Cistanche Deserticola 다당류는 신경 보호 효과가 있습니다

자세한 정보:Ali.ma@wecistanche.com

Yue Liu 외

추상적인:

허혈성 뇌졸중은 이환율과 사망률이 높은 질병입니다.시스탄체데저스티콜라다당류(CDP)간 보호 및 면역 항상성을 포함한 광범위한 유익한 효과를 가지고 있습니다. 우리가 아는 한, CDP의 보호 효과(돌궤통증데저스티콜라다당류)OGD/RP(oxygen-glucose deprivation/reperfusion)에 의해 손상된 뉴런에 대한 연구는 수행되지 않았습니다. 이 연구에서 OGD/RP는 PC12 세포 모델을 손상시켰습니다. 간단히 말해서 CDP(돌궤통증데저스티콜라다당류)({{0}}.05, 0.5 및 5 ug/ml)를 재관류 전에 투여했습니다. CDP의 보호 효과(돌궤통증데저스티콜라다당류)그런 다음 세포 생존율, 젖산 탈수소효소(LDH) 누출, [Ca2 plus ]I, 미토콘드리아 막 전위(MMP) 및 세포 사멸에 기초하여 평가되었고, 재관류 후 andredox 상태는 활성 산소 종(ROS), 카탈라제( CAT), 글루타티온 퍼옥시다제(GSH-Px) 및 총 항산화 능력. 파킨슨병 관련 단백질 DJ-1가 내인성 항산화에 참여하여신경보호허혈 뇌졸중 후 효과, 우리는 CDP 사이의 상호 작용을 조사(돌궤통증데저스티콜라다당류)그리고 DJ{{0}}. DJ-1 발현은 ELISA와 Western blot 분석을 통해 검출하였고 DJ-1의 전위는 면역형광법을 통해 평가하였다. 결과는 CDP(0.05, 0.5 및 5 ug/ml)가 PC12 세포 사멸을 약화시키고 MMP 및 칼슘 항상성을 보존함을 보여주었습니다. 산화 스트레스를 억제하고 세포 사멸을 감소시킵니다. 또한 CDP(5 ug/ml)는 DJ 분비와 발현을 현저하게 자극했습니다. 전반적으로 결과는 CDP가(돌궤통증데저스티콜라다당류)발휘하다신경보호산화 스트레스를 억제하고 DJ{1}} 경로를 조절하여 OGD/RP 유발 손상에 대한 효과

키워드:Cistanche Deserticola, 다당류, 신경 보호, 산소 포도당 결핍/재관류, 산화 스트레스DJ-1

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1. 소개

허혈성 뇌졸중은 전 세계적으로 사망의 두 번째 주요 원인이자 장기 장애의 주요 원인입니다[1]. 뇌졸중으로 인한 사망은 2030년에 780만 명으로 증가할 것으로 예상됩니다[2]. 중국에서는 매년 100명당 58~142명이{9}} 뇌졸중으로 사망합니다. 따라서, 허혈-재관류 손상을 역전시키는 효과적인 전략이 개발되어야 합니다. 산화 스트레스가 재관류 동안 뇌경색의 발달과 진행을 촉진하는 주요 요인이라는 광범위한 증거가 있습니다[3,4]. 따라서 효과적인 발견신경보호ROS를 감소시키고 산화 스트레스를 억제할 수 있는 제제는 연구에서 상당한 관심을 끌었다. 파킨슨병 관련 단백질DJ-1는 항세포자살 및 항산화 유전자 발현을 자극하여 신경보호를 매개합니다[4,5]. DJ-1는 산화 스트레스 및 유사분열 자극에 의해 미토콘드리아로 전위될 수 있으며 유방암, 흑색종 및 OGD/RP 손상과 같은 병리학적 조건에서 세포외 기질로 분비될 수 있습니다[6]. 또한, DJ-1는 항산화에서 중요한 역할을 하기 때문에 허혈성 신경변성의 치료 표적화에 유용합니다[4,7]. 지난 10년 동안 여러 그룹에서 DJ{12}}가신경보호생체 내 국소 대뇌 허혈 모델 및 시험관 내 OGD/RP 모델에 대한 영향[6-9]. 한편, 사이클로스포린 A 및 페닐부티르산나트륨을 포함한 일부 약물은 DJ{2}} 상향 조절 허혈 뇌졸중을 통한 신경 세포 사멸을 폐지합니다[9,10 ].

시스탄체데저스티콜라, 일체형 건조 식물시스탄체데저스티콜라YCMa와 Cistanche tubulosa Wight는 주로 중국 북부와 북서부의 사막 지역에서 생산됩니다[11]. C. Deserticola는 식용이 가능하며 '사막의 인삼'이라는 영예를 안고 있습니다. 경혈처방에서는 만성신장질환, 성기능불능, 여성불임, 백반증, 월경과다, 노인성변비 등의 치료제로 사용한다[12].C. 에서 분리된 주요 활성 성분인 데저티콜라 다당류시스탄체 데저스티콜라. CDP는 면역 기능과 지질 균형을 조절하고 노화, 산화 및 간 손상으로부터 보호합니다. 또한 CDP(돌궤통증데저스티콜라다당류)심장과 간에서 허혈-재관류 손상을 방지합니다[13,14]. 최근 연구에 따르면 CDP는(돌궤통증데저스티콜라다당류)무독성[12,15,16]이며 C. Deserticola에서 추출한 echinacoside, isoacteoside, acteoside 및 salidroside를 포함한 기타 파이토케미컬은 다음을 나타냅니다.신경보호효과[11,12]. 그러나 허혈성 뇌졸중 손상의 개선을 위한 CDP의 잠재적 사용은 보고된 바 없습니다.

본 연구에서 우리는 CDP가(돌궤통증데저스티콜라다당류)신경 보호를 위해 산화 스트레스를 억제합니다. CDP의 잠재적인 보호 효과(돌궤통증데저스티콜라다당류)허혈성 뇌졸중 손상은 OGD/RP 손상 PC12세포를 사용하여 조사되었습니다. 그런 다음 DJ-1와 관련된 기본 상호작용을 탐색했습니다.

2. 방법

2.1. 세포 배양 및 OGD/RP 모델

PC12 세포는 5% CO2를 포함하는 정상산소 배양기에서 37도에서 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양되었습니다. 배지는 48시간마다 교체되었습니다. OGD/RP 모델을 준비했습니다. PC12 세포를 세척하고 Earle의 균형 염 용액에 노출시켰다. 그런 다음, 세포를 5% CO2 및 95% N2를 포함하는 혐기성 챔버로 37도에서 4시간 동안 옮긴 다음 재산소화되도록 하였다. 이 단계에서 동일한 부피의 배양 배지를 세포에 첨가하였다. 재산소화 후, 세포를 24시간 동안 정상산소 인큐베이터에 두었다.

2.2. 약물 투여

CDP(돌궤통증데저스티콜라다당류)중국 상하이의 Yuanye Biological Technology Co.에서 구입했습니다(C23J7Y18405, > 98% 순도). 허혈성 뇌졸중의 1차 치료제인 Nimodipine은 양성 대조군으로 사용되었다[17-19]. 니모디핀 주사는 Bayer Company에서 제공했습니다. 세포를 대조군, 비히클(OGD/RP), Nimo(5 ug/ml), CDP의 6개 그룹으로 무작위로 나누었습니다.(돌궤통증데저스티콜라다당류)(0.05ug/ml), CDP(돌궤통증데저스티콜라다당류)(0.5ug/ml) 및 CDP(5ug/ml). 니모디핀과 CDP(돌궤통증데저스티콜라다당류)재관류 전에 추가되었습니다. 대조군은 정상배지에서 배양하고 정상산소 조건에서 배양하였다.

2.3. 세포 생존율: MTT 및 NRU 분석

PC12 세포(웰당 6 × 103개)를 96-웰 배양 플레이트에 접종했습니다. 세포는 각 그룹의 요구 사항에 따라 처리되었습니다. MTT(Solarbio, China)를 5 mg/ml의 농도로 세포에 첨가하고 37도에서 4시간 동안 배양하였다. Formazan은 살아있는 세포에서 succinate dehydrogenase의 환원 산물입니다[20]. 생성된 청색 포르마잔의 용해를 위해 DMSO를 첨가하였다. Microplate Reader(Thermo, USA)를 사용하여 25도에서 10분 동안 세포를 흔든 후 490 nm의 파장에서 흡광도를 검출하였다. 세포 생존율 결과는 대조군의 백분율로 나타났다[21].

NRU(Neutral red uptake) 분석은 이전에 발표된 프로토콜에 따라 수행되었습니다[22]. 재관류 기간이 완료되면 뉴트럴 레드(Solarbio, China)를 50 ug/ml의 농도로 세포에 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 0.5% 포름알데히드와 1% 염화칼슘을 포함하는 용액으로 빠르게 씻어냈습니다. 이어서, 세포를 1% 에틸산 및 50% 무수에탄올을 함유하는 혼합물에 첨가하였다. 세포를 37도에서 20분 동안 흔든 후 플레이트를 540 nm 흡광도에서 판독했습니다. 세포 생존율의 결과는 대조군의 백분율로 나타내었다.

Cistanche deserticola polysaccharides have a Neuroprotective effect

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2.4. 세포독성 평가

LDH는 젖산 토피루베이트의 산화를 촉매하는 세포질 효소입니다. LDH는 세포막이 손상되면 세포 외액으로 빠르게 방출됩니다. 따라서 LDH 검출은 일반적으로 세포 독성 평가를 위해 수행됩니다. [23]. 실험 절차는 LDH 분석 키트(Jiancheng, China)에서 제공하는 상용 키트 지침을 따랐습니다. 각 샘플의 흡광도는 마이크로플레이트 판독기로 440 nm에서 검출되었습니다. 세포 사멸 백분율은 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다. 생존율(%) =(OD 처리 - OD 처리 공백)/(OD 최대 LDH 활성 - OD 최대 LDH 활동 공백) × 100%.

2.5. 세포내 Ca2 플러스 농도 검출

Ca2 plus의 세포 내 농도는 Fluo{1}}/AM으로 측정되었습니다[15]. PC12 세포를 PBS로 3회 세척한 후 2 μM Fluo{5}}/AM(Beyotime, China)과 함께 암소에서 37도에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 세포외 염료의 퍼징을 위해 세포를 PBS로 3회 세척하였다. Fluo-3/AM의 형광 강도는 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Olympus, Japan)에서 측정되었습니다. 소프트웨어 패키지 Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer 및 ImageJ는 회색조 값 계산에 사용됨

2.6. MMP 측정

JC-1(5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethyl-imidacarbocyanine; Beyotime, China)는 일반적으로 염색에 사용되는 편리한 전압 감지 프로브입니다. 세포 및 MMP 평가 [24]. PC12 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척한 다음, 50% 배지 및 50% 작동 액체를 함유하는 혼합물과 함께 암소에서 37도에서 15분 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음, 혼합물을 버리고 새로운 배지로 교체했습니다. 적색 및 녹색 형광 이미지는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 통해 캡처되었습니다. 적색 및 녹색 형광 신호의 상대적 비율은 MMP 측정에 사용되었습니다[25]. 소프트웨어 패키지Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer 및 ImageJ는 회색조 값 계산에 사용되었습니다.

2.7. Apoptosis 검출 분석, Hoechest33342 및 유세포 분석

DNA 결합 염료인 Hoechst33342는 세포 사멸의 검사에 사용되었다[26]. 재관류 후, PC12 세포를 PBS로 3회 세척하고 어두운 곳에서 37도에서 15분 동안 5 ug/ml의 농도로 Hoechst33342(Beyotime, China)와 함께 인큐베이션하였다. 그 다음, 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 세포를 관찰하였다. 세포 사멸 세포는 강렬한 청색 형광과 핵 응축을 나타냈다. 각 염색 실험에 대해 3개의 무작위 필드를 캡처하고 정량화했습니다. Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer 및 ImageJ는 회색조 값 계산에 사용되었습니다. apoptotic cell의 비율은 apoptotic amount/total amount × 100%의 공식으로 계산하였다[27].

2.8. ROS 생성 측정

형광 프로브 2',7'-디클로로플루오레세인-디아세테이트(DCFH-DA; Jiancheng, China)는 세포막을 투과할 수 있고 비형광 DCFH로 가수분해될 수 있습니다. DCFH는 세포내 ROS tofluorescent DCF에 의해 산화된다[29]. 재관류 후, 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 암소에서 37도에서 45분 동안 10μM의 최종 농도에서 DCFH-DA와 함께 인큐베이션하였다. 여기 파장이 485 nm이고 방출 파장이 535 nm인 형광 분광 광도계에 의해 형광이 관찰되었다.

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2.9. 산화 스트레스 지표 측정: CAT, GSH-Px 및 T-AOC 수준

세포를 긁어내고 PBS에 재현탁시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 얼음 위에서 45회 초음파 처리하고 4도에서 10분 동안 1000r/min으로 원심분리하였다. 상층액은 유지되어 검출에 사용되었습니다[24]. 세포 상층액의 총 단백질 함량은 BCA 단백질 분석 시약 키트(KeyGEN, China)로 측정하였다. CAT, GSH-Px 및 T-AOC 수준의 활성은 제조업체의 지침(Jiancheng, China)에 따라 측정되었습니다. 각 샘플의 흡광도는 마이크로플레이트 리더로 검출하였다.

2.10. 세포외 DJ-1 농도 측정

PC12 세포(웰당 6 × 103)를 96-웰 배양 플레이트에 접종했습니다. 재관류 후, 세포 상청액을 수집하고 DJ{4}}/PARK{5}} ELISA Kit(Raybio, USA)로 분석했습니다. ) 제조업체의 지침에 따라 [9]. 각 샘플의 흡광도는 450 nm 또는 540 nm의 이중 파장에서 Microplate Reader로 감지되었습니다.

2.11. 웨스턴 블롯 분석

세포 단백질은 제조업체의 지침(KeyGEN, 중국)에 따라 얼음처럼 차가운 용해 완충액으로 추출되었습니다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 시약 키트로 결정되었습니다. 각 그룹의 동일한 양의 단백질 용해물(20ug)을 12% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 분리한 다음 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼습니다. 멤브레인을 5% 탈지유를 포함하는 PBS로 실온에서 2시간 동안 배양한 다음 항-PARK7/DJ{8}} 항체(ab76008, Abcam; dilution 1:1000)로 밤새 4도에서 탐침하였다. 그런 다음, 멤브레인을 PBST로 3회 세척하고 2차 항체 염소 항토끼 IgG(SA{14}}, Proteintech Group; 희석액 1:5000)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했습니다. 항체 항튜불린({19}}AP, Proteintech Group, dilution 1:1000)을 대조군으로 간주했습니다. 단백질 밴드는 ECL(Enhanced chemiluminescence) 반응 시약에 의해 시각화되었습니다. 밴드 밀도는 QuantityOne Analysis 소프트웨어 v.4.6.9로 측정되었습니다.

2.12. 면역세포화학 분석

PC12 세포는 재관류 처리 후 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정되었습니다[9]. 과도한 파라포름알데히드를 제거한 후, 세포를 실온에서 10분 동안 0.3% Triton X-100를 함유한 PBS에서 배양했습니다. 그런 다음 세포를 PBS로 3회 세척한 후 5% 정상 염소 혈청과 함께 1시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 미토콘드리아 염색을 위해 토끼 마우스 단일클론 항-ATP 합성효소 사슬(MABS1304, EMD Millipore, 희석 1:200)과 함께 배양한 다음 항-PARK7/DJ{17}} 항체(희석 1: 100) 단백질 DJ의 프로빙{20}}. 세포를 세척하고 염소 항-토끼 IgG-Alexa 488(녹색; A11034, Invitrogen; 희석액 1:1000) 및 염소 항-마우스 IgG-Alexa 594(빨간색; A11032; Invitrogen; 희석액 1:1000)로 90분간 배양했습니다. 분 마지막으로, 세포를 PBS로 3회 세척하고 DAPI가 포함된 장착 배지를 사용하여 유리 슬라이드에 장착했습니다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 면역형광 이미지를 시각화했습니다.

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2.13. 데이터/통계분석

모든 값은 평균 ± SD로 표시되었습니다. 유의성은 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Dunnett의 다중 비교 테스트에 의해 결정되었습니다. p < .05는="" 통계적="" 유의성으로="" 간주되었습니다.="" 실험="" 데이터는="" spss="" 17.0="" 통계="" 소프트웨어를="" 사용하여="">

3. 결과

3.1. CDP(돌궤통증데저스티콜라다당류)OGD/RP 유도 세포 손상 억제

OGD/RP에 노출된 PC12 세포는 수의 현저한 감소를 나타냈습니다. 세포의 모양이 변하고 세포막이 부서졌습니다. MTT 분석에서 CDP의 세포 생존율(돌궤통증데저스티콜라다당류)그룹({0}}.05, 0.5 및 5 ug/ml)은 각각 58.91% ± 5.40%, 61.13% ± 3.81% 및 68.57% ± 3.24%, p < .05(그림="" 1a)="" ,="" 차량의="" 경우="" 51.68%±3.89%로="" 나타났다.="" 이="" 값은="">(돌궤통증데저스티콜라다당류)OGD/RP 손상으로부터 세포를 보호하고 세포 사멸을 감소시킵니다. 또한 Nimo 그룹의 세포 생존율은 77.02% ± 5.22%로 5ug/ml CDP와 거의 동일합니다.(돌궤통증데저스티콜라다당류)치료군.

NRU 분석에서 CDP의 세포 생존율(돌궤통증데저스티콜라다당류)그룹({0}}.05, 0.5 및 5 ug/ml)은 각각 52.03% ± 4.72%, 58.49% ± 2.50% 및 69.17% ± 3.91%였습니다(그림 1B). 차량은 47.14%±2.88%를 기록했다. 값은 CDP의 농도 의존적 보호 효과를 나타냅니다.

차량(44.73% ± 3.30%)과 달리 CDP에서 LDH 방출이 크게 감소했습니다.(돌궤통증데저스티콜라다당류)여러 떼. CDP에서(돌궤통증데저스티콜라다당류)그룹({0}}.05, 0.5 및 5 ug/ml), LDH 누출율은 각각 32.41% ± 3.70%, 27.13 ± 2.79% 및 23.13% ± 4.59%, p < .01(그림="" 1c).="" 또한="" nimo="" 그룹의="" ldh="" 누출률은="" 21.99%="" ±="" 4.02%로="" 5ug/ml="" cdp="" 처리="" 그룹과="" 거의="">