Cistanche : 에키나코사이드 유도 내피 세포에서 산화 질소 생산 : 안드로겐 수용체와 PI3K-Akt 경로의 역할

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LI GU, DANHONG LIAN, YIMAI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU 및 XIN LIU

소개

시스탄체호프. Et Link는 Orobanchaceae 가족의 속의 다년생 기생충 허브입니다. 허바시스탄체의 줄기시스탄체 데저디콜라Y. c . 석사 및시스탄체 튜불로사(Schenk) R. Weight는 신장 결핍, 발기 부전, 병적 백혈구 및 노인성 변비 (1)를 치료하기 위해 강장제로 사용되어 왔으며, 이는 안드로겐 유사 또는 성 호르몬 조절 효과로 인한 것일 수 있습니다 (2).에키나코사이드(EcH; c35H46O20;

분자량, 786.73; 도 1)은 허바의 줄기로부터 분리된 페닐에타노이드 배당체(PhGs) 중 하나이다.시스탄체, 항산화제, 노화방지, 항염증성, 간보호 및 신경보호 효과를 포함하는 여러 생물학적 특성을 나타낸다(3). 현대 약리학 조사는 허바의 다양한 구성 요소가 있음을 입증했습니다.시스탄체EcH, acteoside, kankanose, kankanoside F 및 cistanoside F를 포함하여 혈관 이완제 활성을 나타낸다 (4).

내피는 혈관 구조의 중요한 조절자이며, 산화 질소 (NO)는 내피 세포에 의해 방출되는 중요한 이완 인자입니다. 평활근 세포로 확산함으로써, NO는 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시키고, 고리형 구아노신 모노포스페이트 (cGMP)의 수준을 증가시킨 다음, cGMP 의존성 단백질 키나아제 (PKGs)를 활성화시켜 평활근 이완을 촉진한다 (5). 이전에 350-400 μM의 EcH가 혈관 평활근에 직접 작용하고 쥐 폐동맥 평활근 세포에서 저산소증으로 유발 된 증식을 억제한다는 것이 입증되었지만 (6), 30-300 μM EcH는 농도 의존적 인 방식으로 내피 손상되지 않은 고리에서 급성 혈관 이완을 일으켰으며 페닐 에프린에 의해 수축 된 대동맥 고리의 코퍼스 캐버노섬 평활근에서 cGMP 생산을 향상 시켰습니다 (7). 평활근 세포에서 NO-cGMP-PKG-BKca 채널을 개방함으로써, 100 또는 300 μM EcH는 래트의 폐동맥, 특히 내피-데누드 고리에서 노르아드레날린-유도된 수축을 억제하였다(도 8). 내피 세포는 심혈관 기능의 핵심 조절자이며, 몇몇 경우에, 내피 의존성 이완은 내피로부터 방출된 NO와 같은 전이 가능한 물질에 기인한다는 것이 밝혀졌다(도 9). 그러나, 혈관 내피 세포에서 EcH-유도된 NO 생산의 상류 분자 메카니즘은 추가적인 조사를 필요로 한다.

혈관 내피에서, NO 생성은 주로 내피 NO 합성 효소 (eNOS)에 의해 매개된다. 몇몇 그룹은 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K) 경로가 세린 트레오닌 단백질 키나제 B (Akt)를 활성화시키고, 이는 세린 1177 (Ser1177) (10)에서 직접적인 eNOS 인산-일화를 일으킨다는 것을 입증하였다 (10). 안드로겐 수용체 (AR)는 유전자 발현을 정식으로 변형시키는 핵 수용체 서브패밀리 s3의 구성원이다. AR localiza-tion은 세포막에서 caveolae에 관여한다.

c-Src/PI3K/Akt 캐스케이드를 트리거하여 내피 세포 기능 또는 유전자 발현의 비게놈 조절은 궁극적으로 eNOS 인산화 및 NO 생산을 초래한다(11). 인간 대동맥 내피 세포에서, testos-terone은 PI3K / Akt 신호 전달을 활성화하고 AR과 심혈관 시스템에서 PI3K의 p85α 서브 유닛의 직접적인 상호 작용으로 인해 NO 생산을 신속하게 유도하는 것으로보고되었습니다 (12). EcH는 호르몬 결핍 관련 증상을 악화시키고 테스토스테론 대신 AR에 대한 경쟁적인 결합으로 인해 안드로겐과 같은 효과를 발휘한다고보고되었습니다 (2). 따라서 본 연구는 PI3K / Akt 경로가 EcH에 의해 유도 된 AR 의존성 eNOS 인산화를 통한 NO 생산에 관여 할 수 있다고 가정했습니다. 본 연구의 목적은 EcH의 다음의 효과를 평가하는 것이었다: i) NO 생산 및 eNOS 인산화의 유도; ii) eNOS 인산화에서 AR의 관여; iii) 내피 세포 기능 및 혈관 형성의 조절을 연구하기 위한 잘 알려진 실험 모델인 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEcs)에서 PI3K/Akt 경로의 활성화(13).

자료 그리고 방법

화학 물질 그리고 시약.EcH (순도, 92.5 %)는 국립 식품 의약품 통제 연구소의 국가 약물 참조 표준으로부터 얻어졌다. p-Akt에 대한 항체 (Ser473; cat. no. ab8805), Akt (고양이. 아니오. ab81283), p-eNOS (Ser1177; cat. no. ab184154) 및 eNOS (cat. no. ab76198)을 Abcam으로부터 구입하였다. 닐루타미드 및 IcI 182780의 억제제는 시그마-알드리치로부터 수득되었다; 머크 KGaA. L-NAME은 Adamas-Beta, Ltd.에서 구입했으며 wortmannin은 Pribolab에서 구입했습니다.

세포 문화 그리고약물 치료.HUVEcs는 Sciencell Research Laboratories Inc.로부터 입수하고 내피 세포 배지에서 배양하였다 (EcM; Sciencell Research Laboratories) 5% (v/v) 태아 소 혈청 (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) 37°C(5% CO2 및 95% 습도)에서 1% 내피 세포 성장 보충제(ECGS)(14). 합류에 도달하자마자, 세포를 트립신으로 소화시키고, 1% FBS 및 1% EcGS로 EcM에 플레이팅하였다. 모든 경험-멘트에 대해, HUVEcs는 1x104/ml의 농도로 플레이팅되고 합류에 도달할 때까지 성장하였다. EcH 또는 다른 자극기로 처리하기 전에, 세포를 유도하기 위해 FBS 및 EcGS가 없는 페놀 적색이 없는 EcM에서 6시간 동안 인큐베이션하였다.

성장 정지. 억제 실험에서, HUVEcs는 37°C에서 10 μM 닐루타미드, 10 μM IcI 182780, 0.5 mM L-name 또는 5 μM 워트만닌을 포함하는 다양한 길항제 또는 억제제와 함께 30분 동안 예비인큐베이션하였다. 대조군을 포함한 모든 그룹에서, dMSO는 0.001%의 동등한 농도로 용매로서 사용되었다.

측정 세포내 생산 불능.

HUVEcs에서 세포질 NO 농도의 상대적 변화는 이전에 보고된 바와 같이 형광 NO 프로브 DAF-FM (케이맨 케미칼 컴퍼니)을 사용하여 모니터링되었다 (도 12). 간략하게, 세포를 흑색 마이크로타이터 플레이트에서 37°C에서 20분 동안 5 μM DAF-FM 디아세테이트로 로딩하고 PBS(pH 7.4)로 여러 번 헹구었다. 형광은 형광 마이크로플레이트 리더(Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) 및 콤팩트한 반전 현미경 (니콘 이클립스 Ts2R; 니콘 주식회사).

서쪽의 얼룩 분석.이전에 보고된 바와 같이(도 15), 세포의 합류 단층을 빙냉 PBS에서 두 번 세척하고 RIPA 완충액으로 용해시켰다(P0013d; Beyotime Institute of Biotechnology). 상청액 중의 단백질 농도는 비친코닌산 분석법(16)을 이용하여 측정하였다. 이어서, 레인당 30 μg의 단백질을 로딩하고, 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분리하고, 폴리비-닐리덴 디플루오라이드 막 상으로 옮겼다. 멤브레인은 25°C에서 1시간 동안 5% 탈지유로 차단되었다. 4°C에서 하룻밤 동안 Akt (1:1,000 희석), p-Akt (1:500 희석), eNOS (1:2,000 희석), 또는 p-eNOS (1:1,000 희석)에 대한 모노클로날 항체로 인큐베이션한 후, 멤브레인을 25°C에서 세척당 4회 TBST (0.1% Tween-20 함유)로 세척하였다. 이어서, 막을 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 이차 항체 (1:5,000 희석; 항-마우스 항체, cat. no)와 함께 인큐베이션하였다. A0216, 또는 항-토끼 항체, 고양이. 롤 A0208, Beyotime Institute of Biotechnology)를 25°C에서 1시간 동안 사용하고, 강화된 화학발광 키트(cat. no. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 검출하였다. 밴드 강도는 Image J 겔 분석 소프트웨어, 버전 1.8.0_112 (국립 보건원)를 사용하여 정량화되었다.

작다 방해 (si) RNA 준비 그리고 트랜스펙션.긴 이중 가닥 RNAs를 AR 및 에스트로겐 수용체(ER)의 표적 mRNA를 표 I에 나타낸 서열로 합성하였다. siRNA 녹다운에 대한 조건은 60mm 콜라겐 코팅 배양 접시에서 비항균 배양 배지에서 유지되는 70% 합류로 HUVECs를 형질감염시키는 것을 포함하였다. 5 nM AR-siRNA 또는 10 nM ERα-siRNA를 리포펙타민 3000 시약으로 형질감염 (인비트로젠; Thermo Fisher Scientific, Inc.) 제조업체의 프로토콜에 따라 별도로 수행되었습니다. 형질감염 효율-시언시는 이전에 보고된 바와 같이 역전사 정량적 PcR 분석 (RT-qPcR)에 의해 평가되었다 (도 17). 열순환 조건은 다음과 같았다: 95°C에서 10분; 5초 동안 95°C, 1분 동안 60°C의 40 사이클, 및 15초 동안 95°C에서 15초, 60°C에서 1분 동안 및 95°C에서 15초 동안 용융 곡선; 세 개의 인데펜-덴트 생물학적 반복실험이 각 샘플에 대해 수행되었다. 후속 실험은 형질감염 후 48 h를 수행하였다. 프라이머 쌍은 다음 서열을 갖는 프라이머 프리미어 v5.0 소프트웨어(PREMIER Biosoft)를 사용하여 설계되었다: AR 포워드, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' 및 역방향, 5'-GAcTTGTAGAGAGAcAGGGTAGA-3'; ERα 포워드, 5'-ccAGTAccA ATGAcA agg gaag-3' 및 역방향, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; 및 GAPdH 포워드, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' 및 역방향, 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

통계적인 분석.모든 데이터는 표준 편차의 평균± 표시됩니다. 그룹 간의 통계적 비교는 다중 비교를 위해 Kruskal-Wallis 테스트 또는 Tukey의 포스트 혹 테스트와 함께 양방향 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

결과

증권 시세 표시기 유도 아니요 생산 그리고 eNOSphosphorylation.도 2A 및 B에 나타난 바와 같이, 1 μM ECH는 음성 대조군과 비교하여 HUVEcs에서 세포내 NO 생성을 유의하게 증가시킨 반면, EcH의 자극 효과는 L-NAME으로 전처리함으로써 대조군 수준으로 감쇠되었다. 최적의 농도를 얻기 위해, eNOS 인산화를 농도에서 EcH로 처리한 후 60분에서 시험하였다.

의 0, 0.01, 0.1, 1 및 10 μM. 결과는 0.01-10 μM의 농도에서 EcH가 10 μM EcH 유도에서 관찰된 최대 eNOS 인산화와 함께 농도 의존적으로 Ser 1177에서 eNOS 인산화를 유의하게 유도할 수 있음을 밝혀냈다 (도 2c 및 d). 또한, Ser1177에서의 eNOS 인산화는 1 μM EcH로 인큐베이션한 후 0, 5, 15, 30, 60 및 120분에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 조사되었다. eNOS 인산화는 5분에서 EcH에 의해 빠르게 촉발되었고, 인큐베이션 30분까지 계속 증가하는 것을 관찰하였다(도 2E 및 F). 이어서, EcH 처리에도 불구하고, eNOS 포스-포릴화의 상대적 크기는 30분 이후부터 안정하게 유지되었다; 따라서, EcH는 총 eNOS 발현에 영향을 미치지 않았다(도 2c 및 E).

아칸소 중재 ECH-유도 아니요 생산 그리고 증권 시세 표시기AR-siRNA-1 및 ERα-siRNA-2의 간섭 효과는 본 연구에서 HUVEcs에서 AR 및 ER의 발현을 억제하는데 가장 성공적이었다(도 3). 이어서, AR 억제-의-기능 분석을 위한 길항제 및 AR 기능 상실 분석을 위한 siRNA를 적용하여, EcH-유도된 eNOS 활성화 및 NO 생산에서 AR의 관여를 평가하였다. 도 4A에 나타난 바와 같이, 1 μM ECH는 HUVEcs에서 NO 생산을 유의하게 증가시켰다 (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

증권 시세 표시기 활성화 이 PI3K/아크트 통로.본 연구에서, Ser473에서의 Akt 인산화는 0, 0.01, 0.1, 1 및 10 μM의 농도에서 EcH 인큐베이션 후 60분 동안 시험되었다. 결과는 EcH (0.01-10 μM)가 Akt 인산화를 의미 할 수 있음을 나타냈다. p-Akt의 상대적 발현 수준은 EcH 처리의 1 및 10 μM에서 피크화되었다(도 5A 및 B). 또한, Akt 인산화는 HUVEc 배양물에 1 μM EcH를 첨가한 후 0, 5, 15, 30, 60 및 120분에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 시험-인딩하였다. 도 5c 및 d에 나타난 바와 같이, EcH는 배양 5분 후에 Akt 포스포릴라-이온을 급격히 증가시켰고, 60분에서 p-Akt의 최대 단백질 수준이 관찰되었다. 대조적으로, EcH는 총 Akt 발현에 영향을 미치지 않았다(도 5A 및 c). 더욱이, eNOS 인산화에 대한 PI3K 경로의 잠재적 효과를 조사하기 위해, HUVEcs는 EcH 적용 전에 PI3K 억제제 워트마닌으로 전처리되었다. 워트만닌은 EcH 유도 NO 생산을 기준선 수준으로 감소시키는 것으로 밝혀졌다(도 5E). EcH 유도 DAF-FM 형광을 조사했을 때 형광 현미경을 사용하여 유사한 현상이 관찰되었다(도 5F). 더욱이, 워트마닌은 HUVEcs에서 신속한 eNOS 인산화를 폐지하는 능력을 가질 수 있다(도 5G 및 H). 앞서 언급한 결과는 EcH가 PI3K/Akt 경로를 통해 eNOS 인산화 및 NO 생산을 활성화시킬 수 있음을 시사한다.

토론

EcH는 허바에서 분리한 천연 화합물입니다.시스탄체, 다양한 약리학 적 특성을 가지고 있습니다. 이전에 EcH가 혈관 평활근 세포에서 NO-cGMP-PKG-BKca 채널을 열어 내피 의존성 혈관 이완 효과를 발휘한다는 것이 입증되었습니다 (7,8). 현재의 연구 결과는 ECH가 혈관 내피 세포에서 PI3K / Akt 신호 전달 경로의 관여로 NO 생산을 유도하기 위해 eNOS의 AR 의존성 활성화를 발휘했다는 증거를 제공합니다.

혈관벽의 최내층으로서, 내피는 혈류의 변화를 신속하게 감지하고 이에 대응할 수 있으며, 그 결과 혈관 톤을 조절하기 위해 하부 평활근 세포로의 신호 전달을 초래할 수 있다(18). 다수의 내피 유래 혈관 - 토리 화합물이 존재하며, 가장 원형 물질과 함께 널리 보고되었습니다.NO는 eNOS의 내피 이소형으로부터 형성되며, 이는 인산화를 초래합니다 (19). 정상적인 조건 하에서, eNOS는 카베올린에 결합할 때 비활성 상태로 유지되고, 내피에서 다음과 같은 일련의 사건들로 활성화된다.세포: i) eNOS는 카베올린-1로부터 해리되고 ca2+/caM과 연관된다; ii) 열 충격 단백질 (HSP)90은 eNOS를 촉진한다이량체화는 Akt를 모집하기 위해 입체 형성을 선호합니다. iii) 칼시뉴린은 Thr495를 탈인산화시켜 활성화 상태(20)를 강화시킨다. 본 연구에서, NO 생산은 1 μM ECH로 처리된 HUVECs에서 유의하게 증가하였다. 이 현상은 이전의 결과와 유사했으며, 여기서 EcH는 NO 방출을 증가시키고 래트 흉부 대동맥 고리에서 cGMP의 합성을 자극했다 (7). 더욱이, 두 개의 인산화-lation 부위인 Ser1177 및 Thr495는 eNOS 활성을 조절하는데 특히 중요한 것으로 보이며(20), 본 연구는 EcH가 농도 의존적으로 Ser1177에서 급성 eNOS 인산화를 유도한다는 것을 밝혀냈다. 또한, eNOS 단백질 수준에 대한 효과와 관련된 자극은 주로 eNOS mRNA 안정성을 결정하고, 자극이 더 오랜 기간 동안 유지되는 경우, eNOS mRNA 전사는 미토겐 활성화 단백질 키나제 및 핵 인자 κB를 통해 발생한다(20). 종합하면, 이들 관찰은 Ser1177에서 eNOS의 활성화가 EcH에 의해 유도된 NO 합성을 담당한다는 것을 나타낸다.

또한, 점점 더 많은 연구가 AR이 다수의 인간 조직에서 내피 세포에서 발현된다는 것을 입증했으며, 이는 인간 내피 세포 항상성의 조절에서 AR 매개 과정을 통해 작용하는 안드로겐 및 그 유사체에 대한 잠재적 인 역할을 시사한다 (21). 비고전적 PI3K/Akt 경로에서, AR은 PI3K 조절 서브유닛 p85α와 직접 상호작용함으로써 PI3K를 활성화시킬 수 있다(도 22). 본 연구는 AR 길항제 또는 AR siRNA가 HUVEcs에서 EcH에 의해 유도된 NO 생산 및 eNOS 인산화를 감소시킨다는 것을 입증하였다. 에스트로겐이 eNOS 인산화를 유도하고 내피 세포에서 고전적인 ER 활성화를 통해 NO 생산을 자극하고 (23), ECH의 투여는 자궁에서 ER의 expres-sion을 상당히 향상시킨다는 것이 이전에 보고되었다 (24). 그러나, 본 연구에서, AR의 효과는 EcH-유도된 eNOS 활성화 및 NO 생산에 대한 ERα의 효과와 비교하여 더 두드러졌다. 또한, EcH가 HUVEcs에서 AR 관련 eNOS 활성화를 통해 몇 분 내에 급성 NO 생성을 일으킨다는 것이 관찰되었으며, 이는 내피 세포에서의 반응의 비게놈 특성과 일치한다. AR은 세포질에서 HSP90, HSP70 및 Src 키나아제를 포함하는 스캐폴딩 단백질과 연관되며, 테스토스테론 처리 후 5분 이내에 AR 복합체로부터 막으로 수송될 수 있다(도 23). '표적 어업' 전략에 기초하여, HSP90은 PhGs 결합 표적으로서 확인되었으며, 이는 EcH가 스캐폴딩 단백질로부터 AR의 해리를 촉진할 수 있음을 나타냈다(도 25). 또 다른 연구에 따르면 시상 하부에서 EcH는 아미노산 Met-894 및 Val-713의 AR 포켓과 결합하여 세포질 AR이 핵으로의 전달을 억제 할 수 있다고 제안했습니다 (26). 그러나, EcH가 세포질 AR 막으로의 전좌를 매개하는 하부 거짓말 메커니즘은 추가적인 조사가 필요하다. 따라서, EcH가 AR 의존성 eNOS 활성화를 달성하는 메카니즘 및 그것이 혈관 내피 세포에서 HSP90에 결합하는 것과 어떻게 연관될 수 있는지를 밝히기 위해서는 추가적인 연구가 요구된다.

PI3K/Akt 경로는 가장 중요한 신호전달 캐스케이드 중 하나이며, 그 활성화는 Ser/Thr 키나제 Akt의 N 말단 플레크스트린 상동성 도메인에 결합하기 위해 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리스포스페이트를 생성함으로써 유도된다. 이것은 원형질막으로의 Akt 모집을 용이하게 한다(27). PI3K/Akt 경로는 EcH에 의해 유도되는 NO 의존성 이완의 제어에 중요한 역할을 할 수 있다.

본 연구는 세포가 PI3K 억제제 워트만닌과 함께 인큐베이션되었을 때 EcH 유도 NO 생산이 현저하게 감소한다는 것을 밝혀냈다. 이전 보고서는 15 mg / kg EcH가 5- 플루오로 우라실 억제 골수 세포에서 PI3K / Akt 신호 전달 경로를 활성화시켰다는 것을 입증했다 (28). 본 연구에서, PI3K 억제제는 Ser1177에서 EcH-유도된 eNOS 인산화를 유의하게 감소시켰다. 더욱이, Akt 활성은 상류 조절-토리 경로, 특히 Ser473에서의 PI3K 의존성 인산화에 의해 우세하게 조절되었다(도 20). 본 연구에서, EcH는 용량 의존적 방식으로 Ser473에서 Akt 포스-포릴화를 유도하였고; 마찬가지로, 이전 연구에 따르면 5, 10 또는 20 μM EcH는 잠재적으로 p-Akt 및 SLc8A3을 상향 조절함으로써 용량 의존적 인 방식으로 식욕 부진 / 재관류 치료에 대한 심장 보호 효과를 발휘했습니다 (29). Akt 유전자의 전사 조절은 크게 알려지지 않은 채로 남아 있습니다 (30); 따라서, 본 연구는 Akt에 대한 EcH의 전사 후 조절 효과에 초점을 맞추었다. 앞서 언급한 발견을 고려하여, HUVEcs에 EcH를 적용하면 eNOS를 인산화하고 이어서 NO 생산을 증가시키는 PI3K/Akt 경로의 활성화로 이어질 수 있다고 추론되었다.

결론적으로, EcH는 주로 허바에서 분리 된 천연 제품입니다.시스탄체.내피 세포에서 EcH-유도된 NO 생산의 기초가 되는 잠재적인 메카니즘은 다음을 포함할 수 있다(도 6): i) EcH는 세포막 내의 카베올라에 국소화되는 AR의 기능적 리간드로서 작용하고; ii) PI3K는 Ser473에서 Akt의 소수성 도메인에 결합하고 세포막으로의 Akt 모집을 용이하게 한다; iii) PI3K/Akt 캐스케이드의 모집은 AR 의존적 eNOS 인산화를 촉발시킨다; iv) NO의 생성은 내피 세포에서 eNOS에 의해 매개된다. EcH가 PI3K/Akt 경로의 관여와 함께 eNOS의 AR 의존적 인산화를 통해 NO 생산을 유도한다는 관찰은 EcH의 혈관 이완제 효과의 추가 미숙성에 기여할 수 있다. 더욱이, 내피 유래 NO 경로를 표적화하는 EcH는 비게놈 효과에 기인할 수 있다. 따라서 본 연구는 EcH가 심혈관 질환을 예방하기 위해 약리학 적 효과를 발휘하는 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

승인

해당 사항 없음.

자금

본 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81503333)의 지원을 받았다.

가용도 의 데이터 그리고 자료

본 연구 동안 생성되고 분석된 데이터 세트는 합리적인 요청에 따라 해당 저자로부터 입수가능하다.

저자' 기여

LG와 XL은 실험을 구상하고 설계했습니다. dL 및 YZ는 실험을 수행하였다. WZ와 JG는 데이터를 분석했다. LG는 원고 초안을 작성했다. XL은 manu- 스크립트를 검토하고 편집했습니다. 모든 저자는 최종 원고를 읽고 승인했습니다.

1202 GU동부 표준시 알: EcHINAcOSIdE INdUcES NITRIc OXIdE PROdUcTION BY AR-dEPENdENT PI3K/AKT PATHWAY

윤리학 시인 그리고 승낙 받는 사람 참여

해당 사항 없음.

환자 승낙 때문에 출판

해당 사항 없음.

경쟁 관심사

저자들은 그들이 경쟁하는 이익이 없다고 선언합니다.

참조

1. 중국 약전위원회 :시스탄체헤르바. 에서: 중국의 인민 반발의 약전 1. 턱. Med. Sci. Press, 베이징, pp 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X 및 Zhang X : Echinacoside 및시스탄체 튜불로사(셴크)R. wight는 생식선 축 조절된 스테로이드 생성 효소를 통해 쥐에서 비스페놀 A-유도된 고환 및 정자 손상을 개선한다. J Ethnopharmacol 193 : 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, dong Y, Zhang B 및 Ma X : Echinacoside, 신경 및 기타 장애 치료에서 추정 할 수없는 천연 제품. 분자 23: piiE1213, 2018.

4. 요시카와 M, 마쓰다 H, 모리카와 T, Xie H, 나카무라 S 및 무라오카 O : 페닐에타노이드 올리고 글리코 시드 및 혈관 이완제 활성을 가진 아실화 된 올리고당시스탄체 튜불로사. Bioorg Med chem 14 : 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, Mittal cK, Katsuki S 및 Murad F : 산화 질소는 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시키고 다양한 조직 제제에서 구아노신 3 ' : 5'- 순환 모노 포스페이트 수준을 증가시킵니다. Proc Natl Acad Sci USA 74 : 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wuren TN, Lu dX, Zhou Y 및 Ge RL : 저산소증하에 쥐 폐동맥 평활근 세포에 대한 에키나코 측의 항 증식 효과. J Pharmacol Sci 126 : 155-163, 2014.

7. 그는 WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ 및 Tu PF : Echinacoside는 NO-cGMP 경로를 통해 쥐 대동맥 고리에서 내피 의존성 이완을 유도합니다. 플란타 메드 75 : 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wuren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y 및 Ge RL : Echinacoside는 NO-cGMP-PKG-BKca 채널을 열고 세포 내 ca2 + 수준을 감소시킴으로써 쥐 폐동맥 혈관 이완을 유도합니다. Acta Pharmacol Sin 36 : 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y 및 Higashi Y : 내막 - 리움 독립적 혈관 확장의 평가 : 방법론에서 임상 적 관점에 이르기까지. J Hypertens 36 : 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, chen J, Khan FU, chen X, Xu J 및 산화 스트레스로 인한 손상에 대한 인간 탯줄 정맥 내피 세포의 유도체 : 항산화 및 PI3k / Akt / eNOS / NO 신호 전달 경로의 개입. Biomed Pharmacother 106 : 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y 및 Okabe T: Src 키나제-매개 안드로겐 수용체-의존성 비-내피 산화질소 합성 효소로 이어지는 신호전달 캐스케이드의 비게놈 활성화. Biochem Bioph Res commun 424 : 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y 및 Okabe T : 혈관 내피 세포에서 안드로겐 수용체 의존성 내막 산화 질소 합성 효소의 활성화 : 포스파티딜이노시톨 3- 키나아제 / Akt 경로의 역할. 내분비학 151 : 1822-1828, 2010.

13. 피타렐라 P, 스쿼잔티 dF, 몰리나리 c, 인버니지 M, 우버티 F 및 리노 F: HUVEc에서 비타민 D에 의해 유도되는 NO 의존성 증식 및 이동. J 스테로이드 생화학 149 : 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X 및 Xu X: 비결합 단백질 2의 과발현은 인간 탯줄 정맥 내피 세포의 고글루코스-유도된 아폽토시스를 억제한다. Int J Mol Med 37 : 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z 및 Bing S : Icarrain은 PI3K / AKT-eNOS 신호 전달 경로의 활성화와 관련된 호모시스테인 유도 내피 세포 노화를 지연시킵니다. 제약 비올 51 : 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ 및 Klenk dc: 비신코닌산을 이용한 단백질 측정. 항문 생화학 150 : 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H 및 Liu X : 침수 발효에서 산화 질소에 의해 유발 된 트리테르 페노이드 생합성 및 전사 반응영지버마 루시덤. 프로세스 Biochem 60 : 19-26, 2017.

18. Ellinsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY 및 Gutterman dd : Endothelium 유래 과분극 및 관상 동맥 혈관 확장 : 에폭시-이코사트리엔산, 과산화수소 및 갭 접합의 다양하고 통합 된 역할. 미세 순환 23 : 15-32, 2016.

19. 해방 된 JK와 Gutterman dd : 의사 소통이 핵심입니다 : 혈관 확장에서 세포 간 신호 전달 메커니즘. J 심혈관 제약 69 : 264-272, 2017.

20. Quillon A, Fromy B 및 debret R : 산화 질소 매개 혈관 확장으로 이어지는 Endothelium microenviron- ment 감지 : 신경 및 생체 역학 신호에 대한 검토. 산화 질소 45 : 20-26, 2015.

21. 토레스-에스테이 V, 카레노 dV, 프란시스코 IF, 소토마요르 P, 고도이 AS 및 스미스 GJ: 인간 내막-거짓말 세포의 안드로겐 수용체. J 엔도크리놀 224 : 131-137, 2015.

22. deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H 및 Gui YT : andro-gens의 비 게놈 작용은 안드로겐 수용체 밀매의 신속한 인산화 및 조절에 의해 매개된다. 세포 물리 생화학 43 : 223-236,2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP 및 Ghedini Pc: 에스트로겐 수용체에 의해 매개되는 PI3K/Akt 경로의 활성화는 cGMP 신호전달의 에스트론-유도된 혈관 활성화를 설명한다. 혈관 약전 110 : 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z 및 Li P : 난소 절제술 된 쥐에서 에키나코사이드의 항 골다공증 활성. 식물 의학 20 : 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y 및 Tu PF : 약리학적 표적 동정 및 페닐에타노이드 배당체의 효능 분석시스탄치'표적 낚시' 전략을 기반으로 한 허브라. 턱 트래딧 허브 약물 49 : 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM 및 Zhang X : Echinacoside는 시상 하부 안드로겐 수용체를 표적으로 삼아 쥐의 정자 양을 증가시킵니다. Sci Rep 8 : 3839-3850, 2018.

27. coffer PJ, Jin J 및 Woodgett JR: 단백질 키나아제 B (c-Akt): 포스파티딜이노시톨 3-키나제 액티-베이션의 다기능 매개체. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. 왕 S, 청 G, Tian S, 장 Y, 셴 L, 박 Y, 셴 Y 및 Qian J : 에키나코사이드는 5-FU 유도 골수 억제 마우스에서 조혈 기능을 향상시킵니다. 라이프 Sci 123 : 86-92, 2015.

29. 첸 M, 왕 X, 후 B, 저우 J, 왕 X, 웨이 W 및 저우 H : 상향 조절 p-AKT 및 SLc8A3을 통한 H9c2 세포의 식욕 부진 / 재관류 손상에 대한 에키나코사이드의 보호 효과. Biomed Pharmacother 104 : 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P와 Su Y : 심혈관 기능에서 Akt의 중요한 역할. 혈관 약전 74 : 38-48, 2015.