 흔한 신경퇴행성 질환이다. AD의 주요 병인은 단백질 항상성 손상으로 인한 아밀로이드 플라크 형성 및 타우 응집입니다. AD와 관련된 여러 단백질이 CMA 기질로 확인되었습니다. 이러한 단백질 기질의 CMA 분해는 AD 환자에서 손상된 것으로 나타났습니다 [45,61,79].
아밀로이드-올리고머의 점진적인 축적은 AD의 중추 독성 사건입니다[80,81]. 최근 연구에 따르면 여러 KFERQ 모티프로 아밀로이드 올리고머를 태깅하면 엔도솜과 리소좀으로의 진입이 촉진되어 인간의 일차 배양 피질 뉴런을 신경 독성으로부터 보호하는 것으로 나타났습니다[82]. 아밀로이드 전구체 단백질(APP)은 처리되어 생성될 수 있기 때문에 AD에서 중요한 병원성 분자입니다. 아밀로이드-[83].
APP에는 Cterminus에 KFERQ와 유사한 모티프가 포함되어 있습니다. 이 모티프는 APP-C 말단 단편의 축적을 방지하기 위해 APP의 정상적인 처리 및 분해에 중요합니다[84]. 최근 연구에 따르면 APP는 Hsc70에 결합하는 CMA 기질이라는 것이 밝혀졌습니다[85].
APP의 CMA 분해를 억제하면 세포독성이 향상됩니다. 또한, Hsc70 과발현인 메트포르민에 의한 CMA의 활성화는 AD 마우스 모델에서 축적된 뇌 아밀로이드 플라크 수준을 감소시키고 분자 및 행동 AD 표현형을 역전시켰습니다[85]. Tau는 일반적으로 신경 세포의 미세소관을 안정화시키는 세포질 단백질입니다.
타우단백질은 CMA 표적화 모티프를 갖고 있으며 CMA 경로에 의해 분해될 수 있습니다. Tau 과인산화 및 신경섬유매듭 형성을 초래하는 돌연변이 Tau 단백질의 응집은 AD 및 관련 타우병증의 특징입니다[86,87].
또한, 돌연변이 Tau 단백질은 LAMP2A와 비정상적으로 상호작용하여 리소좀 내강으로의 전위를 억제하여 CMA 활성을 손상시킬 수 있습니다. 칼시뉴린 1 조절인자(RCAN1)는 CMA의 기질이며[45] AD 환자에서 증가합니다[88].
RCAN1은 타우 단백질의 칼시뉴린 의존성 탈인산화 억제제입니다. 중요한 것은 RCAN1의 수준을 증가시킴으로써 CMA 활성을 억제할 수 있으며 그에 따라 CMA의 다른 기질의 분해를 손상시킬 수 있다는 것입니다[45].
5.3. 헌팅턴병
HD는 통제되지 않는 움직임, 치매 및 정서적 장애를 특징으로 하는 후기 발병 신경퇴행성 장애입니다. HD는 선조체 및 피질 뉴런에 돌연변이 Htt 단백질이 축적되고 응집되어 발생하는 우성 유전 질환입니다.
Htt에는 비정상적으로 확장된 N-말단 폴리글루타민(polyQ) 관이 포함되어 있습니다[62,63,89]. Htt 분해 기능 장애가 HD의 주요 병인으로 제시됩니다.
이전 연구에서는 CMA가 HD의 세포 및 마우스 모델에서 돌연변이 Htt의 분해에 관여한다는 것을 보여주었습니다[62]. Htt는 추정 KFERQ 모티프를 보유하고 있으며 CMA, Hsc70 및 LAMP2A의 핵심 구성 요소와 상호 작용합니다. 또한, 폴리Q 관이 확장된 돌연변이 Htt는 시험관 내에서 CMA 흡수가 손상된 것으로 나타났습니다.
CMA뿐만 아니라 거대자가포식(macroautophagy)도 Htt 분해에 관여합니다[90]. Htt는 분해 과정에서 LAMP2A와 거대자가포식 관련 단백질 Atg7 모두에 결합할 수 있습니다[89,91,92].
CMA 활성은 질병의 초기 단계에서 헌팅턴병의 세포 및 동물 모델에서 상향조절되는 것으로 알려졌습니다. 그러나 질병 말기에는 CMA의 활성이 감소한다[91]. 이러한 발견은 CMA 활동의 초기 증가가 거대자가포식의 비효율성에 대한 보상적 조절일 수 있음을 시사합니다. 리소좀 LAMP2A 수준의 감소는 HD 후기 단계에서 CMA 기능의 상실이 있음을 나타냅니다[91].
5.4. 근위축성 측삭 경화증 및 전두측두엽 변성
ALS와 FTLD는 임상적, 병리학적 특징이 많은 신경퇴행성 질환이다[93]. 전사활성화 반응 DNA 결합 단백질 43 kDa(TDP-43)는 RNA 대사의 여러 측면을 조절하는 리보핵 단백질입니다.
신경 세포에서 TDP{0}} C-말단 단편의 축적은 ALS 및 FTLD 환자에서 흔히 발견됩니다[65]. 따라서 TDP-43 축적은 이러한 질병의 특징으로 널리 간주됩니다.
TDP-43 단백질은 Hsc70에 결합하는 KFERQ 유사 모티프를 포함하며 CMA 과정에 의해 분해될 수 있습니다[94,95]. Hsc70 발현은 산발성 ALS 환자의 림프단핵구에서 감소하고 TDP{6}} 축적에 기여하는 것으로 보고되었습니다[64].
TDP-43의 KFERQ 유사 모티프에 있는 돌연변이는 CMA를 통한 분해를 방해하여 TDP-43의 축적을 유도하고 배양된 세포에서 CMA의 억제를 유도할 수 있습니다[94]. CMA는 TDP의 생리학적 및 병리학적 형태의 전환을 제어하는 데 도움이 될 수 있습니다-43 [94].
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