Cistanche Tubulosa Phenylethanoid 배당체는 외인성 및 내인성 신호 경로를 통해 H22 간세포 암종 세포에서 세포 사멸을 유도합니다

배경

간암은 전 세계적으로 암 발병률에서 6위, 암 사망에서 4위를 차지했습니다. 또한, 사회인구통계학적 지수가 낮은 국가에서는 암 발생률 4위, 암 사망률 1위를 기록했습니다[1]. 중국에서는 2015년 간암이 암 관련 사망 원인 3위를 차지했습니다[2]. 전 세계적으로 원발성 간암의 90% 이상이 간세포암종(HCC)입니다[3]. 현재 간세포암종 치료의 주요 선택지는 간절제술이다. 그러나 간세포암종 환자의 30% 미만이 근치적 간절제 기준을 만족하였고, 높은 재발률로 인해 전체 5-년 생존율은 여전히 ​​35-50% 정도로 낮다[4, 5] . 중급~진행성 간세포암종 환자에 대한 치료 옵션의 이용 가능성은 매우 제한적입니다. 분자 표적 약물인 소라페닙(Sorafenib)이 진행성 간세포암종의 1차 치료제로 FDA의 승인을 받았습니다. 그러나 소라페닙은 생존기간을 3개월 정도 연장하는데 그치고 반응률은 4% 미만이다[6, 7]. 간세포암종에 대한 신약이나 전략 개발이 시급합니다.

한의학(TCM)은 단독으로 또는 다른 전략과 결합하여 HCC 치료에 사용되어 왔으며 생존 기간 연장, 삶의 질 향상, 부작용 감소 등의 임상적 이점을 보여주었습니다[8, 9]. 한의학의 일종인 시스탄체(Cistanche)는 항산화, 항염증, 항노화, 신경보호 등 다양한 생물학적 기능을 갖고 있다[10, 11]. 페닐에타노이드 배당체는 항산화, 항염증, 간 보호 및 신경 보호 등 다양한 활성을 갖는 Cistanche의 주요 활성 성분으로 간주되어 왔습니다 [12-15]. 우리 그룹은 다음과 같이 보고했습니다.Cistanche tubeulosa phenylethanoid 배당체(CTPG)흑색종 B16-F10 세포에서 세포사멸을 유도하고 생쥐의 종양 성장을 억제할 수 있습니다[16]. 이 연구에서 우리는 시험관 내 및 생체 내에서 HCC H22 세포에 대한 CTPG의 항종양 효과를 측정하고 그 메커니즘을 조사했습니다. 우리는 CTPG가 외인성 및 내인성 신호 전달 경로를 통해 H22 세포에서 세포 사멸을 유도하고 생쥐에서 H22 종양의 성장을 억제한다는 것을 발견했습니다.

성기능 개선을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

행동 양식

세포주

마우스 H22 간세포 암종 세포는 신장 대학 (중국 신장 우루무치) 생물 자원 및 유전 공학의 신장 핵심 연구소에서 얻은 후 100 U / ml 페니실린과 100 ug / ml가 보충 된 RPMI 1640 배지 (Gibco)에서 배양되었습니다. 5% CO2의 가습된 대기에서 37도에서 스트렙토마이신 및 10% 열 불활성 소 태아 혈청(Gibco).

MTT 분석

CTPG는 Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.(Hetian, Xinjiang, China)에서 구입했으며 CTPG의 주요 화합물은 고성능 액체 크로마토그래피로 검증 및 정량화되었습니다[16]. 세포 생존율은 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-yl)-2, 5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)(Sigma, St. Louis, MO)로 평가했습니다. , USA) 분석. H22 세포를 웰당 100 ul 배지에 2 x 104 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고 37도에서 배양했습니다. 24시간 후, 세포를 다양한 농도의 CTPG(0, 100, 200, 300 및 400 ug/ml) 또는 0.3% DMSO(400 ug/ml CTPG와 동일)로 24, 48 및 72시간 동안 처리했습니다. 각기. 1000 rpm에서 7분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 MTT 용액(5 mg/ml in PBS) 100 ul를 각 웰에 첨가했습니다. 플레이트를 37도에서 4시간 동안 배양하고 DMSO 100ul를 첨가하여 형성된 포르마잔 결정을 용해시켰습니다. OD490 값은 96-웰 마이크로플레이트 판독기(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)에 의해 검출되었습니다. 세포 생존율은 다음 공식에 따라 계산되었습니다: 세포 생존율(%) =(OD처리/OD미처리) × 100%.

세포사멸의 검출

H22 세포를 다양한 농도의 CTPG(0, 100, 200, 300 및 400 ug/ml) 또는 0.3% DMSO로 24시간 동안 처리한 후 Annexin VFITC/Propidium으로 염색했습니다. 제조업체의 지침에 따라 요오드화물(PI) 세포사멸 검출 키트(YEASEN, 중국). 샘플을 유세포 분석법(BD FACSCalibur, USA)으로 분석했습니다.

미토콘드리아 막 전위 검출

H22 세포를 다양한 농도의 CTPG(0, 200 및 400 ug/ml)로 24시간 동안 처리한 후 막투과성 JC-1 염료(Beyotime, China)로 20시간 염색했습니다. 37도에서 최소. JC-1 완충액으로 2회 세척한 후 샘플을 300ul의 JC-1 완충액으로 재현탁하고 유세포 분석기(BD FACSCalibur, USA)로 분석했습니다.

세포주기 분석

H22 세포를 60 mm 배양 접시에 접종하고 다양한 농도의 CTPG(0, 100, 200, 300 및 400 ug/ml) 또는 0.3% DMSO로 처리했습니다. 24시간 동안. 모든 세포를 수집하고 PBS로 두 번 세척했습니다. 세포를 -20도에서 2시간 동안 70% 얼음처럼 차가운 에탄올에 고정하고 PBS로 두 번 세척한 다음 300ul Propidium iodide/RNase 염색 완충액(BD Biosciences)에 재현탁했습니다. 실온에서 10분 후, 유세포 분석기(BD FACSCalibur, USA)로 샘플을 수집하고 ModFit LT 3.0 소프트웨어를 사용하여 세포 주기 분포를 분석했습니다.

Hoechst 33,258 염색

H22 세포 핵의 형태학적 변화는 막 투과성 DNA 결합 염료 Hoechst 33,258 염색을 통해 분석되었습니다. H22 세포를 2 ml 배지에 1 x 105 세포/웰의 농도로 6-웰 플레이트에 접종했습니다. 60%~70% 합류 후 세포를 CTPG(0, 100, 200, 300 및 400 ug/ml)로 24시간 동안 처리했습니다. 세포를 수집하고 4% 얼음처럼 차가운 파라포름알데히드로 4도에서 10분간 고정했습니다. PBS로 세척한 후 Hoechst 33,258(Beyotime, China)로 4도에서 10분간 염색하였다. 샘플은 역형광현미경(Nikon Eclipse Ti-E, Japan)으로 관찰하였다.

웨스턴 블롯

Anti-caspase-3, anti-cleaved caspase-3, Anti-Bcl-2 및 antiBax는 Beyotime Biotech Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. 항-카스파제-7, 항-절단-카스파제-7, 항-카스파제-8, 항-절단-카스파제-8, 항-카스파제-9, 항 -cleaved-caspase-9, anti-PARP, anti-cleaved PARP, anti-mouse IgG-HRP 및 anti-rabbit IgG-HRP는 Cell Signaling Technology에서 구입했습니다. 항- -액틴은 Beijing ComWin Biotech Co., Ltd.(중국 베이징)에서 구입했습니다.

H22 세포를 다양한 농도의 CTPG(0, 100, 200, 300 및 400 ug/ml) 또는 0.3% DMSO로 24시간 동안 처리했습니다. 세포를 수집하고 Cell Lysis Solution RIPA(Beijing ComWin Biotech Co., Ltd)를 사용하여 얼음 위에서 30분간 용해했습니다. 샘플을 스핀다운(4도에서 15분 동안 12,{11}}g)하여 상등액을 수집하고 단백질 농도를 BCA Kit(Thermo Fisher Scientific, USA)로 측정했습니다. 각 샘플에서 동일한 양의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 멤브레인(Biosharp, China)으로 옮겼습니다. 5% 무지방 우유를 함유한 TBST 완충액으로 차단한 후, 막을 각각 상응하는 1차 항체 및 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 접합된 2차 항체와 함께 배양했습니다. TBST로 세척한 후 ECL 분석 키트(Beyotime, China)를 이용하여 목적 단백질을 검출하였다.

동물 및 윤리 선언문

6-8주된 수컷 Kunming 생쥐를 Xinjiang Medical University의 Animal Laboratory Center(Urumqi, Xinjiang, China)에서 구입했습니다. 생쥐는 Xinjiang University의 표준 온도 조절, 광 순환 동물 시설에 보관되었습니다. 모든 동물 연구는 신장 대학교 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 신장 대학 신장 생물 자원 및 유전 공학 핵심 연구소(BRGE-AE001)의 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

종양 마우스 연구

종양 마우스 모델의 유도를 위해, 수컷 Kunming 마우스의 오른쪽 옆구리에 100 ul PBS 중 1 x 106 H22 세포를 피하 주사했습니다. 3일 후, 마우스를 무작위로 3개 그룹(그룹당 7마리 마우스)으로 나누었습니다. 대조군에는 종양 주위에 0.1ml의 DMSO를 피하 주사하였다. CTPG-200 및 CTPG-400 그룹에 0.1ml DMSO 중 200 또는 400mg/kg CTPG를 종양 주위에 피하 주사했습니다. 마우스는 최대 21일 동안 2일마다 치료를 받았습니다. 종양 크기는 최대 25일 동안 캘리퍼를 사용하여 측정하였고 종양 부피는 다음 공식에 따라 계산했습니다: 종양 부피(mm3)=(길이×너비2)/2. 25일 후, 본 연구가 끝날 때까지 종양 쥐의 생존을 매일 모니터링했습니다.

통계 분석

통계적 유의성은 치료군과 대조군 간의 일원 분산 분석을 통해 계산되었습니다. 모든 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표현되었습니다. p < 0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다.

결과

CTPG는 시험관 내에서 H22 세포의 생존력을 감소시켰습니다

HCC에 대한 CTPG의 항종양 효과를 조사하기 위해, H22 세포를 시험관 내에서 다양한 농도의 CTPG(0, 100, 200, 300 및 400 ug/ml)로 처리했습니다. 24시간 후, H22 세포의 형태를 도립현미경을 사용하여 관찰하였다. 우리는 H22 세포의 형태가 CTPG 처리에 의해 극적으로 변화되었음을 발견했습니다. CTPG 농도가 증가함에 따라 세포는 작고 둥글게 변했으며 세포 수도 크게 감소했습니다(그림 1a). MTT 분석을 사용하여 각각 24시간, 48시간 및 72시간 동안 CTPG 처리 후 H22 세포의 생존성을 분석했습니다. CTPG는 용량 의존적 및 시간 의존적 방식으로 H22 세포 생존력을 크게 감소시켰습니다(그림 1b). 300ug/ml의 CTPG는 최고의 억제율에 도달했습니다(그림 1c). H22 세포에 대한 CTPG의 IC50 값은 24시간에 236ug/ml, 48시간에 169.8ug/ml입니다.

기억력 향상을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

CTPG는 H22 세포에서 세포사멸을 유도했습니다.

H22 세포의 생존력 감소가 세포사멸 유도에 의해 매개되는지 조사하기 위해 H22 세포를 다양한 농도의 CTPG(0, 100, 200, 300 및 400 ug/ml)로 24시간 동안 처리하고 염색했습니다. PI 및 Annexin V. 유동 세포 계측법 결과는 CTPG가 용량 의존적 방식으로 H22 세포의 세포 사멸 (초기 및 후기 세포 사멸 포함)을 유의하게 유도한다는 것을 보여주었습니다 (그림 2a). 고용량의 CTPG도 H22 세포의 괴사를 유의하게 증가시켰지만, 괴사는 세포사멸의 비율(52.6%)에 비해 낮은 비율(8.3%)로 인해 H22 세포 성장 억제에 미미한 역할을 합니다. 또한, CTPG 처리 후 H22 세포의 전체 단백질이 분리되었으며, 항아포토시스성 B 세포 림프종 2(Bcl{20}}) 및 프로아포토시스성 BCL-2-관련 X 단백질(Bax)의 발현이 Western에 의해 검출되었습니다. 얼룩. 그레이스케일 스캐닝 데이터는 Bax와 Bcl-2의 발현 수준이 각각 증가하고 감소한 것을 보여주었습니다. Bax/Bcl-2 비율이 크게 증가했습니다(그림 2b). 이러한 결과는 CTPG가 H22 세포에서 세포사멸을 유도한다는 것을 시사합니다.

CTPG는 H22 세포에서 염색체 응축 및 세포주기 정지를 유도합니다

약물에 의해 유발된 DNA 손상 및 세포주기 정지는 종양 세포 성장을 억제하고 종양 세포에서 세포사멸을 일으킬 수 있다고 보고되었습니다[17, 18]. 24시간 동안 CTPG 처리 후 H22 세포에서 핵의 형태를 검출하기 위해 H22 세포를 Hoechst 33,342로 염색하고 역형광 현미경을 사용하여 관찰했습니다. CTPG 처리된 세포는 핵의 밝게 응축된 염색질의 용량 의존적 증가를 보인 반면, 처리되지 않은 세포는 균질하게 염색된 핵을 보여주었습니다(그림 3a). H22 세포의 세포주기 분포는 이후 PI 염색으로 추가 분석되었습니다.CTPG 치료24시간 동안. 그림 3b에서 볼 수 있듯이 CTPG 처리는 G0/G1- 및 G2/M 상 세포의 비율을 크게 증가시키고 S 상 세포의 비율을 크게 감소시켜 CTPG가 G를 유도함을 시사합니다. H22 셀에서 0/G1 및 G2/Mphase 정지. 고용량 CTPG는 또한 sub-G1 세포의 비율을 크게 증가시켰습니다.

CTPG는 미토콘드리아 막 전위를 감소시키고 시토크롬 c의 방출을 증가시켰습니다.

미토콘드리아 의존 경로는 세포사멸 유도에 중요한 역할을 합니다[19, 20]. 미토콘드리아 막 전위(Δψm)의 변화는 JC-1 염색으로 모니터링할 수 있습니다. 왜냐하면 JC-1 응집체(적색 형광)가 Δψm의 감소로 단량체(녹색 형광)로 분해될 수 있기 때문입니다[21]. 24시간 동안 CTPG 처리 후, H22 세포는 JC- 1 염료로 염색되었습니다. 유세포 분석 데이터에 따르면 CTPG 처리 시 FL-2 채널의 적색 형광과 FL{10}} 채널의 녹색 형광이 크게 감소하고 증가하는 것으로 나타났습니다. PE-FITC+ 세포의 비율은 상당히 증가했으며(그림 4a), 이는 CTPG가 H22 세포에서 Δψm을 감소시켰음을 시사합니다. 이는 Bax/Bcl-2 비율이 증가한 것과 일치합니다. 결과적으로 우리는 CTPG 처리시 시토크롬 c의 방출이 유의하게 증가하는 것을 관찰했습니다 (그림 4b). 이러한 결과는 CTPG가 미토콘드리아 의존성(내인성) 경로를 통해 H22 세포에서 세포사멸을 부분적으로 유도할 수 있음을 나타냅니다.

CTPG는 카스파제 경로를 활성화하고 DNA 복구를 방지했습니다.

다음으로, 외인성 및 내인성 신호 전달 경로를 통해 CTPG에 의해 유도된 카스파제의 활성화를 분석했습니다. 24시간 동안 CTPG 처리 후, 전체 단백질이 H22 세포로부터 분리되었고 프로카스파제와 절단카스파제의 수준이 웨스턴 블롯에 의해 검출되었습니다. 처리되지 않은 또는 DMSO 대조군과 비교하여, CTPG 처리는 절단된 카스파제-8(외인성 경로)의 수준뿐만 아니라 절단된 카스파제-9(내인성 경로)의 수준도 상당히 상향조절했습니다(그림 2). 5). 순차적으로 활성화된 카스파제-8와 -9는 그림 5에서 관찰된 다운스트림 pro-caspase-3와 -7를 절단했습니다. 활성화된 카스파제-3는 DNA를 절단했습니다. 그림 3a에서 관찰된 바와 같이 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP)의 복구 효소는 DNA 복구를 방지하고 DNA 손상을 축적합니다.

이러한 결과는 CTPG가 외인성 및 내인성 신호 전달 경로 모두를 통해 H22 세포에서 세포 사멸을 유도했음을 나타냅니다.

CTPG는 생체 내에서 H22 HCC의 성장을 억제하고 종양 생쥐의 생존율을 향상시킵니다

마지막으로, HCC에 대한 CTPG의 항종양 효과는 종양 마우스 모델에서 평가되었으며, 이는 H22 세포의 피하 주사에 의해 확립되었습니다. H22 세포 주입 3일 후, 종양 마우스에 CTPG를 8회 처리하였다. 지정된 시점에서 마우스의 체중과 종양 크기를 모니터링했습니다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 각 그룹의 마우스 체중은 유의미한 차이가 없었으며, 이는 선택된 CTPG 용량이 뚜렷한 부작용이 없음을 시사합니다.

흥미롭게도, 200 mg/kg과 400 mg/kg의 CTPG로 처리한 쥐의 종양 성장은 크게 억제되었습니다(그림 6b). 더욱이, 2회 용량의 CTPG 처리는 실험 종료 시 대조군(0/7)에 비해 종양 마우스(3/7, 3/7)의 생존을 크게 향상시켰다(도 6b). 우리는 또한 CTPG가 수컷 Kunming 생쥐에서 분리된 비장 ​​세포의 증식을 용량 의존적 방식으로 유의하게 향상시키는 것을 발견했으며(그림 6c), 이는 CTPG가 면역 자극 효과가 있음을 시사합니다.

성기능 개선을 위한 최고 품질의 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

논의

한의학은 오랜 역사 동안 암을 비롯한 다양한 질병을 치료하는 데 사용되어 왔습니다. TCM은 외인성(사멸 수용체 매개) 및 내인성(미토콘드리아 의존성) 신호 전달 경로를 통해 다양한 유형의 종양 세포에서 세포사멸을 유도하여 항종양 효과를 발휘할 수 있다고 보고되었습니다[22-25]. 두 경로는 각각 caspase-8와 -9를 활성화할 수 있습니다[24, 26]. 여기에서 우리는 CTPG가 세포 사멸 및 세포주기 정지 유도를 통해 H22 세포 성장을 유의하게 억제한다는 것을 발견했습니다. 절단된 카스파제-8 및 -9의 수준은 다음에 의해 크게 상향 조절되었습니다.CTPG 치료, 이는 외인성 및 내인성 신호 전달 경로가 모두 세포 사멸 유도에 관여 함을 시사합니다. 우리의 이전 연구에서는 CTPG가 절단된 카스파제-9 수준을 증가시키지만 카스파제-8 수준을 증가시키지 않는 미토콘드리아 의존 경로를 통해 흑색종 B16-F10 세포에서 세포사멸을 유도한다는 것을 보여주었습니다[16]. CTPG는 다양한 유형의 종양 세포에서 뚜렷한 신호 전달 경로를 활성화할 수 있습니다.

미토콘드리아 막 완전성은 Bax 및 Bcl-2 [27, 28]을 포함한 BCL{0}} 단백질 계열 구성원에 의해 엄격하게 규제됩니다. Bcl-2에 대한 Bax의 비율은 미토콘드리아 의존성 세포사멸 경로에서 중요한 역할을 합니다[29]. CTPG로 처리된 H22 세포에서 Bax/Bcl-2 비율은 상당히 상향 조절되었으며, 이는 이 연구에서 관찰된 Δψm의 감소와 시토크롬 c의 방출을 유발할 수 있습니다. 결과적으로, pro-caspase-9가 절단되고 활성화되었습니다. 마지막으로 활성 카스파제-8 및 -9의 개시자는 카스파제 실행자-3를 활성화하여 DNA 복구를 방지하기 위해 PARP를 절단합니다. 종합적으로 말하자면, 이러한 결과는 CTPG가 외인성 및 내인성 신호 전달 경로 모두를 통해 H22 세포에서 세포 사멸을 유도했음을 시사합니다.

종양 마우스 모델에서 CTPG는 H22 HCC의 성장을 크게 억제하고 종양 마우스의 생존을 크게 향상시켰습니다. 흥미롭게도, CTPG는 용량 의존적으로 Kunming 생쥐의 비장세포 증식을 촉진했는데, 이는 이전 연구와 일치합니다[16]. 이러한 결과는 CTPG가 직접적인 항종양 효과와 간접적인 면역 강화를 통해 생쥐에서 H22 HCC의 성장을 억제할 수 있음을 시사합니다.

결론

CTPG는 시험관 내 및 생체 내에서 H22 세포의 성장을 억제하고 외인성 및 내인성 신호 전달 경로를 통해 H22 세포의 세포 사멸을 유도했습니다. 이러한 데이터는 CTPG가 HCC 치료의 잠재적 후보가 될 수 있음을 나타냅니다.