Cistanche Deserticola는 KEAP1/NRF2/HO -1 항산화 경로를 조절하여 파킨슨 병 쥐에서 해마의 신경 세포 손상을 개선합니다.

추상적인:

 

목표를 탐색하는 목표파킨슨 병의 신경 세포 손상에 대한 Cistanche Deserticola (PD)쥐와 관련 메커니즘. 방법 Sprague-Dawley (SD) 수컷 쥐는 무작위로 3 개의 그룹 (각 그룹의 1 0 쥐) : 대조군, 모델 그룹 및 Cistanche Group : 모델 그룹 및 처리 그룹의 래트는 6- 하이드 록시 도파민 (6- OHDA)을 두개 내에서 주사 하였다. Cistanche 그룹의 래트에게 0.216G/ mL의 시스 치 용액을 제공하고, 블랭크 그룹의 래트에게는 모델 그룹 및 모델 그룹에 정상적인 식염수 관개가 제공되었고, 관개의 양은 2 주 동안 1ML/ (100G · d)였다. 해마에서의 신경 세포의 형태 및 초 구조는 헤마 톡시 린-에오오신 염색 및 전자 마이크로 코스피에 의해 관찰되었다. Hemimani 지역에서 Nishi 신체의 형태는 Nishi의 염색에 의해 관찰되었습니다. Malondialdehyde (MDA) 및 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 (SOD)의 수준은 티오 바르비 투르 산 방법 및 니트로 블루 테트라 졸륨 방법에 의해 검출되었다. 켈치-유사 에코 관련 단백질 1 (KEAP 1), 핵 인자 E 2- 관련 인자 2 (NRF 2) 및 Heme Cyclooxygenase 1 (HO {17}}) 단백질의 변화는 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. Cistanche Deserticola 약물의 치료 후, PD 래트의 해마 조직 구조는 개선되었고, 뉴런의 형태는 개선되었고, 핵 피레트토스 증은 완화되었고, 해마에서 항산화 효소 SOD의 함량은 점차적으로 증가한 반면, 산화 적 스트레스 생성물의 함량은 점진적으로 감소하였고, Hippocompus의 표현은 점진적으로 감소하였고, Hippocampus의 표현은 점진적으로 감소 하였다. NRF 2 및 HO -1의 단백질 발현이 증가했다. 결론 Cistanche Deserticola는 해마 뉴런의 손상을 개선하고 PD 쥐의 해마에서 산화 스트레스 반응 수준을 감소시킬 수 있습니다. 그만큼Cistanche Deserticola의 효과에서PD의 치료래트는 Keap -1 /nrf 2 /ho -1 신호 경로의 조절과 밀접한 관련이 있습니다.

 

 

 

PD의 치료를위한 고품질 시티 치

 

키워드 : Cistanche Deserticola;파킨슨 병; 산화 스트레스; 해마; 뉴런; Keap1; NRF2; Ho -1

 

글로벌 질병 데이터 연구의 통계에 따르면, 신경계 질환은 전 세계적으로 장애의 주요 원인이되었습니다. 이 분야에서 Parkinson 's Disease (PD)는 연령 표준화 유병률 증가, 장애 사례 증가 및 사망률 증가로 가장 빠르게 성장하는 질병 중 하나가되었습니다. 하나.
1990 년부터 2020 년까지 전 세계 PD 환자의 수는 118%증가하여 620 만 명에 이르렀으며 발병률은 여전히 ​​해마다 증가하고 있습니다 [1-2]. PD 환자는 일반적으로 진전, 근육 강성, 서맥 및 후기 단계의 균형 난이도와 같은 운동 증상을 나타냅니다. 그러나인지 감소와 같은 비 운동 증상은 질병의 초기 단계에서 발생할 수 있습니다. 질병이 진행됨에 따라인지 장애는 점차 악화되고 더 심해질 것입니다.

PD의 치료를위한 고품질 시티 치

환자의 삶의 질에 영향을 미칩니다 [3]. 해마는 공간 학습 및 외부 정보를받는 뇌에서 중요한 조직입니다. 그것은 인간인지 기능을 실현하는 주요 구조입니다. 해마 기능 장애는 PD 환자에서인지 기능 장애의 발병과 밀접한 관련이있다. 산화 스트레스는 해마 조직에서 신경 세포의 발달에 관여합니다. 손상 [4-5]. 따라서, 해마 뉴런이 PD 환자에서 보호되는 경우, 환자의인지를 향상시키고 질병의 진행을 지연시킬 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, 다양한 중국 약초 의약품이 신경 학적 관련 질병을 치료하는 데 효과적이라는 것이 입증되었습니다 [6]. Cistanche Deserticola는 신장 양에게 영양을 공급하고 본질과 피를 보충 할 수있는 한약입니다. 허혈성 뇌졸중 및 신경 원선염과 같은 신경계 질환을 치료하는 데 사용되었습니다 [7]. 연구 그룹의 이전 연구에 따르면 Cistanche Deserticola는 PD 모델 래트의 거동을 개선하고 중뇌의 실질 Nigra 영역에서 도파민 신경 세포의 아 pop 토 시스를 감소시킬 수 있습니다 [8-9]. 그러나, Cistanche Deserticola가 PD 모델 래트에서 해마 조직 손상을 개선 할 수 있는지는 확실하지 않습니다. 따라서,이 연구는 PD 치료에 대한 새로운 아이디어를 제공하기 위해 해마 조직 손상에 대한 시스초 체 Deserticola의 효과를 관찰하고 그 메커니즘을 탐색하기위한 PD 랫트 모델을 확립했다. NISSL 염색 시약 (Nanjing Senbeijia Biological Company); Isoflurane (상하이 야지 생물학적 회사).

 

1 재료 및 방법

1.1 재료

1.1.1 실험 동물

30 6- 210-230 g의 무게가 1 주일 된 SD 수컷 쥐가 사용되었습니다. 후지안 전통 중국 의학 대학의 실험 동물 센터는 실험 동물과 일반적인 의료 실험 동물 환경 시설을 제공했습니다. 이 실험은이 기관의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었으며 윤리 등록 번호는 1N2023019입니다.

1.1.2 실험 시약
Cistanche Deserticola Granules (Fujian Third People 's Hospital); 6- Hydroxydopamine (6- OHDA) 시약 (Beijing Biolabor Technology Co., Ltd.); 헤 마톡 실린-에오신 (HE) 염색 시약 (Taizhou Yunke Biotechnology Co., Ltd.); 동물 조직 단백질 용 해물 (Beijing Solebao Biological Company); 단백질 포스파타제 억제제 (Wuhan Pujian Biological Company); 프로테아제 억제제 (Hunan Yunbang Biotechnology Company); 켈치-유사 에코 관련 단백질 -1 (KEAP1) 단일 클론 항체 (Wuhan Sanying Biotechnology Company); Glyceraldehyde 3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH) 모노클로 날 항체 (Wuhan Huamei 생물학적); 핵 인자 E2 관련 인자 2 (NRF2), 헴 옥 시게나 제 1 (Hemoxygenas -1, Ho -1) 단일 클론 항체 (Wuhan Pujian Biotechnology Co., Ltd.); 과산화물 디스 뮤 타제 (SOD) 및 Malondialdehyde (MDA) 검출 키트 (Shanghai Biotech Co., Ltd.); NISSL 염색 시약 (Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd.); Isoflurane (Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd.).

 

1.1.3 기기

JEA3001 전자 밸런스 (Shanghai Puchun 측정 기기 Co., Ltd.); BSA224S 전자 균형 (Sartorius, Germany); STAB S2T 저온 셰이커 (Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., Ltd.); RM2235 완전 자동 파라핀 슬라이서 (Leica, Germany); Pectramax i3x 다기능 마이크로 플레이트 리더 (Molecular Devices, USA); BX63
형광 현미경 (일본 올림푸스); DLAB 핸드 헬드 원심 분리기 D1008/D1008E (Beijing Dalong Xingchuang Experimental Instrument Co., Ltd.); Cryocube F740HI 초 저온 온도 냉장고 (Epend, Germany); Minipro epbasic 기본 전기 영동 기기 전원 공급 장치 (Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.); 일정한 온도 건조 오븐 (Hangzhou Notting Scientific Equipment Co., Ltd.); Ascent Max Ductless Fume Hood (Shanghai Yishike Enterprise Development Co., Ltd.).

 

1.2 방법

1.2.1 모델 설립 및 동물 그룹

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0 서클은 성공적인 모델링으로 간주되었습니다. 그 후, Cistanche Deserticola 그룹의 래트는 매일 0.216 g/ml Cistanche Deserticola 용액으로 도장되었고, 블랭크 그룹과 모델 그룹은 정상 식염수로 기부되었다. 쥐의 세 그룹의 위장 부피는 2 주 동안 1 mL/(100 g · d)였다 [9]. 각각의 래트 그룹의 치료가 완료된 후, 래트를 2% 이소 플루 란 흡입 마취에 의해 안락사시키고 뇌 조직을 후속 실험 연구를 위해 수집 하였다.

 

1.2.2 헤 마톡 실린-에오신 염색에 의한 해마 조직의 병리학 적 변화 관찰

 

각 그룹에서 래트의 해마 조직을 수집하고, 포름 알데히드 용액에 넣고, 구배 에탄올로 탈수시키고, 건조 오븐에서 구운, 용해 된 왁스, 탈 웬트, HE로 염색하고, 크실렌으로 투명하고, 잇몸으로 밀봉 된 후, 마이크로 스코프 하에서 관찰 하였다.

 

1.2.3 전이 전자 현미경 해마 신경 세포의 초 구조의 관찰

해마 조직을 3% 글루 타르 알데히드 고정제에 넣고, 구배 에탄올로 탈수시키고, 매립 된 (에폭시 수지)를 제조 하였다. 해마 신경 세포 (투과 전자 현미경 하에서)의 초 구조적 변화를 관찰하기 위해 리드 시트 레이트 및 우라 닐 아세테이트 염색을 사용 하였다.

 

1.2.4 해마 조직에서 NISSL 신체의 변화를 관찰하기위한 NISSL 염색

상기 언급 된 해마 조직 파라핀 섹션을 각각 무수 에탄올, 95% 및 70% 구배 에탄올로 수화시켰다. 증류수로 3 회 세척 한 후, NISSL 염색 용액으로 5 분 동안 염색 한 다음, 탈수 된 구배 알코올 및 증류수로 세척하고 자일 렌으로 제거합니다. 섹션을 중성 접착제로 밀봉하고 응고 후 광학 현미경으로 관찰 및 기록 하였다.

 

1.2.5 해마 조직에서 MDA 및 SOD의 함량을 감지하는 화학적 비색 방법

상이한 실험 기의 해마 조직을 균질화 한 후, 20 분 동안 1000g에서 원심 분리하고 각 실험 그룹의 상청액을 수집 하였다. 키트의 지시에 따라, MDA 및 SOD 분석 키트를 사용하여 각 실험 샘플 그룹에서 MDA 및 SOD의 함량을 감지 하였다.

 

1.2.6 해마 조직에서 Keap1, NRF 2 및 Ho -1 단백질의 특이 적 발현을 검출하기위한 단백질 면역 블 롯팅

각 그룹의 해마 조직을 용해 완충제와 함께 첨가하고 12에서 원심 분리 하였다. 000 r · min -1 15 분 동안. 상청액은 대기 용도로 수집되었습니다. 단백질 농도는 BCA 방법에 의해 결정되었다. 단백질 정량화 결과에 따르면, 총 단백질의 상응하는 부피를 첨가하고 단백질 겔 전기 영동으로 로딩 하였다. 샘플을 10 분 동안 95도에서 변성시키고, 막으로 옮기고, 절단하고, 차단 용액에서 1 시간 동안 차단 하였다. 희석 된 1 차 항체 Keap1, NRF 2, HO -1 및 GAPDH (1 : 500)를 첨가하고, 4도에서 밤새 반응하고, 1 × TBST와 함께 세척하고, 2 차 항체 (1 : 4000)와 함께 인큐베이션하고, 1 × TBST로 다시 세척 하였다.

 

1.3 통계 분석

계수 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. 정규 분포 및 분산의 동질성을 준수하는 데이터는 t 테스트를 거쳤으며, 정규 분포 및 불평등 한 분산에 부합하는 데이터는 수정 된 t 테스트를 수행 하였다; 정규 분포를 준수하지 않은 데이터는 비모수 적 테스트에 적용되었습니다. 일원 분산 분석을 사용하여 다른 그룹 간의 차이를 비교 한 다음 LSD 방법을 사용하여 두 그룹을 비교했습니다. P <0. 05는 통계적으로 유의 한 것으로 간주되었습니다.

 

2 결과

2.1 PD 모델 래트에서 해마 CA1 영역의 형태 학적 구조에 대한 Cistanche Deserticola의 효과 그는 빈 그룹 쥐의 해마 CA1 영역에서의 뉴런이 정기적이고 균일 한 분포로 깔끔하고 단단히 배열되었으며 명백한 신경 세포 손상이 없음을 보여 주었다. 모델 그룹의 뉴런 세포는 더 무질서하게 배열되었고, 세포 핵이 줄어들고, 핵 염색이 심화되었고, 뉴런 세포 손상이 명백 하였다; Cistanche Deserticola 그룹의 뉴런 세포는 모델 그룹의 것보다 더 규칙적으로 배열되었고, 핵 축합의 수는 상대적으로 감소되었고, 뉴런 세포 손상이 완화되었다. 결과는 그림 1에 나와 있습니다.

 

 

그림 1 Parkinson의 쥐에서 해마의 CA1 영역에서 병리학 적 구조에 대한 Cistanche Deserticola의 효과 (He, × 400) 참고 : A : 대조군; B : 모델 그룹; C : Cistanche Group. 검은 색 화살표는 손상된 신경 세포를 나타냅니다.

 

2.2 PD 모델 래트에서 해마 뉴런의 초 구조에 대한 시스초 체 Deserticola의 영향

블랭크 그룹에서, 해마 뉴런을 관찰 할 때, 세포 구조는 명확한 형태를 유지하고, 핵은 규칙적인 원형 또는 타원형 형태를 나타내고, 핵막은 매끄럽고 손상되지 않으며, 핵의 크로마틴은 균등하게 분포되며, 핵 염색질의 가장자리 집계는 없다. 대조적으로, 모델 그룹의 해마 뉴런은 명백한 변화를 나타냈다 : 세포의 전체 전자 밀도가 증가하고, 핵의 크로마틴이 응집되고, 핵막의 바닥에 부착되어, 핵막이 두꺼워지고, 뇌물이 세포질에서 관찰되었다. Cistanche Deserticola와의 중재 후, 모델 그룹과 비교하여, Cistanche Deserticola 그룹의 해마 뉴런은 특정 회복 경향을 나타냈다 : 뉴런 세포 신체의 크기는 회복되었고, 세포막은 손상되지 않았으며, 핵 염색체의 가장자리 응집은 특정 정도까지 완화되었으며, 핵막의 두분화는 또한, 핵막증의 뇌물이 많았다. Cistanche Deserticola가 신경 세포에 대한 특정 보호 또는 복구 효과가 있음을 나타냅니다. 그림 2를 참조하십시오.

 

그림 2 파킨슨 병 쥐 해마에서 신경 초 고정에 대한 시스초 체 Deserticola의 효과 (× 7000) 참고 : A : 대조군; B : 모델 그룹; C : Cistanche Group.

 

2.3 PD 모델 쥐의 해마 뉴런에서 NISSL 신체에 대한 Cistanche Deserticola의 효과

NISSL 염색 결과는 공백 그룹의 뉴런이 정기적 인 형태, 풍부한 NISSL 신체 및 어두운 염색으로 밀접하게 배열되어 있음을 보여 주었다; 모델 그룹의 뉴런은 느슨하게 배열되어 부어 오르고, 대부분의 NISSL 몸체는 용해되어 가볍게 염색되었다; Cistanche Deserticola 그룹의 뉴런은 규칙적인 형태로 밀접하게 배열되었으며, NISSL 신체의 수와 염색은 모델 그룹과 비교하여 개선되었습니다. 결과는 그림 3에 나와 있습니다.

 

그림 3 파킨슨 병 쥐 (NISSL, × 200)에서 NISSL의 해마 신경 세포의 NISSL 신체에 Cistanche Deserticola의 효과 : A : 대조군; B : 모델 그룹; C : Cistanche Group.

 

2.4 파킨슨 병 해마에서 SOD 및 MDA 함량에 대한 시스초 체 Deserticola의 영향

 

블랭크 그룹과 비교하여, 모델 그룹 해마의 SOD 함량은 감소하는 반면, MDA 함량은 증가했다. 모델 그룹과 비교하여, Cistanche Deserticola 그룹의 해마의 SOD 함량은 증가한 반면, MDA 함량은 감소했습니다. 표 1을 참조하십시오.

 

꼬리표. 1 Cistanche Deserticola가 파킨슨 병 해마에서 SOD 및 MDA 함량에 미치는 영향

그룹	SOD (PG/ML)	MDA (PG/ML)
제어	12.36±2.75	2.85±0.83
모델	2.75±0.83*	9.95±0.37*
rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

참고 : 대조군과 비교하여 *p<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5 Cistanche Deserticola의 Keap1, NRF2 및 Ho -1 Parkinson 병 쥐 해마에서 Ho -1 단백질의 발현에 미치는 영향

웨스턴 블롯 실험의 결과는 모델 그룹에서 래트 해마에서 NRF2 및 HO -1 단백질의 발현이 감소하는 반면, KEAP1 단백질의 발현은 증가 하였다; 모델 그룹과 비교하여, Cistanche Deserticola 그룹에서 래트의 해마에서 NRF2 및 HO -1 단백질의 발현은 증가한 반면, KEAP1 단백질의 발현은 감소 하였다. 그림 4와 표 2를 참조하십시오.

그림 4 Parkinson 병 쥐 해마에서 Keap1, NRF2 및 Ho -1의 발현에 대한 Cistanche Deserticola의 효과

참고 : A : 제어 그룹; B : 모델 그룹; C : Cistanche Group

 

 

꼬리표. 2 Parkinson 병 쥐 해마에서 Keap1, Nrf2, Ho -1의 발현에 대한 Cistanche Deserticola의 효과

 

그룹	kepl	NRF2	Ho -1
빈 그룹	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
모델 그룹	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
긍정적 인 그룹	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

참고 : 대조군과 비교하여 *p <{{{0}}. 05; 모델 그룹과 비교하여 #p <0.05.