Lepisorus Thunbergianus의 Caffeoylquinic Acid와 멜라닌 생성 억제 활성의 특성 분석
Mar 29, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
김학현, 김재권, 김재현, 정세희*, 이구연*
요약:티로시나제의 과활성화로 인한 과색소침착은 인간 피부에 더 어두운 반점이나 패치로 이어집니다. 이러한 현상은 무해하지만, 멜라닌 생성의 속도 제한 효소인 티로시나아제를 억제하여 과색소침착을 방지하는 멜라닌 생성 억제제에 대한 수요가 여전히 많습니다. Lepisorus thunbergianus는 민간 요법에서 이뇨제 및 지혈제로 사용되었지만 멜라닌 생성에 미치는 영향은 아직 보고되지 않았습니다. 이 연구에서 우리는 L.thunbergianus 추출물과 그 용매 분획을 준비하고 자유 라디칼 및 멜라닌 합성에 대한 생물학적 활성을 평가했습니다. L. thunbergianus 추출물은 시험관 내에서 알부틴과 유사한 항산화 활성으로 버섯 티로시나제 활성을 더 효율적으로 억제했습니다. L. thunbergianus 용매 분획의 항멜라닌 생성 및 항 티로시나제 활성의 비교 평가는 티로시나제 활성을 억제함으로써 부탄올 분획이 흑색종 세포의 멜라닌 생성 억제에 대한 가장 높은 잠재력을 갖는 것으로 나타났습니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 NMR 분광법을 이용한 구조 분석을 통해 부탄올 분획의 주요 화합물이 3개의 caffeoylquinic acid 유도체임을 발견했습니다. 세 가지 유도체는 시험관 내에서 유사한 라디칼 소거 및 항-티로시나제 활성을 갖는 반면, 5-caffeoylquinic acid만이 -MSH-유도 멜라닌 생성에 억제 효과를 나타냅니다. 5-caffeoylquinic acid의 억제 효과는 상업용 화합물로 세포를 처리한 후 흑색종에서 멜라닌 함량과 티로시나아제 활성을 측정하여 확인했습니다. 또한, 우리는 5-caffeoylquinic acid가 구리-티로시나제 복합체로부터 구리 양이온을 킬레이트화함으로써 멜라닌 생성을 억제한다는 것을 밝혀냈습니다. 따라서 L. thunbergianus에서 분리한 5-카페오일퀸산 또는 부탄올 분획물은 피부 미백제로 화장품에 유용할 수 있습니다.
소개
대부분의 유기체에서 발견되는 천연 색소 그룹인 멜라닌은 과일, 균류 및 야채의 갈변 및 인간 피부의 색소 침착에 중요한 역할을 합니다.1 멜라닌은 효소 산화 및 중합을 포함하는 다단계 과정을 통해 아미노산 티로신으로부터 생성됩니다. 2 인간에서 멜라닌 색소는 자외선(UV)에 노출되면 합성이 시작되는 표피와 진피 사이의 접합부에 위치한 특수 수지상 세포 멜라노사이트에 의해 합성됩니다. 따라서 피부색은 멜라닌 색소의 분포 패턴에 의해 결정됩니다.2 인멜라닌 합성 조절 장애는 기미, 주근깨, 검버섯, 일광 흑점, 염증 후 색소 침착 및 기타 색소 침착 증후군과 같은 여러 형태의 과다 색소 침착을 유발합니다.4 a 이상 수백 개의 단백질이 토멜라닌 합성과 관련되어 있으며 그 중 티로시나아제는 포르멜라닌 합성을 담당하는 것으로 인식되는 속도 제한 효소입니다.5 따라서 과색소침착을 예방하기 위한 대부분의 연구는 새로운 강력한 멜라닌 생성 방지를 위한 티로시나제 억제제.1,6 코직산, 알부틴, 하이드로퀴논, 아젤라산, 엘라그산 및 트라넥삼산과 같은 많은 티로시나제 억제제가 화장품 산업에서 멜라닌 생성 방지제로 널리 사용되었습니다. 그러나 세포독성, 부작용 등 화학약품의 한계로 안전성, 안정성, 유효성이 향상된 신소재가 여전히 요구되고 있다.7
식물, 박테리아, 진균류를 포함한 천연물은 독성이 적고 생체적합성 및 생체이용률이 우수하여 효과적인 피부 미백 성분을 발견할 수 있는 대체 공급원이 되었습니다.1,8 또는 나무껍질로 우리나라, 일본, 중국, 필리핀, 인도차이나 등 동아시아의 온대지방에 분포한다. L. thunbergianus는 이뇨제, 지혈제로 사용되어 왔으며 한국 민간 요법에서 진해 효과가 있습니다. 이전 연구에 따르면 L. thunbergianus 추출물은 국소적 항지질 과산화 활성 및 항산화 활성이 있다고 보고했습니다. 또한 L. thunbergianus 추출물은 구강암 및 결장암 세포에서 농도 의존적으로 상당한 성장 억제를 나타냈습니다. 이 식물은 quercetin 3-methyl ether-glucoside, vitexin, oriental, periodical-glucoside, isovitexin, orientin, Corentin, caffeoylquinicacid를 비롯한 다양한 플라보노이드 화합물과 수많은 생리활성 분자를 함유하고 있기 때문에 화장품 산업에서 L. thunbergianus 추출물의 멜라닌 세포에서의 온멜라닌 합성은 아직 밝혀지지 않았습니다.
그림 1. (A) ABTS 라디칼 소거, (B) 항-티로시나제 및 (C) 세포내 ROS 소거 활성에 대한 L. thunbergianus 추출물 분석
본 연구에서는 L. thunbergianus 추출물과 그 용매 분획을 직렬 분획을 통해 제조하고 B16F10 흑색종 세포에서 용매 분획이 멜라닌 생합성에 미치는 억제 효과를 조사하였다. 부탄올(n-BuOH) 분획이 천연 억제제를 함유하는 주요 부분임을 확인하고 L. thunbergianus 추출물에서 분리한 caffeoylquinic acid 유도체가 멜라닌 생합성 억제에 미치는 영향을 추가로 특성화했습니다.
결과 및 논의
L. thunbergianus의 에탄올 추출물은 2,2'-Azinobis(3-에틸-벤조티아졸린{5}}술폰산(ABTS) 라디칼을 제거하고 Tyrosinase 활성을 억제합니다.
L의 추출. 70% 에탄올(EtOH)을 함유한 thunbergianus를 수행하여 식물 내 천연 화합물의 잠재적 억제 활성을 평가했습니다. L.thunbergianus 추출물의 라디칼 소거 활성은 2-200 ug/mL의 농도 범위에서 결정되었습니다. 에탄올 추출물은 50 ug/mL에서 최대 효과로 농도 의존적 라디칼 소거 활성을 나타내었으며, 그 결과는 양성 대조군으로 사용된 알부틴의 결과와 일치했습니다(그림 1A).
또한 tyrosinase에 의해 촉매되는 도파크롬 합성 속도를 측정하여 추출물의 버섯 tyrosinase 활성 억제 효과를 평가하였다. 에탄올 추출물은 500ug/mL에서 티로시나제 활성의 87%를 억제한 반면, 알부틴은 동일한 농도에서 티로시나제 활성의 38%만 억제했습니다(그림 1B). 그런 다음 100 μM 과산화수소로 증가된 세포 내 ROS에 대한 추출물의 소거 활성을 평가했습니다. 과산화수소 처리는 B16F10 세포의 세포내 ROS 수준을 약 2.{7}}배 증가시킵니다(그림 1C). 우리는 세포 내 ROS의 과산화수소 매개 증가가 용량 의존적 방식으로 추출물에 의해 소거되었음을 발견했습니다. 100ug/mL에서 최대 소거 활성은 78%였습니다(그림 1C). 이러한 결과는 L. thunbergianus의 에탄올 추출물이 tyrosinase 활성을 억제하고 ABTS 라디칼과 세포내 ROS를 소거하는 생리활성 성분을 함유하고 있음을 시사한다.
cistanche Deserticola 추출물: 티로시나제 활성을 억제합니다.
L. thunbergianus Fractionsagainst Melanogenesis의 억제 가능성.
A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, 이는 이전 보고서와 일치합니다.10b또한 농도 의존적으로 다양한 용매 분획의 ontyrosinase 활성 억제 효과가 증가했습니다. n-Hex 및 CH2Cl2 분획의 최대 억제 활성은 65% 미만이었지만 EtOAc 및 n-BuOH분획은 70% 이상이었습니다(그림 2B). 억제 활성은 n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex 순이었다. 이러한 결과는 n-BuOH 및 EtOAc 분획을 포함하는 친수성 분획이 많을수록 친유성 n-Hex 및 CH2Cl2 분획보다 라디칼 소거 활성 및 억제 활성이 더 우수함을 시사한다. .
다음으로, B16F1{19}} 세포를 2{22}}0 ug/mL의 서로 다른 분획 또는 2mg/mL의 알부틴으로 처리하여 흑색종 세포 증식에 대한 L. thunbergianus 용매 분획의 효과를 조사했습니다. 소안구증 관련 전사 인자(MITF) 유도를 통해 멜라닌 생성을 촉진하는 것으로 잘 알려진 멜라닌 세포 자극 호르몬( -MSH)의 존재. 결과는 분획 중 어느 것도 흑색종 세포 증식에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다(그림 2C). 그런 다음 흑색종 세포에서 -MSH에 의해 자극된 멜라닌 생성에 대한 용매 분획의 억제 효과를 조사했습니다. -MSH 처리는 B16F1{36}} 세포의 세포내 멜라닌 함량을 약 2.{13}}배 증가시켰습니다(그림 2D). 우리는 -MSH 매개 멜라닌 생성이 n-BuOH 분획(p < 0.01)에="" 의해="" 완전히="" 억제되고="" etoac="" 분획(40%,="" p="">< 0.01)에="" 의해="" 부분적으로="" 억제되는="" 반면="" -msh="" 매개="" 멜라닌="" 생성은="" n-hex에="" 의해="" 유의하게="" 변화되지="" 않음을="" 발견했습니다.="" 및="" ch2cl2분획(그림="" 2d).="" 또한,="" -msh에="" 의해="" 매개되는="" 티로시나아제="" 활성화에="" 대한="" 용매="" 분획의="" 억제="" 효과는="" 티로시나아제가="" 멜라닌="" 생성에서="" 핵심적인="" 역할을="" 하기="" 때문에="" 결정되었습니다.="" -msh에="" 의한="" 반면="" n-hex="" 및="" ch2cl2="" 분획은="" 그림="" 2e와="" 같이="" 그렇지="" 않습니다.="" 또한,="" 세포="" 내="" ros="" 증가에="" 대한="" 다양한="" 용매="" 분획의="" 소거="" 효과는="" 과산화수소에="" 의해="" 자극되었습니다.="" 모든="" 용매="" 분획은="" 그림="" 2f와="" 같이="" 과산화수소에="" 의해="" 매개된="" 세포="" 내="" ros="" 증가를="" 역전시켰습니다.="" 이러한="" 결과는="" l.="" thunbergianus의="" buoh="" 분획물이="" b16f10="" 세포에서="" 세포내="" 티로시나아제="" 활성을="" 억제하여="" -msh="" 유도="" 멜라닌="" 합성을="" 억제함을="" 나타낸다.="" 또한,="" 이러한="" 결과는="" 멜라닌="" 합성을="" 억제하는="" 생리활성="" 성분이="" 친수성이며="" 주로="" n-buoh="" 분획에서="" 발견됨을="">
그림 2. ABTS 라디칼 소거, 항 티로시나제 및 항 멜라닌 생성 활성에 대한 용매 분획의 효과.
L. thunbergianus 추출물의 생리 활성 화합물의 식별 및 특성화.
멜라닌 생성을 억제하는 성분을 확인하고 특성화하기 위해 모든 용매 분획에 대한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 수행했습니다. 용매 분획의 HPLC 분석은 모든 분획이 화합물 1, 2 및 3에 대해 각각 21, 28 및 29분의 체류 시간에 3개의 주요 화합물을 포함하는 것으로 나타났습니다(그림 3A-D). 이 3가지 주요 화합물은 분취용 HPLC 정제에 의해 추가로 분리되었습니다. 이전 보고서에 따르면 n-BuOH 분획의 세 가지 주요 화합물의 양은 상업용 caffeoylquinic acid 유도체를 내부 표준 분자로 사용하여 결정되었습니다.12
그런 다음 분리된 화합물을 문헌과 1H 및 13C NMR 데이터를 비교하여 확인했으며 제안된 구조와 일치하는 것으로 나타났습니다(그림 4).13 그림 3E는 세 가지 화합물의 분자 구조를 보여줍니다. 화합물 1(수율, 3.2 ± 0.1 mg/100 mg n BuOH 분획)을 옅은 노란색 분말로 얻었다. 1HNMR(400MHz, DMSO-d6) δ 9.66(1H, brs), 9.20(1H, brs), 7.49(1H, d, J{24}}.9Hz), 7.04(1H, s), 6.99( 1H, d, J{32}}.2Hz), 6.78(1H, d, J{37}}.1Hz), 6.23(1H, d, J= 15.9Hz), 5.20( 1H, m), 5.08(1H, brs), 4.89(1H, brs) 4.13(1H, m), 3.84(1H, m), 3.56(1H, s), 3.35(1H, s), 1.99(1H, m), 1.92(1H,m), 1.89(1H, m), 1.79(1H, m). 13C{1H} NMR(100MHz,DMSO-d6) δ(176.42, 168.10, 148.14, 145.53, 144.75, 125.65,9,121.07, 115.75, .21.07, 115.75, .114.72, 화합물 1은 NMR 분석 및 이전 문헌과의 비교에 의해 3-카페오일퀴니산으로 확인되었습니다.13b
화합물 2(수율, 14.1 ± 0.1 mg/100 mg n-BuOHfraction)를 옅은 노란색 분말로 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 9.64(1H, brs), 9.20(1H, brs), 7.52(1H,d, J{20}}.9Hz), 7.06(1H, s), 7.02( 1H, d, J=8.1Hz) 6.79(1H, d, J=7.9Hz), 6.30(1H, d, J= 15.9Hz), 4.85( 1H, brs),4.70(1H, d, J{46}}.9Hz), 4.12(1H, brs), 3.95(1H, m), 1.97(2H, m), 1.88(1H, m), 1.83(1H, m). 13C{1H} NMR(100MHz, DMSO-d6) δ(176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77,125.54, 4,6,121.19, 115.76, .3, 114.68, 화합물 2는 NMR 분석 및 이전 문헌과의 비교에 의해 {{101}caffeoylquinic acid로 확인되었습니다.13c
화합물 3(수율, 3.9 ± 0.2 mg/100 mg n-BuOHfraction)을 옅은 노란색 분말로 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 9.64(1H, brs), 9.20(1H, brs), 7.52(1H,d, J{20}}.9Hz), 7.06(1H, s), 7.02( 1H, d, J=8.1Hz) 6.79(1H, d, J=7.9Hz), 6.30(1H, d, J= 15.9Hz), 4.85( 1H, brs),4.70(1H, d, J{46}}.9Hz), 4.12(1H, brs), 3.95(1H, m), 1.97(2H, m), 1.88(1H, m), 1.83(1H, m). 13C{1H} NMR(100MHz, DMSO-d6) δ(176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77,125.54, 4,6,121.19, 115.76, .3, 114.68, 화합물 3은 NMR 분석 및 이전 문헌과의 비교에 의해 {{101}카페오일퀸산으로 확인되었습니다.13a
그림 3. L. thunbergianus의 (A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc 및 (D) n-BuOH 분획의 HPLC 크로마토그램 및 (E) 세 가지 주요 화합물의 구조.
L. thunbergianus에서 분리한 Caffeoylquinic Acid 유도체의 멜라닌 생성 억제 가능성
다음으로 강력한 항멜라닌 생성을 억제하는 생물학적 활성 성분을 확인하기 위해 L. thunbergianus에서 분리한 세 가지 caffeoylquinic acid 유도체의 멜라닌 합성 흑색종 세포에 대한 억제 활성을 확인했습니다. 먼저, ABTS 라디칼 소거에 대한 3가지 유도체의 효과를 조사하였다. 결과는 세 가지 유도체가 유사한 ABTS 라디칼 소거 활성을 갖는 것으로 나타났습니다(그림 5A). 그런 다음 L. thunbergianus ontyrosinase 활성에서 분리한 세 가지 유도체의 억제 효과를 조사했습니다. 3개의 유도체는 200μM 농도에서 최대 억제와 함께 티로시나제 활성의 농도 의존적 억제를 나타냈다(그림 5B). 또한 B16F10 세포에서 -MSH 유도 멜라닌 합성에 대한 3유도체의 억제 효과를 조사했습니다. -MSH로 처리하면 B16F10세포의 세포내 멜라닌 함량이 약 2.{11}}배 증가했습니다(그림 5C). 흥미롭게도, 화합물 1({16}}caffeoylquinicacid)과 3({18}}caffeoylquinic acid)은 멜라닌 합성을 각각 25%와 23% 증가시켰습니다(그림 5C, p< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">
그림 4. (A) 3-caffeoylquinic acid, (B) 4-caffeoylquinic acid, (C) 5-caffeoylquinic acid의 1H NMR 스펙트럼 및 (D) {{ 6}}카페오일퀸산, (E) 4-카페오일퀸산, 및 (F) 5-카페오일퀸산
5-Caffeoylquinic Acid의 멜라닌 생성 억제 효능 검증.
멜라닌 생성에 대한 {{0}}caffeoylquinic acid의 억제 효과를 확인하기 위해 -MSH에 의해 매개되는 상업용 5-caffeoylquinic acid onmelanin 합성의 억제 효과를 확인했습니다. 더 낮은 농도의 0.1 및 0.2mM 5-caffeoylquinicacid 처리는 멜라닌 합성 및 세포내 티로시나제 활성을 약간 증가시켰지만, 0.5 및 1mm 농도의 화합물의 더 높은 농도는 -MSH 매개 멜라닌 생성을 역전시켰습니다. 및 세포 내 티로시나제 활성(그림 6A, B), 결과는 이전 보고서와 일치합니다.14
Caffeoylquinic acid는 Caffeic acid와 L-quinic acid 사이의 에스테르 결합에 의해 형성된 페놀 화합물입니다. Caffeoylquinic acid 유도체는 ROS 소거 활성 뿐만 아니라 멜라닌 생성 억제 및 티로시나아제 활성을 억제하는 것으로 알려져 있습니다. Tyrosinase는 2가 구리 양이온을 가진 다기능 구리 함유 금속효소입니다. Caffeoylquinic acid 유도체는 tyrosinase의 활성 상태를 유지하는 구리 양이온을 킬레이트화하여 tyrosinase 활성을 억제할 수 있습니다. 5-caffeoylquinic acid와 tyrosinase 간의 상호작용을 예측하기 위해 Maestroprogram을 사용하여 컴퓨터 분자 도킹 연구를 수행했습니다. 도킹된 토티로시나아제라는 화합물에 대한 최상의 자세는 그림 6C, D에 나와 있습니다. 분자 도킹 연구에 따르면 5-caffeoylquinic acid는 2.43Å 거리에서 구리 이온과 상호 작용하고 His와 일련의 π-πstacking을 설정합니다. 259, Asn 260, His 85 및 His 263 잔기 및 Arg 268과의 H-결합. 또한, 티로시나제와 5-카페오일퀸산 사이의 결합 에너지는 -4.425 kJ/mol이었다. 이러한 결과는 5-caffeoylquinic acid가 구리 킬레이트화에 의해 티로시나제 활성을 억제할 수 있음을 나타냅니다. caffeoylquinicacid에 의한 멜라닌 생성 억제 메커니즘을 확인하기 위해 {{21}caffeoylquinic acid의 구리 킬레이트화 능력을 확인했습니다. 5-caffeoylquinic acid의 구리 킬레이트 능력은 농도 의존적으로 증가했습니다(그림 6E). 이 결과는 5-caffeoylquinicacid가 tyrosinase와 상호작용하는 구리 양이온을 킬레이트화하여 멜라닌 합성을 억제함을 시사합니다.
그림 5. B16F10 세포에서 3가지 caffeoylquinic acid 유도체가 라디칼 소거, 시험관 내 항티로시나제 및 항멜라닌 생성 활성에 미치는 영향.
재료 및 방법
재료
L. thunbergianus는 온라인마켓 www.jirisangol.com(Korea)에서 구입하여 주위 조건에서 건조시킨 후 본 연구에 사용하였다. 2,2'-아연 비스(3-에틸-벤조티아졸린-6-설폰산(ABTS) 및 3-(4,5-디메틸티아졸-2-)과 같은 시약 yl){10}},{11}}디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT), -멜라닌 세포 자극 호르몬(-MSH), 버섯 티로시나아제와 같은 효소는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, 미국). 과황산칼륨(K2S2O8), 피로카테콜 바이올렛 및 3,{20}}디하이드록시-L 페닐알라닌(L-DOPA)은 Alfa Aesar(Haverhill, MA, USA)에서 구입했습니다.
L. thunbergianus의 추출 및 분획.
건조된 L. thunbergianus(8{23}} g)를 분쇄기(HBL{1}}S, Samyang Electronics, Korea)를 사용하여 분쇄하고 7{30}}% EtOH로 3회 추출(800 mL, 각 회 ) 70도에서 3일. 생성된 추출물을 Advantecfilter paper no. 1 및 2(Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan) 및 Hei-Vap Advantage 회전 증발기(Heidolph, Germany)를 사용하여 농축하여 EtOHcrude 추출물 17.2g을 얻었다. 이 조 추출물을 dH2O(180mL)에 현탁하고 Hex, CH2Cl2, EtOAc 및 n-BuOH로 연속적으로 분획화하여 Hex(1.51g, 8.8%), CH2Cl2(0.88g, 5.1%), EtOAc(3.95g, 23.0)를 생성했습니다. 퍼센트 ) 및 n-BuOH (3.02 g, 17.6 퍼센트 ), 앞서 설명된 대로. 생성된 추출물 및 분획물을 동결 건조하고 사용 전에 -80도에서 보관했습니다.
ABTS 자유 라디칼 ScavengingActivity의 결정.
L.thunbergianus 추출물과 용매 분획의 항산화 활성을 평가하기 위해 ABTSradical 소거 활성을 이전에 설명한 대로 결정했습니다.16 ABTS 라디칼을 생성하기 위해 10mL의 7mMABTS를 176μL의 140mM과 혼합했습니다. dH2O에 포타슘퍼옥시 디설페이트를 첨가하고 사용하기 전에 16시간 동안 실온(RT)에서 암실에서 인큐베이션했습니다. ABTS 라디칼 용액을 무수 메탄올로 희석하여 734 nm에서 거의 0.7의 흡광도를 얻었다. 100 μL의 각 추출물 또는 2-200 ug/mL의 표시된 농도 범위의 분획을 희석된 ABTS 라디칼 용액 100 μL에 첨가하고 RT의 암실에서 10분 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 SpectraMaxM5 다중 모드 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 732 nm에서 흡광도를 측정했습니다. ABTS 라디칼 소거 활성은 다음과 같이 계산되었습니다.
ABTS 라디칼 소거 활동(%) =1−(샘플/A컨트롤)×100 (1)
시험관내 티로시나제 억제.
티로시나아제 활성에 대한 L.thunbergianus 추출물 및 그 용매 분획의 억제 효과는 티로시나아제의 촉매 반응으로부터 합성되는 도파크롬의 양으로 평가되었습니다. 50mM 인산염 완충 식염수(PBS; 8.1mM Na2HPO4, 1.2mM KH2PO4, pH 6.8, 2.7mMKCl 및 138mM NaCl) 중 U/mL 버섯 티로시나제를 96-웰 플레이트에 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 1mM L-DOPA 100μL를 각 웰에 첨가한 후 37도에서 10분간 더 배양하였다. 생성된 용액의 흡광도는 SpectraMax M5 다중 모드 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 475 nm에서 측정되었습니다.
세포 배양.
B16F10 뮤린 흑색종 세포는 37℃에서 10% 열-불활성화 소태아 혈청(Gibco), 100unit/mL 페니실린 및 100ug/mL 스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)(Gibco, Gaithersburg, USA)에서 배양되었습니다. 가습된 5% CO2에서.
세포 생존력.
B16F10 세포의 생존력은 이전에 설명한 대로 MTT 분석을 사용하여 결정되었습니다.18 간단히 말해서, B16F10 세포를 웰당 1 × 104세포의 밀도로 {{5}웰 플레이트에 접종했습니다. 24시간 후, 세포를 표시된 농도의 L. thunbergianus 추출물 또는 분획으로 48시간 동안 처리했습니다. 그런 다음 세포를 MTT 용액과 함께 4시간 동안 인큐베이션하고 환원된 포르마잔 결정을 DMSO에 용해시켰다. 생성된 용액을 {{11}웰 플레이트로 옮기고 SpectraMax M5다중 모드 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정했습니다.
세포내 반응성 산소종(ROS)의 결정.
세포 내 ROS 수준은 제조업체의 지침에 따라 DCF/H2DCFDA 세포 ROS 분석 키트(ab113851, Abcam)를 사용하여 측정되었습니다. 간단히 말해서, B16F10 세포를 48-웰 플레이트에 웰당 2 ×104 세포의 밀도로 시딩했습니다. 24시간 배양 후, 세포를 페놀 레드가 없는 0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 함유 배양 배지에서 표시된 농도의 L. thunbergianus 추출기 용매 분획으로 1시간 동안 처리했습니다. 그런 다음 세포를 100μM 과산화수소와 함께 30분 동안 인큐베이션했습니다. PBS로 세척한 후, 세포를 PBS 중 25μMH2DCFDA로 45분 동안 처리했습니다. ROS 수준은 485/545 nm(여기/방출 파장)에서 형광 필터가 장착된 마이크로플레이트 판독기(Synergy H1, Biotek, Vermont, USA)로 분석되었습니다. 대조군의 평균 상대 형광 강도는 100%와 동일했으며 처리 조건은 비례적으로 계산되었습니다.
멜라닌 함량 측정.
멜라닌 함량은 이전에 설명된 대로 일부 수정을 통해 결정되었습니다.19 흑색종 세포를 6웰 플레이트에서 24시간 동안 배양했습니다. 그들은 100 nM -MSH의 존재 하에 추가 48시간 동안 L. 툰베리아누스 추출물 또는 그 용매 분획의 표시된 농도로 처리되었습니다. 염화칼슘 및 염화마그네슘(D-PBS, Gibco)에서 생성된 세포를 트립신-EDTA 용액과 함께 인큐베이션하여 분리하였다. 1000rpm에서 3분간 원심분리한 후, 세포 펠렛을 60도에서 1시간 동안 10% DMSO를 포함하는 1M NaOH 150μL에 용해시켰다. 멜라닌 함량은 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 405 nm에서의 흡광도에 의해 결정되었습니다.
Cistanche 추출물은 멜라닌을 억제합니다.
흑색종 세포에서 세포의 Tyrosinase 활성 측정
B16F10 세포에서 티로시나아제 활성은 세포 내 티로시나아제의 촉매 반응에서 생성된 도파크롬의 양을 기준으로 조사되었습니다.20 간단히 말해서, 흑색종 세포를 6웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 후 L.thunbergianus 추출물 또는 그 용매의 농도를 다르게 처리했습니다. 100 nM -MSH의 존재 하에 추가 48에 대한 분획. 빙냉 D-PBS로 2회 세척한 후, 세포를 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 200 μL의 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 완충액(Sigma-Aldrich)에서 용해시켰다. 각 웰에서 채취한 세포 용해물을 15g에서 15분 동안 원심분리한 후, 상등액 100μL를 PBS(pH 6.8)에 녹인 1mM L-DOPA 100μL와 혼합한 다음 37도에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. . 마이크로플레이트리더를 사용하여 475 nm에서 도파크롬의 흡광도를 측정하였다. 데이터는 비신코닌산 분석에 의해 결정된 단백질 농도로 정규화되었습니다.
HPLC를 사용한 생리활성 화합물의 분리 및 특성화.
HPLC는 TC-C18column(4.6 mm, 250 mm, 5 μm, Agilent, USA)이 장착된 YL{0}}(Young Lin Instrument, Korea)에서 수행되었습니다. 용매 A(0.2% 포름산)와 용매 B(MeOH)로 구성된 구배 시스템. 기울기 용매비는 0-5분, 15% B로 설정되었습니다. 5−10분, 15−20퍼센트 B; 10-15분, 20-30퍼센트 B; 15-30분, 30-40퍼센트 B; 30-37분, 40-60퍼센트 B; 37-40분, 60-100% B; 40-45분, 100% B; 45-50분, 100-15퍼센트 B; 및 50-55분, 15% B. 용매 분획의 성분을 식별하기 위해 이동상을 1 mL/min의 유속으로 전달하고 330 nm에서 용리 검출을 수행했습니다. 생리활성 성분의 불용분획물을 모으기 위해 15.0 mL/min의 유속으로 이동상을 전달하고 prep-HPLC(YL{48}} s, Young Lin Instrument, Korea ), 용매 A(0.2% 포름산) 및 용매 B(MeOH)로 구성된 구배 시스템과 함께 prep-C18 컬럼(4.6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, USA)이 장착되어 있습니다. 기울기 용매 비율은 0-10분, 10% B, 10-20분, 10-15% B로 설정되었습니다. 20-40분, 15% B; 40-60분, 15-20퍼센트 B; 및 60-70분, 30% B.
분자 모델링.
분자 모델링을 위한 버섯티로시나아제의 결정 구조는 Protein DataBank(PDB)에서 얻은 Agaricustyrosinase(PDB do: 2Y9X)였습니다. 효소는 Maestroprogram(Maestro, 버전 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, USA, 2019)에 포함된 proteinwizard 준비 워크플로를 사용하여 준비했습니다. PDB 파일에 존재하는 물과 다른 모든 분자는 제거되었습니다. 분자 도킹은 이전에 보고된 바와 같이 IFD(Induced Fit Docking) 프로토콜(Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking 프로토콜)을 사용하여 수행되었습니다.21
구리 킬레이트화 능력.
L. thunbergianus에서 분리한 화합물의 구리 킬레이트화 능력은 이전 보고서에 따라 결정되었습니다.22 표시된 농도의 각 caffeoylquinic acid 유도체(1{5}}μL)를 280μL의 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH 6.0)과 혼합하고, 6μL의 4mM 피로카테콜 바이올렛 용액은 동일한 버퍼에서 준비하고 10μL의 1ug/μL CuSO4·5H2O. SpectraMax M5 다중 모드 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 632nm에서 흡광도를 측정하여 청색의 소멸을 관찰했습니다. 샘플 대신 물을 대조군으로 사용했습니다. 퍼센트 구리 킬레이트화 활성은 다음과 같은 632 nm에서의 흡광도로부터 계산되었습니다.
구리 킬레이트 능력(%)=1- (샘플/컨트롤)×100 (2)
통계 분석.
이 연구의 모든 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현되었습니다. GraphPad Prism 8.{1}}(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 대조군과 노출된 그룹의 평균값 사이의 차이는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Dunnett의 사후 검정을 사용하여 분석되었습니다. 모든 분석에 대한 통계적 유의성에 대한 임계값은 p <>
결론
이 연구에서 우리는 L. thunbergianus 추출물이 ABTS 라디칼을 제거하고 상당한 세포 독성 없이 멜라닌 생합성에 대한 강력한 억제 효과를 나타냄을 입증했습니다. L. thunbergianus에 존재하고 멜라닌 생성을 억제하는 활성 성분이 n-BuOH 분획에서 분리되었습니다. 또한 n-BuOH 분획에 존재하는 3가지 caffeoylquinic acid 유도체가 주요 화합물이며 5-caffeoylquinic acid가 세포의 티로시나아제 활성을 억제하여 흑색종 세포에서 흑색종 생성을 억제합니다. 여기에서 우리는 과색소침착을 방지하기 위해 L.thunbergianus 추출물에서 천연 화합물 억제제 5-caffeoylquinic acid를 분리하고 멜라닌 생성의 기초가 되는 억제 메커니즘을 밝혔습니다. 따라서 우리의 발견은 5-카페오일퀸산과 L. thunbergianus에서 분리된 n-BuOH 분획이 화장품에서 피부 미백제로 유용할 수 있음을 시사합니다.
시스탄치 슬라이스