추상적인:Vitis amurensis 뿌리는 멜라닌 생성 및 tyrosinase 억제 활성 평가를 통해 피부 미백 가능성이 있는 것으로 보고되었습니다. 본 연구에서는 tyrosinase inhibitory assay와 결합된 LC-Q-TOF-MS를 이용하여 미백성분을 신속하게 선별하고 반응표면법으로 피부 미백 기능성 소재로 사용하기 위한 추출공정을 최적화하기 위해 V. amurensis 뿌리를 활용하였다. 결과는 V. amurensis 뿌리가 생물 검정과 결합된 LC-Q-TOF-MS에 의해 예측된 바와 같이 두 개의 스틸벤 올리고머, ε-vinifera(1) 및 비타민 B(2)에 의해 티로시나제 억제 효과를 나타냄을 보여주었습니다. 피부 미백 성분의 최적 추출 조건(메탄올 농도 66%, 용제량 140mL, 추출 시간 100분)을 설정한 결과 수율은 6.20%, 티로시나아제 저해 활성은 87.27%였다. 각 요인과 그에 상응하는 반응과의 관계는 Pearson 상관분석을 통해 확인하였다. 용매 부피는 수율과 명확한 선형 관계를 보였고, 메탄올 농도는 화합물 1과 2 및 이들의 조합에 대한 티로시나제 억제 활성과 강한 선형 관계를 가졌습니다. 전반적으로, 생물분석과 결합된 LC-Q-TOF-MS는 알려진 활성 성분뿐만 아니라 새로운 활성 성분을 효과적으로 찾을 수 있는 가능성이 있음이 입증되었습니다. 비타민은 새로운 천연 잠재 미백제로 제안될 수 있습니다.

관련 연구에 따르면,담배"생명을 연장하는 기적의 허브"로 알려진 일반적인 허브입니다. 주요 구성 요소는시스타노사이드등의 다양한 효과가 있습니다.산화 방지제, 항염증, 그리고면역 기능 촉진. cistanche와피부 미백cistanche의 항산화 효과에 있습니다배당체. 인간 피부의 멜라닌은 티로신의 산화에 의해 생성됩니다.티로시나아제, 산화 반응에는 산소의 참여가 필요하므로 체내의 산소가 없는 라디칼은 멜라닌 생성에 영향을 미치는 중요한 요인이 됩니다. Cistanche 포함시스타노사이드, 항산화 제이며 신체의 자유 라디칼 생성을 감소시켜 멜라닌 ​​생성을 억제 할 수 있습니다.

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키워드:비티스아무렌시스; 티로시나제 억제 분석과 결합된 LC-Q-TOF-MS; 반응 표면 방법론; 피어슨 상관관계

1. 소개

멜라닌은 포유동물의 피부와 모발의 색을 담당하고 자외선으로부터 피부를 보호하지만 과도한 멜라닌 생성과 피부의 멜라닌 축적은 주근깨, 기미, 검버섯, 흑피, 노인성 흑자 등의 과색소침착성 피부질환을 유발한다. 구리 함유 옥시다아제 효소로 알려진 티로시나아제는 멜라닌 생합성에 중요한 역할을 합니다. 효소는 두 가지 연속적인 산화 반응을 촉매했습니다. 첫 번째 단계는 L-티로신을 34-디하이드록시-L-페닐알라닌(L-DOPA)으로 수산화하는 것이고, 두 번째 단계는 L-DOPA를 도파퀴논. 도파퀴논은 자발적으로 중합되어 멜라닌을 생성할 수 있는 반응성이 높은 물질입니다[1-3]. 따라서, 티로시나제 억제제는 과색소침착 관련 피부 질환의 치료제 및 피부 미백제로 사용될 수 있다.

야생에서 자라는 포도종인 Vitis amurensis는 주로 아시아(한국, 중국, 일본)에 분포한다. 완전히 익은 과일은 생으로 섭취하며 자당, 포도당, 단백질, 비타민 등의 영양소가 풍부하여 포도주, 주스, 젤리, 잼의 원료로 이용된다. 또한 잎은 샐러드에 사용됩니다[4]. 그 뿌리와 줄기는 암, 신경통 및 복통 치료를 위한 전통 의학으로 사용되었습니다 [5,6]. 그 뿌리는 스틸벤(주성분), 프로시아니딘, 플라보노이드, 트리테르페노이드 및 기타 페놀 화합물로 구성됩니다. 지금까지 뿌리의 화학적 조성은 충분히 자세히 연구되었습니다. 특히 resveratrol, amurensin A, vitamin A, (plus)-ε-vinifera, amurensins C-M, ampelopsin A, D, ampelopsin E 등 다양한 stilbene oligomer가 보고되었다[6]. 뿌리의 메탄올 추출물은 B16F10 세포와 버섯 티로시나아제를 통한 3,{13}}dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) 산화에서 -멜라닌 세포 자극 호르몬 유발 멜라닌 생성에 대한 항멜라닌 생성 효과를 나타냅니다[7]. 또한 V. amurensis 추출물과 그 활성 화합물은 항산화, 항염증, 신경보호 및 항종양 효과를 나타냅니다[7-10].

바이오어세이와 결합된 LC-MS는 추출 및 분리 없이 천연물 성분의 화학적 프로필과 생물학적 활성을 동시에 확인할 수 있습니다. 따라서 최근 천연물에서 생체 활성 화합물을 효율적이고 신속하게 식별하는 데 사용되었습니다[11-13].

최적화는 실험 시스템 또는 제품의 최대 효율성을 허용하는 프로세스입니다. 반응 표면 방법론(RSM), 다변량 분석, 경험적 모델을 기반으로 한 수학적 및 통계적 기법을 사용한 실험 설계, 실험 설계와 결과 간의 상관 관계를 다항식 함수로 표현하는 등의 기법은 이상적인 최적화 조건을 최대 효율로 제공합니다. RSM은 식품 가공, 화학, 생물학 및 농업을 포함한 다양한 분야에서 널리 사용되는 정확하고 효율적인 최적화 방법입니다[14-16]. 지난 수십 년 동안 천연물을 함유한 의약품, 화장품 및 기능성 식품에 대한 관심이 증가했습니다. 결과적으로 이러한 제품 개발을 목표로 학계와 산업계에서 지속적인 연구가 진행되고 있습니다[17,18]. 이러한 연구의 첫 번째 단계는 천연 제품에서 생리 활성 성분을 추출하는 것입니다. 이때 추출시간, 온도, 액체-고체비, 용매의 부피 등 다양한 요인이 추출된 성분에 영향을 미치므로 생리활성 성분을 최대한 추출하기 위한 최적화가 필요하다.

우리가 아는 한, V. amurensis 뿌리 추출물의 티로시나제 억제 성분 및 최적화는 거의 보고되지 않았습니다[5,19]. 따라서 본 연구에서는 tyrosinase inhibitory assay와 결합된 LC-Q-TOF-MS를 이용하여 V. amurensis 뿌리로부터 tyrosinase 억제제를 신속하게 획득하고, V. amurensis 뿌리의 피부 미백제로서의 활용도를 넓히기 위한 추출 조건을 최적화하는 것을 목적으로 한다. RSM에 의해.

2. 결과 및 논의

2.1. V. amurensis의 뿌리 추출물을 사용한 Tyrosinase 억제 분석과 결합된 LC-QTOF MS

V. amurensis 뿌리의 80% MeOH 추출물은 상당한 티로시나제 억제 활성을 나타냈습니다(50 μg/mL에서 80.7 ± 0.8%, 표 S1). 분리 없이 V. amurensis 뿌리에서 티로시나제 억제 화합물을 확인하기 위해 티로시나제 억제 분석과 결합된 LC-QTOF-MS를 수행했습니다. V. amurensis 뿌리 추출물의 화학적 프로필은 첫 번째 실행에서 얻었고(그림 S1), 생체 활성 화합물은 두 번째 실행에서 30초마다 수집된 분획의 티로시나아제 억제 분석을 사용하여 식별되었습니다(그림 1). 19분에서 22분 사이에 상당한 tyrosinase 억제 활성을 가질 것으로 예상되는 질량 크로마토그램에서 2개의 피크가 있었고 화학적 프로파일링을 통해 그 구조가 stilbene dimer(1)와 stilbene tetramer(2)로 확인되었습니다(표 1).

2.2. V. amurensis 뿌리의 Tyrosinase 저해 성분 동정

먼저, EtOAc 분획물로부터 티로시나제 억제 활성이 있을 것으로 예상되는 두 가지 성분을 분리하여 생체 활성을 평가하였다. 분리된 화합물 1과 2의 구조는 각각 1H-NMR, 13C-NMR, 및 ESI-MS(그림 2, 그림 S2 및 S3, 표 S2). Tyrosinase inhibitory assay에서 화합물 1, 2, 코지산의 IC50 값은 각각 3.51, 10.74, 27.09 μM이었다. 두 화합물 모두 피부 미백 성분으로 알려진 코직산 양성 대조군보다 더 높은 티로시나제 억제 효과를 나타냈다(표 1 및 그림 S4). 이전 연구에서 ε-vinifera(1)는 티로시나제 억제 활성을 갖는 것으로 보고되었습니다[23]. 그러나 비타민 B(2)는 우리 연구에서 처음 확인되었습니다.

전반적으로 티로시나제 억제 분석 및 비타민 B(2)와 결합된 LC-MS의 예측 데이터와 상관 관계가 있는 결과는 새로운 티로시나제 억제제로서의 가능성을 보여줍니다. 또한 두 스틸벤 올리고머의 상당한 티로시나제 억제 활성 결과를 뒷받침하기 위해 분자 도킹 연구가 수행되었습니다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 화합물 1 및 2는 실험 데이터와 일치하는 양성 대조군인 코직산보다 더 높은 도킹 점수를 나타냈다. 그러나 화합물의 도킹 결과는 실험 결과와 상반됩니다. 화합물 1과 2의 상호작용 방식은 도 3에 기술하였다. 화합물 1은 수소결합 4개, 소수성 상호작용 2개, 파이-론 쌍 상호작용 1개를 형성하였고, 화합물 2는 수소결합 11개, 소수성 상호작용 7개, 반 데르 발스 상호작용 1개를 형성하였다. , 및 3 파이-고립 쌍 상호 작용. 그 결과, 화합물이 표적 단백질의 활성 부위에 삽입되어 티로시나제 활성을 억제할 수 있는 촉매 아미노산 잔기와 결합할 수 있음을 확인하였다. 또한 ε-vinifera(1)는 L-DOPA가 tyrosinase에 결합하는 동일한 부위에 결합하는 경쟁적 억제제로 보고되었습니다[23]. 비타민 B(2)가 ε-vinifera(1)와 동일한 부위에 결합하는 것을 관찰하여 비타민 B(2)가 새로운 경쟁적 억제제임을 확인하였다.

2.3. RSM을 이용한 V. amurensis 뿌리 추출의 최적화

V. amurensis 뿌리를 미백 기능성 소재로 활용하기 위해 Box-Behnken design(BBD)으로 최적의 추출 조건을 설계하여 추출 수율과 tyrosinase 저해 활성을 극대화하였다. 추출 수율, tyrosinase 저해 활성, 화합물 1의 양, 화합물 2의 양, 화합물 1과 2의 합의 양과 같은 독립 반응이 3개의 독립 변수(추출 시간, MeOH/물 농도 및 용매 부피)를 측정하였다(표 2). 변수의 범위는 추출 시간(40, 70 및 100분), MeOH 농도(40, 70 및 100퍼센트) 및 용매 부피( 35, 87.5 및 140mL) 예비 단일 요소 실험(데이터는 표시되지 않음)을 기반으로 합니다. 설계된 실험에서 얻은 값은 회귀 분석을 사용하여 변수 간의 상관 관계 다항식으로 표현되었습니다(표 S4–S13 및 그림 S5). 각 반응에 대해 개별 최적화를 수행한 결과(표 3) 100.00분으로 추출했을 때 수율이 6.21%, MeOH 64.78%, 140.{{42} }mL. Tyrosinase inhibitory activity(%)는 65.22분, MeOH 100.00%, 140.00 mL 조건으로 추출하였으며, 90.37%의 값을 나타낼 것으로 예측되었다. 65.74분에서 화합물 1의 양, MeOH 100.00퍼센트, 35.00 mL는 37.45 μg/mg로 예측되었고, 70.00분에서 화합물 2의 양은 MeOH 70.00%, 92.24 mL는 86.77 μg/mg로 예측되었습니다. 또한, 화합물 1과 2의 총 함량은 75.20분, MeOH 100.00%, 35.00 mL 조건에서 추출하였을 때 최대 108.10 µg/mg을 나타낼 것으로 예상되었다. 최적화된 조건에서 실험한 결과 6.19±0.36%, tyrosinase 저해활성 91.72±3.48%, 화합물 1 함량 36.54±1.78 µg/mg, 화합물 2 함량 85.74±16.57 µg/mg, 화합물 1과 {{85} }.10 ± 19.11 µg/mg을 얻었으며 각 변수에 대한 개별 응답은 이론적으로 예측된 ​​값과 5% 이하의 차이를 보였다. 추출 수율 및 티로시나제 억제 활성을 최대화하기 위해 다중 반응 최적화를 수행하였다(표 3). 최적화된 조건은 다음과 같습니다: 추출 시간, 100분; MeOH 농도, 66.38%; 및 용매 부피, 140mL. 이러한 조건을 사용하여 측정된 수율은 5.95 ± 1.13%이고 티로시나아제 억제 활성은 85.93 ± 1.57%였습니다. 이 값은 각각 예측 값인 6.20 및 87.25%와 유사했습니다. 또한 각 변수와 해당 응답 간의 상관관계를 Pearson's correlation으로 분석하였다(Table 4). 추출 수율은 추출 시간과 MeOH 농도 사이에 명확한 선형 관계를 보였고, 화합물 1의 양과는 음의 선형 관계를 보였다. 따라서 V. amurensis 뿌리의 tyrosinase 억제 활성은 화합물 1과 2 모두에 비례하지만 화합물 1보다 화합물 2의 양이 더 강한 선형 관계를 나타냈다.

3. 재료 및 방법

3.1. 일반 실험 절차

중압 액체 크로마토그래피(MPLC)는 Biotage Isolera(Biotage AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 수행하였다. 한 시스템에는 고성능 플래시 크로마토그래피(HPFC) 펌프, 가변 이중 파장 검출기 및 수집기가 장착되어 있습니다. NMR 스펙트럼은 Bruker SPECTROSPIN 300 MHz 분광계(Bruker Corporation, Billerica, MA, USA)를 사용하여 획득했습니다. NMR 용매인 Methanol-d4는 Cambridge Isotope Laboratories, Inc.에서 구입했습니다. 크로마토그래피 등급의 Acetonitrile(ACN), 물 및 메탄올(MeOH)은 ThermoFisher Scientific Korea Ltd.(서울, 대한민국)에서 구입했습니다. L-티로신, 버섯 티로시나제, 코직산 및 포름산은 Sigma-Aldrich Co(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다.

3.2. 식물 재료

V. amurensis 뿌리는 한국 경북에서 구입했으며 Omniherb(대한민국 대구)에서도 구입했습니다. 고려대학교 약학대학 이기용 교수에 의해 확인되었다. 바우처 검체(KUP-HD071)는 고려대학교 약학대학 약리학 연구실에 기탁되었다.

3.3. LC-Q-TOF 질량분석법

LC는 바이너리 펌프, 온라인 탈기 장치, 자동 시료 주입기, 자동 온도 조절식 컬럼 컴파트먼트 및 포토다이오드 어레이 검출기로 구성된 Agilent 1260 시리즈(Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 크로마토그래피 분리는 Shiseido CapCell PAK C18 컬럼(5 µm, 4.6 mm, ID × 150 nm)을 사용하여 수행되었습니다. 이동상은 물(용매 A)과 ACN(용매 B)으로 구성되었으며 둘 다 0.1% 포름산을 함유하고 있습니다. 기울기 조건은 0–5분, 10퍼센트 B, 5–30분, B를 10에서 90퍼센트로 선형적으로 증가시킵니다. 펠로우 속도는 0.6mL/분으로 설정되었습니다. LC-Q-TOF-MS 분석 및 티로시나제 억제 분석과 결합된 LC-Q-TOF-MS를 위해 각각 5 μL 및 20 μL의 샘플을 주입했습니다. 질량 분석법은 네거티브 모드에서 전자 분무 이온화(ESI) 인터페이스가 있는 Agilent 6530 Q-TOF 질량 분석기(Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 수행되었습니다. m/z 50–1000의 질량 범위 데이터는 중심 모드에서 수집되었습니다. 질량 파라미터는 다음과 같다: 모세관 전압, 4000V; 분무기 압력, 40psi; 조각 전압, 175V; 스키머 전압, 65V; 건조 가스 온도, 325ºC; 건조 기체의 펠로우 속도, 12.0L/min; 충돌 에너지 10, 20, 30 및 40 eV. 획득 매개변수 조정 및 데이터 처리는 6530 시리즈 Q-TOF(버전 B.05.00)(MassHunter Workstation 소프트웨어, Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 LC-MS/MS Data Acquisition을 사용하여 수행되었습니다.

3.4. Tyrosinase 억제 분석과 결합된 LC-Q-TOF-MS

LC-Q-TOF-MS와 tyrosinase inhibitory assay를 결합하여 이전 연구[24]에서 확립된 방법을 사용하여 수행하였다. 간단히 말해서, 분석은 두 번의 실행으로 진행되었습니다. 첫 번째 실행에서 샘플의 화학적 프로필은 LC-Q-TOF-MS를 사용하여 얻었습니다. 다음 실행에서는 명시된 LC-Q-TOF 조건에서 LC 시스템을 통과한 후 용출액을 30초마다 96-웰 플레이트에 수집했습니다. 수집된 분획의 티로시나제 억제 활성을 티로시나제 억제 분석법을 사용하여 평가하였다.

3.5. V. amurensis 뿌리로부터 Tyrosinase 억제 화합물의 분리

티로시나제 억제 분석과 결합된 LC-Q-TOF-MS를 사용하여 식별된 티로시나제 억제 화합물의 분리를 위해 V. amurensis 뿌리(3.01 kg)를 80%로 3회 추출했습니다. 초음파 처리를 사용하여 실온에서 60분 동안 MeOH. 추출된 용매를 여과하고 농축하여 조 추출물(215.7g)을 얻었고, 이를 물에 현탁하고 n-헥산, 에틸 아세테이트(EtOAc) 및 n-BuOH를 사용하여 순차적으로 분배하였다. EtOAc 분획(25.85g)을 기울기 조건(20:1 → 0:1)에서 n-헥산:EtOAc를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 7개의 분획(E1–E7)을 생성했습니다. 분획 E4는 MPLC와 100g SNAP KP-Sil, 실리카 겔 카트리지 및 구배 조건(97:3 → 0:100)에서 디클로로메탄:MeOH를 사용하여 분리하여 7개의 하위 분획(E4–1에서 E4–7)을 생성했습니다. . 화합물 2(417.0mg)는 E4-5에서 얻었다. 하위 분획 E4–4는 SNAP 25g Ultra, 실리카 겔 카트리지 및 클로로포름:MeOH:H2O를 사용하여 구배 조건(50:4:1 → 15:4:1)에서 MPLC에서 재크로마토그래피하여 7개의 분획을 생성했습니다( E4–4–1에서 E4–4–7까지). 화합물 1(396.0mg)은 E4–4–5에서 얻었으며, 이는 박층 크로마토그래피(TLC) 플레이트에서 단일 지점으로 관찰되었습니다.

3.6. 티로시나제 억제 분석

티로시나제 억제 활성은 이전에 설명한 방법을 약간 수정하여 평가했습니다[25]. 2마이크로리터의 시료와 50µL의 0.1U/µL 버섯 티로시나아제를 96-웰 플레이트에서 처리하고 37ºC에서 배양했습니다. 15분 후 50 µL의 1mM L-tyrosine을 첨가한 후 37℃에서 15분간 반응시켰다. 형성된 도파크롬의 양은 Spectra Max 19{{20}} 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 495nm에서 측정되었습니다. 티로시나제 억제 활성은 다음 방정식을 사용하여 계산하였다: 티로시나제 억제(퍼센트)=[1 - (S - S0)/(C - C0)] × 100, 여기서 S는 시료, 티로시나제의 흡광도, L은 -티로신; S0는 샘플 및 L-티로신의 흡광도이고; C는 티로시나제 및 L-티로신의 흡광도이고, C0는 L-티로신의 흡광도이다. 티로시나제 억제제로 알려진 Kojic acid를 양성 대조군으로 사용하였다. IC50 값은 GraphPad Prism 6(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하여 계산되었습니다.

3.7. 분자 도킹 연구

Agaricus bisporus(Protein Data Bank(PDB) ID: 2Y9W)의 티로시나제인 PPO3의 결정 구조를 가진 SYBYL-X 2.1.1 소프트웨어(Tripos Ltd., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 분자 도킹을 수행했습니다. 대상 단백질의 모든 물 분자를 제거하고 SYBYL-X 2.1.1의 "sanitize" 준비 프로토콜에 따라 리간드 준비를 수행했습니다. 단백질-리간드 친화도는 Tripos force field에 의해 계산되었고 총 점수로 표현되었습니다. 단백질-리간드 복합체로부터의 리간드의 도킹된 포즈는 Discovery Studio 2017 R2 Client 프로그램(Biovia Co., San Diego, CA, USA)에서 가시화되었다.

3.8. 실험 설계 및 통계 분석

V. amurensis 뿌리에서 티로시나제 억제 활성이 최대인 성분을 추출하기 위한 최적 조건은 3가지 변수와 3가지 수준의 BBD를 사용하여 설정되었습니다(MINITAB Release 14.12.0 Statistical Software). 예비 단일 요소 실험 결과를 기반으로 추출 시간(X1), MeOH 및 물 농도(X2), 액체 부피(X3)를 포함한 독립 변수와 해당 변수의 범위를 선택했습니다(표 S3). RSM에 대한 변수는 −1, 0 및 1의 세 가지 수준을 사용하여 코딩되었습니다. 전반적으로 설계 중심에서 3회 반복을 포함하여 15개의 실험이 설계되었습니다(표 2). 독립 응답으로 수율(%), 티로시나제 억제 활성(%), 화합물(1)의 양(㎍/mg) 및 화합물(2)의 양(㎍/mg)을 측정하였다. 추출물의 Tyrosinase 저해 활성은 50 µg/mL 농도에서 평가하였다. 각 응답은 다음 2차 다항 방정식을 사용하여 표현됩니다.

여기서 R은 응답을 나타냅니다. 1, 2 및 3은 선형 계수입니다. 12, 23 및 13은 세 변수 간의 상호 작용 계수입니다. 11, 22, 33은 2차 계수입니다.
또한 각 변수와 응답 사이에 선형 관계가 있는지 확인하기 위해 Pearson의 상관 분석을 수행했습니다. Pearson의 상관 계수는 {{0}.7과 1.0 사이에 강한 선형 관계가 있고, 0.3과 0.7 사이에 명확한 선형 관계가 있습니다. {{10}}.1과 0.3 사이의 약한 선형 관계 및 0.0과 0.1 사이의 선형 관계가 없거나 무시할 수 있습니다. 양의 상관관계와 음의 상관관계는 Pearson의 상관계수가 양인지 음인지에 따라 표현된다.

3.9. 티로시나제 억제 화합물 1 및 2의 정량 분석

설계된 15개의 실험 조건을 사용하여 얻은 추출물에서 각 화합물 1과 2의 양을 검량선을 사용하여 측정했습니다(표 2). 화합물 1 및 2에 대한 검량선은 UV 크로마토그램 곡선(각각 0.1–1000 µg/mL 및 7.81–1000 µg/mL의 농도에서 획득한 330 nm) 아래 면적을 사용하여 결정되었습니다. LC는 재료 및 방법, LC-Q-TOF 질량 분석법에 자세히 설명된 LC 시스템과 동일한 조건으로 Waters 2695 LC 시스템(Waters, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 수행되었습니다.

4. 결론

V. amurensis 뿌리의 ε-Viniferin(1)과 비타민 B(2)는 티로시나제 억제 분석과 결합된 LC-Q-TOF-MS를 사용하여 피부 미백 성분으로 특성화되었습니다. 특히, 본 연구에서 비타민 B(2)가 티로시나제 억제 화합물로 처음 규명되었으며, ε-vinifera(1)와 비타민 B(2)가 양성 대조군인 코직산보다 높은 티로시나제 억제 효과를 보였다. 추출시간(100분), MeOH농도(66.38%), 액체부피(140mL)를 이용하여 V. amurensis 뿌리의 최대 티로시나제 억제효과 및 수율을 갖는 최적화 조건을 설정하였다. 결과는 실험값과 예측값이 잘 일치하는 것으로 나타났습니다. 결과적으로 LC-Q-TOF-MS와 바이오어세이를 결합하면 새로운 활성 성분뿐만 아니라 새로운 천연 잠재 미백제로 제안될 수 있는 알려진 활성 성분인 비타민 B(2)를 효과적으로 찾을 수 있는 가능성이 입증되었습니다.

보충 자료: 다음은 온라인에서 사용할 수 있습니다. 그림 S1: 음이온화 모드의 MS 크로마토그램(A); V. amurensis 뿌리 추출물의 280nm에서의 UV 크로마토그램(B), 그림 S2: 화합물 1의 1H-및 13C-NMR 스펙트럼(300 및 75MHz, CD3OD), 그림 S3: 화합물의 1H-및 13C-NMR 스펙트럼 2(300 및 75MHz, CD3OD), 그림 S4: S자형 플롯 및 양성 대조군의 IC50, 화합물 1 및 2, 그림 S5: 추출 매개변수의 효과를 보여주는 응답 표면 및 윤곽 플롯(X1: 추출 시간, 분, X2: MeOH 농도, 백분율, X3: 용매 부피, mL). (A) 수율; (B) 티로시나제 억제 활성; (C) 화합물 1; (D) 화합물 2; (E) 화합물 1과 2의 합, 표 S1. V. amurensis 뿌리 추출물의 티로시나제 억제 활성, 표 S2: CD3OD에서 화합물 1 및 2의 1H- 및 13C NMR 데이터(δ, ppm), 표 S3: 반응 표면 방법론에 대한 독립 변수 및 수준, 표 S4: 추정된 회귀 수율에 대한 계수, 표 S5: 수율에 대한 분산 분석, 표 S6: 티로시나제 억제 활성에 대한 추정된 회귀 계수, 표 S7: 티로시나제 억제 활성에 대한 분산 분석, 표 S8: 화합물 1에 대한 추정된 회귀 계수, 표 S9: 화합물 1에 대한 분산, 표 S10: 화합물 2에 대한 추정된 회귀 계수, 표 S11. 화합물 2에 대한 분산 분석, 표 S12: 화합물 1 및 2의 합에 대한 추정된 회귀 계수, 표 S13: 화합물 1 및 2의 합에 대한 분산 분석.
저자 기여: 개념화, KYL; 방법론, K.-EO, HS 및 KYL; 소프트웨어, K.-EO 및 HS; 검증, HS; 형식 분석, K.-EO 및 HS; 조사, K.-EO, HS, MKL 및 KYL; 데이터 큐레이션, K.-EO, HS, BP 및 KYL; 작문 - 원본 초안 준비, K.-EO 및 HS; 쓰기 - 검토 및 편집, HS, MKL, BP 및 KYL; 감독, MKL, BP 및 KYL 모든 저자는 원고의 게시된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.
자금 조달: 본 연구는 한국정부의 한국연구재단 연구비(NRF-2017R1A2B4003403 및 NRF-2019R1A6A1A03031807)와 한국보건산업진흥원의 한국보건기술연구개발사업의 지원으로 수행되었습니다. 연구소(KHIDI), 대한민국 보건복지부 지원(HF20C0038).
데이터 가용성 진술: 이 연구에서 제시된 데이터는 보충 자료에서 사용할 수 있습니다.
이해 상충:저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
샘플 가용성: 사용 불가

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