Cistanche Tubulosa는 원발성 및 전이성 인간 결장암 세포의 반응성 산소 종 매개 세포 사멸을 유도합니다

소개

대장암은 전 세계적으로 가장 흔한 암 중 하나입니다(Brenner외., 2014), 현대인의 식습관과 생활습관, 신체활동 감소로 인해 발생빈도가 지속적으로 증가하여 2035년 기준 240만 건으로 추산된다. 현재의 노력은 대장암의 유행병을 퇴치하기에 충분하지 않으므로 다음과 같은 보다 안전한 대체 개입과 함께 생활 방식의 변화를 포함한 효과적인 예방 및 치료를 위한 새로운 접근 방식이 필요합니다.식물치료제(Weidner외., 2015). 질병을 치료하기 위해 약용 식물을 사용하는 식물요법(Phytotherapy)은 고대 인류 역사에서 피할 수 없는 부분이었습니다. 약용 식물은 오랫동안 암의 대체 치료법으로 활용되어 왔으며, 이는 기존 의학에서 사용되는 항암제의 60% 이상을 차지합니다(Balunas and Kinghorn, 2005; Saibu외., 2015). 가장 잘 알려진 예로는 다음과 같은 추출물이 있습니다.카타란투스 로세우스G. 돈. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) 및 Camptotheca acumminate Decne (Nyssaceae) (Cragg and Newman, 2005; da Rocha외., 2001). 여러 가지 허브 추출물과 파이토케미컬은 활성산소종(ROS) 생성 유도 및 암세포 관련 세포자살 유도로 인해 대장암에 항종양 효과를 나타내는 것으로 나타났습니다.멜리사 오피시날리스(웨이드너외., 2015)

식물치료제 후보들 중에서,시스탄체 튜불로사아프리카, 아시아, 지중해 지역의 건조 및 반건조 지역에 널리 분포하는 Orobanchaceae 기생 사막 식물(Jiang et al., 2009)은 귀중한 약용 특성을 갖는 것으로 나타났습니다. Cistanche tubeulosa는 전통 의학에서 광범위하게 사용되어 왔으며 신장 결핍, 병적인 백혈구증, 자궁출혈, 여성 불임 및 노인성 변비에 치료 효과가 있는 것으로 제안되었습니다(Jiang et al., 2009). 전통적인 의약 용도 외에도 중요한 의약 Cistanche Tubulosa의 특성은 혈관 이완제(Yoshikawa et al., 2006), 간 보호제(Morikawa et al, 2010), 항고혈당 및 고지혈증 효과(Xiong et al., 2013)를 포함하여 지난 10년 동안 집중적으로 연구되었습니다. Cistanche Tubulosa는 또한 면역 체계의 강력한 강화제, 뼈 형성 촉진제, 노화 방지 및 피로 방지제로 제안되었습니다(Xu et al., 2014). 또한 Cistanche tubeulosa 추출물은 알츠하이머병 모델에서 아밀로이드 침착을 차단하는 것으로 나타났습니다(Wu et al., 2015). 다양한 치료 용도에도 불구하고 잠재적인 항암제로서의 Cistanche Tubulosa의 효과는 아직 연구되지 않았습니다.

현재 연구에서 우리는 2개의 원발성 및 2개의 전이성 결장암 세포주에 대한 Cistanche Tubulosa의 항암 효과와 이 효과의 기초가 되는 잠재적 메커니즘을 조사했습니다.

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재료 및 방법

식물 추출물의 수집 및 제조

Cistanche tubeulosa 샘플은 2014년 카타르의 사막 지역에서 수집되었으며 약초학자에 의해 식물의 진위가 확인되었습니다. 바우처 샘플은 ADLQ의 독성학 및 다목적 부서에 보관되어 있습니다. 햇볕에 건조된 식물 샘플을 Retsch Knife Mill Grindomix GM300을 사용하여 미세 분말로 분쇄했습니다. 20g의 분말을 200rpm의 회전식 진탕기에서 37도에서 하룻밤 동안 200mL의 초순수로 추출했습니다. 원유시스탄체 튜불로사 추출물(CTE)8000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 불용성 화합물을 펠렛화하고, 상층액을 수집하고 Labconco Freezone 6 plus 동결 건조기를 사용하여 동결 건조했습니다. 건조된 추출물을 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, SIGMA, Germany)에서 20mg/mL의 농도로 재구성하고 0.2-미크론 멤브레인 필터를 통해 멸균 여과했습니다.

세포주 및 세포 유지 관리

인간 결장암종 세포주 CaCo2, SW620 및 LoVo는 Cell Lines Service(CLS, Eppelheim, Germany)에서 얻은 반면 HCT 116 세포주는 카타르 대학교 생물 및 환경 과학부에서 기증했습니다. CaCo2와 HCT11은 대장암의 원발 부위에서 유래한 반면, SW620과 LoVo는 전이성 부위에서 유래했습니다. SW620, HCT116 및 LoVo 세포는 DME 배지에서 배양하고 유지하는 반면, CaCo2 세포는 Eagle's Minimal Essential Medium(EMEM, SIGMA, Germany)에서 유지했습니다. 세포를 5% 이산화탄소를 함유한 가습 환경에서 10% 소태아혈청(FBS, SIGMA, 독일)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(SIGMA, 독일)이 보충된 각각의 배지에서 37도에서 배양하여 단층으로 성장시켰다.

세포 생존력 분석

{{0}}[4,5-디메틸티아졸-2-yl]-2,5-디페닐테트라졸륨(MTT) 분석을 사용하여 다음의 세포독성 활성을 평가했습니다. CTE는 앞에서 설명한 것과 유사합니다(Jaganjac et al., 2010). 96-웰 플레이트에서 배양된 CaCo2, HCT116, SW620 및 LoVo 세포의 파종 밀도는 웰당 104개 세포였습니다. 처리 24시간 전에 세포를 10% FBS가 보충된 각각의 배지에 플레이팅하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고 세포에 0, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/mL의 CTE를 5% CO2를 함유한 가습 환경에서 37도에서 24, 48, 72시간 동안 처리하였다. CTE 처리 후 배지를 제거하고 MTT 용액(0.5mg/mL) 40μL를 각 웰에 첨가하였다.

3시간 동안 배양한 후 MTT 용액을 제거하고 formazan 생성물을 디메틸설폭사이드(DMSO, SIGMA, Germany)에 녹인 후 마이크로플레이트 리더기(Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Switzerland)를 사용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. .

세포 사멸 분석

CaCo2, HCT116, SW620 및 LoVo 세포의 세포사멸은 생체 염료(Becton)로 7-Amino-Actinomycin D(7-AAD)가 포함된 PE Annexin V 세포사멸 검출 키트 I을 사용하여 검출되었습니다. 제조사의 지시에 따라 벨기에 디킨슨 인터내셔널(Dickinson International)에 따라 제조됩니다. 간단히 말하면, CTE(0, 0.5 , 또는 1 mg/mL). 24 CTE 인큐베이션 후 세포를 수확하고 차가운 인산염 완충 식염수로 2회 세척한 후 피코에리트린(PE) Annexin V 및 7-AAD로 어두운 곳에서 실온에서 15분간 염색했습니다. 염색된 세포는 FACS를 사용한 유세포 분석법으로 1시간 이내에 분석되었습니다. Aria III 유세포 분석기 및 FACSDiva 소프트웨어(Becton Dickinson)는 최소 104개의 세포로 낮은 유속을 사용합니다. 6μM 캄프토테신(SIGMA)으로 4시간 동안 세포를 처리한 것이 분석의 양성 대조군으로 사용되었습니다.

세포내 ROS 생산

세포내 ROS 생산은 2,7- 디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA, SIGMA, 독일)를 사용하여 조사되었습니다. DCFH-DA는 세포내 ROS와 함께 형광 화합물 2인 7- 디클로로플루오레세인(DCF)으로 산화되는 비형광 프로브입니다(Poljak-Blazi et al., 2011). DCFH DA 분석은 이전에 설명한 것과 유사하게 수행되었습니다(Cindric et al, 2{26}}13; Poljak-Blazi et al., 2011). 간단히 말하면, 96-웰 블랙 플레이트에서 배양된 CaCo2, HCT116, SW620 및 LoVo 세포의 파종 밀도는 웰당 104개 세포였습니다. 세포를 10% FBS가 보충된 각각의 배지에 24시간 동안 플레이팅하였다. 처리 전에 세포를 5% CO2/95% 공기에서 37도에서 30분 동안 10μM DCFH-DA와 함께 배양했습니다. 그런 다음 세포를 세척하고 페놀 레드가 없는 배지에 포함된 0, 0.5 및 1 mg/mL의 CTE로 처리했습니다. 세포내 ROS 형성은 상부 형광 및 가스 제어 모듈(Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Switzerland)을 갖춘 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 37도 및 5% CO2에서 25시간 동안 지속적으로 모니터링되었습니다. 형광 강도는 500 nm의 여기 파장과 529 nm의 방출 검출로 측정되었습니다. 임의 단위인 상대 형광 단위(RFU)는 형광 강도에 직접적으로 기반을 두었습니다.

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미토콘드리아 과산화물 생성

미토콘드리아에 의한 과산화물 생성을 유도하는 CTE의 능력은 세포 투과성, 미토콘드리아 표적화 MitoSOX Red 프로브(Life Technologies) 및 핵 염색용 Hoechst 33342(Life Technologies)를 사용하여 추정되었습니다. CaCo2, HCT116, SW620 및 LoVo 세포를 10% FBS가 보충된 각 배지에서 웰당 104 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 24시간 동안 시딩했습니다. . 그런 다음 세포에 4μM의 MitoSOX와 2μM의 Hoechst 33342를 20분 동안 로딩하고, 과량의 염료를 세척한 다음, 웰을 37도 및 5% CO2에서 24시간 동안 0, 0.5, 1mg/mL의 CTE로 처리했습니다. 형광 강도는 최고 형광을 갖는 마이크로플레이트 판독기(Infinite 200 PRO, Tecan Trading)를 사용하여 MitoSOX의 경우 510 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 검출로, Hoechst 33342의 경우 350 nm의 여기 파장 및 461 nm의 방출 검출로 측정되었습니다. AG, 스위스)

통계 분석

기술 통계는 평균 +/- SD로 표시되었습니다. 그룹 간의 차이의 중요성은 Student t-test와 Chi-square test를 사용하여 평가되었습니다. 두 개 이상의 그룹을 비교할 때는 적절한 사후 테스트와 함께 단측 ANOVA를 사용했습니다. Mircosoft Windows용 SPSS 11.01을 사용했습니다. P가 0.05 미만인 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

인간 결장암 세포주의 증식에 대한 CTE의 효과는 그림 1에 나와 있습니다. 테스트된 모든 CTE 농도는 농도 및 시간 의존적 방식으로 CaCo2 세포주에 대한 강력한 억제 효과를 보여주었습니다(그림 1A). 72시간의 CTE 처리는 대조군에 비해 CaCo2 세포의 성장을 60% 이상 억제했습니다(모든 농도에서 p < 0.05). HCT116 세포 성장에 대한 CTE 처리의 중요한 영향은 두 가지 최고 농도(1mg/mL 및 2mg/mL)에서 항상 검출되었으며, 후자 농도에서는 70% 이상의 감소에 도달했습니다(그림 1B, p<0.05). 두 가지 더 낮은 CTE 농도(0.25 및 0.5mg/mL)는 24시간 후 세포의 HCT116 성장을 크게 감소시켰지만(p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). CTE를 이용한 시간 및 농도 의존적 ​​증식 억제는 LoVo 세포에서 최고 농도에서 60% 이상 추가로 확인되었습니다(p < 0.05)(그림 1C). 테스트된 4가지 CTE 농도 모두 48시간 후에 SW620 세포의 성장을 감소시켰습니다(그림 1D, 모두 p < 0.05). 72시간 처리 후에는 두 가지 최고 농도에서만 동일한 효과가 관찰되었으며(p < 0.05), 0.25 및 0.5 mg/mL 농도에서는 대조군과 비교하여 유의미한 효과가 나타나지 않았습니다(p > 0.05). 세포사멸 유도에 대한 0.5 및 1mg/mL CTE 처리의 영향을 4개 세포주 모두에서 추가로 테스트했습니다(그림 2). 0.5 mg/mL로 24-시간 처리한 후 HCT116 및 LoVo에서 초기 세포사멸의 세포 수가 증가한 것으로 나타났습니다(p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

그림 1:의 효과시스탄체 튜불로사대장암 세포주의 생존 가능성에 관한 것입니다. (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo 및 (D) SW620 세포의 MTT 분석으로 측정한 세포 생존율은 대조군의 치료되지 않은 결장암 세포주의 백분율로 표시됩니다. 대표 실험의 5회 반복에 대한 평균값(±SD)은 다음과 같습니다. (*) 유의성 p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

그림 2: Cistanche tubeulosa 물 추출물은 인간 결장암 세포에서 세포사멸을 유도합니다. (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo 및 (D) SW620 세포의 Annexin-V-FITC 유세포 분석은 대조군의 치료되지 않은 결장암 세포주의 백분율로 표시됩니다. 대표 실험의 3회 반복에 대한 평균값(±SD)은 다음과 같습니다. (*) 유의성 p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

그림 3: Cistanche tubeulosa 물 추출물은 시간 및 용량 의존적으로 세포 내 ROS 생성을 유도합니다. (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo 및 (D) SW620 세포에서 DCFH-DA 분석으로 측정한 ROS 생산은 각각의 5-복제본에 대한 평균 RFU 값(±SD)으로 표시됩니다. 대표적인 실험. (*) 의미 p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

그림 4: Cistanche tubeulosa 물 추출물은 인간 결장암 세포에서 미토콘드리아의 초과산화물 생성을 유도합니다. A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo 및 (D) SW620 세포에서 미토콘드리아 표적 MitoSOX Red 프로브의 형광 강도는 대조군의 치료되지 않은 결장암 세포주의 백분율로 표시됩니다. 대표 실험의 5회 반복에 대한 평균값(±SD)은 다음과 같습니다. (*) 유의성 p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

논의

이전 연구에서 Cistanche tubeulosa의 수많은 의학적 특성이 보고되었지만, 이는 악성 세포에서의 항증식 효과에 대한 첫 번째 보고입니다. 극성이 높은 용매인 물로 추출한 Cistanche tubeulosa 생리활성 화합물은 강력한 항암 생리활성을 나타냈습니다. 우리는 이전에 물에 용해된 Cistanche tubeulosa의 효율성을 메탄올 및 에틸 아세테이트와 같은 다른 용매와 비교했지만 물 추출물은 가장 유망한 항암 활성을 나타냈습니다(데이터는 표시되지 않음).

우리는 1mg/mL 및 2mg/mL의 CTE가 원발성 및 전이성 결장암 세포주의 성장을 60% 억제하는 능력을 입증했으며, 이는 잠재적으로 중요한 역할을 밝혔습니다.시스탄체 튜불로사대장암 치료제로. 정상 세포와 비교하여 암세포는 일반적으로 산화환원 항상성의 교란을 특징으로 하며 현재 항암 요법의 일반적인 전략은 세포 산화 스트레스를 증가시키는 것입니다(Yang et al, 2013). 생리학적으로 낮은 수준의 ROS가 신호 분자로서 중요한 역할을 하지만, 과도한 ROS 생산은 암 불안정성과 악성 종양에 기여할 수 있습니다(Liou and Storz, 2010). 역설적이게도 세포 산화환원 항상성의 이러한 불균형은 암세포를 ROS로 인한 세포 사멸에 더욱 취약하게 만듭니다(Jaganjac et al., 2008; Nogueira and Hay, 2013). 본 연구에서 보고된 CTE의 항증식 효과는 세포사멸에 필수적인 역할을 하는 다중 경로를 표적으로 하는 추출물 내의 알려지거나 알려지지 않은 화합물의 다양한 세포외 및 세포내 메커니즘에 의해 매개될 수 있습니다. 다양한 세포 사멸 방식을 구별하기 위해 우리는 관찰된 CTE 유발 세포 독성을 담당하는 잠재적인 메커니즘을 조사했습니다.

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우리의 데이터는 CTE가 세포 내 ROS 생산을 증가시키고 결과적으로 ROS에 의한 세포 사멸을 증가시킨다는 것을 나타냅니다. 세포의 산화환원 상태는 또한 세포사멸을 조절하는 데 중요한 역할을 하며 미토콘드리아 전자 전달 사슬은 세포 ROS 생성의 주요 부위 중 하나입니다(Trachootham et al., 2008). 더욱이, 세포내 ROS는 미토콘드리아 의존적 및 독립적 경로를 통해 세포 사멸을 유발할 수 있습니다(Sinha et al., 2013). 실제로, 우리의 데이터는 또한 CTE에 의해 유발된 포스파티딜세린 외부화가 원발성 암세포와 전이성 암 세포주 모두에서 세포사멸에 공통적으로 나타나는 효과임을 나타내며, 이는 CTE에 의해 유발된 사망의 메커니즘이 괴사가 아닌 세포사멸에 의해 매개됨을 시사합니다. 암세포에서 세포사멸의 활성화는 교정 전략이며 많은 항암제가 암세포에서 세포사멸 효과를 발휘할 수 있습니다.

따라서 암세포에서 세포사멸 촉진 활성을 갖는 화합물 또는 추출물은 항암제 연구에 잠재적으로 유용합니다(Wong, 2011). CTE에 의해 유발된 세포사멸 촉진 효과가 미토콘드리아에 의해 유발된 ROS 메커니즘에 의해 매개되는지 여부를 확인하기 위해 CTE 처리된 세포에서 미토콘드리아 표적 형광 프로브를 사용하여 초산화물 생산을 측정했습니다. 우리의 데이터는 CTE가 미토콘드리아의 과산화물 생성을 자극한다는 것을 분명히 보여 주며, 이는 Cistanche tubeulosa 항암 활성이 적어도 부분적으로 미토콘드리아 유발 ROS 메커니즘을 통해 매개됨을 암시합니다.

결론

결론적으로, 우리의 데이터는 사막 식물 Cistanche tubeulosa의 물 추출물이 대장암 예방 및 치료를 위한 다른 기존 치료법과 결합된 항암 접근 방식의 유망한 후보가 될 수 있음을 시사합니다. 우리는 또한 암세포에 대한 식물 추출물의 독성이 세포 내 ROS 생성 증가와 적어도 부분적으로 미토콘드리아 의존성 세포사멸에 의해 매개된다는 것을 입증했습니다. 항암 활동을 담당하는 개별 생물학적 활성 성분을 분리하고 특성화하기 위한 추가 연구가 진행 중입니다.

효과적인 화학 예방제로서 이 추출물의 잠재적인 사용을 평가하고 분자 수준에서 결장암 세포에 대한 작용 메커니즘을 이해하려면 더 많은 연구가 필요합니다. 관찰된 유익한 건강 효과를 확인하기 위해서는 추가적인 전임상 및 임상 연구가 필요합니다.암 예방을 위한 Cistanche tubeulosa.

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