신경독 1-메틸{1}}페닐피리디늄(MPP)에 의해 유도된 아폽토시스 도파민성 뉴런에 대한 Cistanche의 효과
Mar 10, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
Tian Jiyu, Chen Jianzong
(시안 710032 FMMU 시징 병원 한약 및 한약 연구 센터)
추상적인
목적: 의 효과를 조사하기 위해1-메틸{1}}페닐피리디늄(MPP 플러스)에 의해 유도된 1차 배양 도파민성 뉴런 세포자멸 세포에 대한 Cistanche. 방법: 로 구성된 토끼 혈청을 준비합니다.시스탄체혈청 약리학 방법을 사용합니다. 그런 다음 DA 뉴런의 세포 사멸 세포에 대한 Cistanche의 효과를 분석합니다.MPP 플러스형태학, 유세포 분석, TUNEL 염색을 사용한 유도 모델.결과: 200μmol/L 처리MPP 플러스24시간 이상 동안 DA 뉴런에서 세포자멸사를 유도했습니다. 후에MPP 플러스처리된 Cistanche 혈청의 등가 투여량을 함유하는 그룹의 세포자멸사 비율은 6.3%이고,MPP 플러스단독 치료는 30.2%입니다. B와 C 그룹의 세포 사멸 세포의 수는 E 그룹보다 유의하게 적습니다(P<0.05).>결론: 함유된 세럼시스탄체에 의해 유도된 보호된 apoptosis DA 뉴런MPP 플러스.
키워드: 시스탄체;1-메틸{1}}페닐피리디늄(MPP 플러스); 도파민성 뉴런; 세포자멸사
현재 주요 치료법으로는파킨슨 병질병의 발병을 통제할 수 없는 복합 레보도파(L-dopa) 제제의 대체 요법입니다. 질병이 진행됨에 따라 용량을 증량하게 되는데 일반적으로 3~5년 이내에 치료효과가 감소하고 운동증상이 변동하며 약물에 의한 운동이상증이 나타난다. 최근 연구에 따르면 L-dopa는 in vitro에서 배양된 뉴런에서 세포자멸사를 유도하는 효과가 있음이 밝혀졌으며[1, 2], 내인성 도파민의 신경독성 효과는 도파민성 뉴런의 손실을 초래한다고 제안되었습니다.파킨슨 병. 이유 중 하나 [3]. 장기간 임상에서 우리는 한약을간과 신장에 영양을 공급PD를 치료하기 위해 레보도파 제제와 결합하여 좋은 결과를 얻었습니다[4-6]. 이 실험은 분자 및 세포 수준에서 도파민성 신경 세포 사멸과 그 메커니즘에 대한 한약의 보호 효과를 조사했습니다.
1. 재료 및 방법
1.1 재료
DMEM 배지,1-메틸{1}}페닐피리디니음, MPP 플러스, Gibco 사에서 구입한 태아 소 혈청.시타라빈, 폴리-l-리신, PLLSigma Company에서 구입했습니다. 24-웰 배양 접시, 25cm2
플라스틱 배양 플라스크NUNC Company에서 구입했습니다.한의학우리는 Xi'an Decoction Piece Factory에서 구입했습니다. 우리가 사용한 동물은 학교 동물 센터에서 제공합니다.https://www.xjcistanche.com/products
1.2 약용 혈청의 제조 및 실험적 분류
Cistanche는 보존을 위해 동결 건조 분말로 제조하고 사용할 때 증류수로 희석합니다. 동물 혈청은 뉴질랜드의 큰 귀 흰 토끼에서 제조되었습니다혈청, 모두 건강한 수컷이었고 체중은 2.5-3.0 kg이었습니다. 동물의 등가 용량을 체표면적에 따라 변환하고 무작위 대조군 혈청으로 나누었다. 1/2 등가 용량 그룹 혈청(Cistanche 원료 약재의 위관 투여량0.8g/kg); 등가선량군혈청(위관 투여량은 Cistanche cistanche 오리지널 약재 1.6g/kg); 등가선량의 2배혈청(위관 용량은 Cistanche 오리지널 약재 3.2g/kg). 총 3일 동안 하루에 두 번 위관영양, 마지막 위관영양 후 1시간, 경동맥 출혈, 4도에서 밤새, 25분 동안 25{9}}0 r/min에서 원심분리, 조심스럽게 혈청 분리, 56에서 비활성화 30분 동안 온도를 유지하고 0.22μm 필터 멤브레인을 통해 흡입합니다. 박테리아를 걸러내고 -20도에서 보관합니다. 동일한 조건에서 동일한 부피의 생리 식염수로 위관 영양법으로 빈 토끼 대조군 혈청을 제조했습니다. 실험을 5개 그룹으로 나누었다. A조는 백지토끼혈청배양 대조군; 그룹 B는혈청 배양 + MPP등가 용량의 2배를 함유하는 처리군; 그룹 C는혈청 배양 + MPP등가 용량을 포함하는 치료군; 그룹 D는 1/2 당량의 혈청 배양 + MPP 처리 그룹을 포함하는 혈청 배양 대조군이었습니다. E 그룹은 빈 토끼 혈청 배양 + MPP 처리 그룹입니다.
씨스탄체 혜택
1.3 중뇌 도파민성 뉴런의 배양
임신 14일의 SD 쥐 3마리를 선택하고 심장에 공기 색전증을 직접 주사하여 죽였습니다. 배아 래트를 무균 조건에서 꺼내어 얼음 D-행크 용액이 채워진 페트리 접시에 놓았다. 태아 쥐의 뇌 조직을 해부하고 입체현미경으로 분리하였다. 참조 방법[7]이 약간 개선되었습니다. 뇌척수막과 혈관조직을 벗겨내고 복부중뇌의 A8, A9, A1{7}} 부위의 조직을 분리하였다. 0.125% 판크레아틴 1mL를 가하고 37도 인큐베이터에 약 20분간 두고 10% 소태아혈청이 포함된 적당량의 배지를 첨가하여 소화를 종결시킨 후 흡인한다.
튜브를 균일한 세포 현탁액에 넣고 실온에서 5분 동안 15{8}0r/min으로 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거하고 얇은 목이 있는 피펫으로 15회 피펫을 사용하여 5분 동안 방치합니다. 라이신의 24-웰 배양 플레이트에서 각 웰에 배양액을 첨가하여 세포 밀도를 2×105 cells/mL로 조정하고, 배양액을 웰당 0.5mL가 되도록 첨가하고, 배양 3일 후에 시타라빈을 첨가합니다( 최종 농도는 10μmol/L), 비뉴런의 성장을 억제합니다.
1.4 티로신 수산화효소(TH) 면역세포화학적 염색
SABC 방법을 사용하여 항체 희석제는 소 혈청 알부민 1g/1{2}}0mL(Boster Company, Wuhan), 0.3% Triton-100(Sigma, US), NaN3 80mg/ 100mL, PBS로 100mL로 희석하고 pH를 7.6으로 조정합니다. 7일째 배양을 종료하고 D-PBS로 5분 3회 세척하고 새로 준비한 4% 파라포름알데히드를 실온에서 30분 고정한 후 D-PBS로 5분 3회 세척하였다. 1:1:8 과산화수소, 메탄올 및 PBS 용액과 함께 실온에서 30분 동안 배양하고 D-PBS로 5분 동안 헹구고 5% 차단 염소 혈청을 실온에서 30분 동안 추가하고 D-PBS로 5분 동안 헹굽니다. 분, 항체 희석제(1:1000 희석, Calbiochem)로 희석된 염소 항-마우스 TH 항체를 첨가하고, 4도에서 밤새도록, D-PBS로 3분 동안 3회 헹구고, 항체로 희석된 비오틴화된 마우스 항-쥐 IgG를 첨가한다. 희석제(1:200 희석, Sigma USA), 상온에서 4시간 작용, D-PBS로 3분 3회 세척, 항체 희석제로 희석한 HRP 복합체를 실온에서 2시간 동안 첨가, D-PBS로 세척 3분 3회. DAB 희석액을 3분간 헹구고 즉시 사용할 수 있는 DAB 발색 시약(Wuhan Boster Company)을 세포에 넣고 도립 현미경으로 색을 관찰합니다.https://www.xjcistanche.com/
1.5 약물 취급
배양된 뉴런의 형태학적 관찰은 매일 위상차 현미경으로 관찰하였고 변화를 사진으로 기록하였다. 12시간 배양 후 도립현미경으로 세포를 관찰하고 합류 직전에 약물을 첨가하였다. 각 그룹의 혈청 함량은 10%였습니다. 3일 배양 후 최종 농도가 200μmol/L가 되도록 MPP plus를 첨가하였다. 37도, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양 후 각종 검사를 합니다.
시스탄체
1.6 유세포 분석 검출
약물 치료는 이전과 동일했습니다. 각 그룹을 처리한 후, 부착된 PC12 세포를 0.125% 트립신으로 분해하고 세포를 약 1 x 106 PBS로 취했습니다. 세포를 두 번 세척하고 490 μL의 결합 완충액을 첨가하고 세포를 완전히 혼합하고 5 μL의 annexin V를 첨가하였다. 세포 현탁액에 FITC와 10μL의 용해된 PI를 부드럽게 혼합하고 시험관을 4도에 놓고 암실에서 10분 동안 배양하고 COULTER EPICS 유세포 분석기(Beckman Coulter, USA)에서 시험합니다.
1.7 세포 사멸을 검출하기 위한 제자리 말단 표지(TUNEL)
배양된 뉴런의 DNA in situ end labeling은 Boster's apoptosis detection kit(MK1{8}}22)를 사용하며 단계는 다음과 같습니다. 폴리머 라이신 처리로 사전 배양), 1시간 동안 4{30}}g/L 파라포름알데히드로 고정, 실온에서 10분 동안 신선한 3% 아세트산(pH2.5), 알칼리성 포스파타제 중화, 0.1mol/L TBS(pH7.5) 1:200 새로 희석된 프로테이나제 K 분해를 37도에서 20초 동안 추가하고 각 슬라이드에 1μL의 TdT 및 DIG-d-UTP를 추가하고 37도에서 2시간 동안 완충 용액 18μL를 추가합니다. 실온에서 30분 동안 각 슬라이드에 50μL의 차단 용액을 추가합니다. 37도의 젖은 상자에서 30분 동안 반응합니다. 각 슬라이드에 0.1mol/L TBS로 희석된 SABC-AP 50μL를 추가합니다. BCIP/NBT(0.1mol의 pH9.5/L TBS 희석 1:20)를 표본에 첨가하여 30분 동안 발색했습니다. 동시에, 광현미경 및 도립 위상차 현미경(200X)을 위한 대체 대조군(TdT/비오틴-dUTP 혼합물 대신 TdT 완충액 사용) 세포 사멸 세포를 관찰합니다. 위상차 현미경으로 양성 세포를 계산하고 각 그룹에서 웰당 5개의 필드를 계산하여 총 6개의 웰을 계산합니다.
2. 실험 결과
2.1 배양된 뉴런의 형태학적 관찰
OlympusIX70 위상차 현미경으로 관찰: 접종 5시간 후 대부분의 세포가 벽에 부착되고 세포가 흩어져 있으며 세포체가 둥글고 핵이 보이지 않으며 굴절률이 강합니다. 24시간 동안 배양한 후, 세포 돌기가 자라면서 점차 연장되었다. 48h에서 대부분의 세포가 분지된 사상 돌출부로 돌출하였다. 세포의 형태는 양극성, 삼극성, 다극성으로 다양하며 점차 성긴 네트워크를 형성하였다. 세포체는 크고 둥글며 타원형이다. MPP 플러스 손상 후, 세포가 먼저 부풀어 오르고 굴절률이 증가하고 세포는 퇴행성 상태에 있었고 마침내 세포가 수축되어 떨어졌습니다. 다른 복용량의 복합 한약 함유 혈청은 MPP와 상해에 대한 보호 효과가 있습니다. 배양물을 TH 면역 세포로 염색한 후, TH 양성 세포는 신경돌기 파생물과 함께 갈색인 것으로 나타났습니다. 동량의 한방 혈청을 추가한 후 TH 양성 비율뉴런55퍼센트 -60퍼센트에 도달할 수 있습니다.
2.2 유세포 분석 시험 결과 분석(그림 1 참조)
아폽토시스 초기에 세포막 내부에 위치한 포스파티딜세린(PS)은 세포막 외부로 이동한다. 포스파티딜 결합 단백질 V(Annexin V)는 PS에 대해 높은 친화성을 갖는 칼슘 의존성 인지질 결합 단백질입니다. 따라서 Annexin V는 세포막 표면에 노출된 PS를 감지하는 프로브로 사용할 수 있습니다. 동시에 이중 PI 배제 방법과 결합더럽히는 것apoptotic 세포의 apoptotic 세포는 유세포 분석에 의해 감지 될 수 있습니다. 그림 1의 오른쪽 아래 사분면(FITC plus /PI-)에는 각 그룹의 세포 사멸 세부 정보가 표시됩니다. 세포의 비율, 세포사멸률은 각 군의 4.1%, 5.8%, 6.3%, 28.6%, 30.2%였다.
2.3 TUNEL 염색 결과 분석
핵에 청자색 입자가 있는 것은 양성 세포, 즉 사멸 세포입니다. 각 그룹에서 세포사멸 세포의 비율은 광학현미경으로 계수하였다. 각 그룹의 시야당 세포자멸사 세포의 수는 다음과 같습니다. 그룹 A 2.13±{3}}.34; 그룹 B 4.92±0.67; 그룹 C 6.20±1.47; 그룹 D 10.33±1.51; 그룹 E 12.74±2.51. 후에t-검정 분석,B 및 C 그룹을 E 그룹과 비교했습니다(P<0.05). the="">결과와 기본적으로 일치합니다.유세포 분석 결과.
3. 토론
파킨슨 병한의학에서 "떨림 증후군"의 범주에 속합니다. 한의학에서는 파킨슨병의 발병이 주로 노인의 간과 신장의 점진적인 고갈과 골수 경락의 영양 상실의 일련의 징후라고 믿습니다. 주된 치료는간과 신장에 영양을 공급하다, 간을 진정시키고 바람을 없앤다. 중국 전통 의학은 "의 목적을 수행할 수 있습니다.독성 감소 및 효능 증가"의 치료에파킨슨병, 그러나 그 작용 메커니즘은 현재 매우 명확하지 않습니다. 현대 의학의 수많은 실험적 증거는 산화 스트레스가 PD 신경 세포의 죽음을 유발하는 요인 중 하나임을 나타냅니다[3]. 연구에 따르면 cistanche의 총 배당체는 다양한 활성 산소 자유 라디칼을 효과적으로 제거하고 OH로 인한 산화로부터 DNA를 보호할 수 있습니다[8]. Cistanche 추출물 tubuloside B는MPP 플러스 ,세포 내 활성산소 축적을 약화시키고,MPP 플러스[9]. 중국 전통 의학은 자체 보호 신호 경로를 활성화 및 강화하고 외부 손상에 저항하며 균형을 회복할 수 있습니다. 이것은 중국 전통 의학의 현대화 목표 중 하나입니다. 도파민 대체 요법에 이어 사람들은 일반적으로 신경 보호 요법을 중요하게 여기며, 이를 치료의 2차 혁명이라고 합니다.파킨슨 병. 이 실험에서 분리된 중뇌 도파민성 신경 세포를 혈청 함유 한약으로 배양한 결과, Cistanche가 특정 신경 보호 효과가 있음을 발견했습니다. 이 실험에서는 유세포분석과 TUNEL 염색의 두 가지 검출 방법을 사용하여 Cistanche 약용 혈청 배양의 등가 투여군 혈청과 2배 등가 투여군 혈청이MPP 플러스apoptotic 세포의 수는 apoptotic 세포에 특정 보호 효과가 있습니다. 한의학은 도파민성 뉴런을 초기 단계에서 손상으로부터 보호할 수 있으며, 이는 다른 치료법보다 더 중요한 조치입니다. 그런 의미에서 한의학의 전인적 치료는 근본원인을 치료하는 것이며, 현재 사람들이 중시하는 신경보호적 치료의 하나로 볼 수 있다.
참고문헌
1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, et al. Levodopa는 배양된 신경 세포에서 세포자멸사를 유도합니다. 파킨슨병에서 흑질선조체 변성의 가능한 촉진제입니까? 무브 장애, 1997, 12(1):17
2. 제너 PG, 브린 MF. 레보도파 신경독성: 실험 연구 대 임상 관련성.Neurology,1998,50(6 Suppl 6): S39
3. Maruyama W, Naoi M. 파킨슨병의 세포 사멸. J Neurol, 2002,249(Suppl 2): II6
4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian, et al. 간 및 신장 기능이 있는 파킨슨병 치료에 대한 임상 관찰: 60건의 보고. 청두 한의학 저널, 1999, 22(3): 14
5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang 등. 간과 신장을 영양시키는 방법으로 치료한 파킨슨병 40예에 대한 임상 관찰. 한의학연구, 1998, 14(3): 10
6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron, et al. 파킨슨병 환자 40명 치료에 핑찬 1호 경구용액. 안후이 한의학 전문 대학 저널, 1999, 18(2): 9
7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A, et al. 쥐 E14 중뇌 세포 배양에서 티로신 수산화효소 양성 세포의 높은 백분율 수율. 브레인 레스,1992,586 (2):319
8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming, et al. cistanche의 총 배당체로 인한 OH·유도 DNA 손상에 대한 자유 라디칼 소거 및 보호 효과. 중국 약학 저널, 2001, 36(1): 29
9. Sheng G, Pu X, Lei L, et al. Cistanche salsa의 Tubuloside B는 1-Methyl-4-페닐피리디늄 이온 유도 세포자멸사 및 산화로부터 PC12 신경 세포를 구합니다.Stress.Planta Med,2002,68(11):966