Cistanche Tubulosa 페닐에타노이드 배당체는 외부 및 내부 신호 경로를 통해 H22 간세포 암종 세포에서 세포자멸사를 유도합니다

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li 및 Jinyao Li

추상적인

배경:시스탄체 튜불로사(Schenk) R. Wight는 Tamarix 식물의 뿌리에 기생하는 중국 전통 의학이며 남성의 발기 부전, 불임, 신체 약화 및 강장제로 사용되었습니다. 그러나 간세포 암종에 대한 항종양 효과는 여전히 애매하다. 여기에서 우리는 항종양 효과를 조사했습니다.C. 튜불로사 페닐에타노이드 배당체(CTPG) 시험관 내 및 생체 내 모두에서 H22 간세포 암종 세포 및 그 메커니즘. 방법: H22 세포의 형태, 생존력, 세포자멸사, 세포주기 및 미토콘드리아 막전위(Δψm)를 도립현미경, MTT assay 및 유세포분석기로 각각 분석하였다. 세포 사멸 경로에서 단백질의 발현과 활성화는 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다. 생체 내 항종양 효과는 수컷 Kunming 마우스를 사용하여 확립된 종양 마우스 모델에서 평가되었습니다. 결과: CTPG 처리는 용량 및 시간 의존적으로 H22 세포 성장을 유의하게 억제했으며, 이는 G{5}}/G1 및 G2/M 단계에서 증가된 세포자멸사 및 세포 주기 정지와 상관관계가 있었습니다. 또한, CTPG 처리된 H22 세포에서 염색체 응축이 관찰되었다. CTPG 처리는 Bax/Bcl{10}} 비율을 유의하게 증가시키고 Δψm을 감소시키며 사이토크롬 c의 방출을 향상시켰습니다. 외부 및 내부 신호 전달 경로 모두에서 절단된 caspase{11}} 및 caspase{12}} 수준이 크게 증가하여 PARP를 절단하기 위해 caspase{13}} 및 -3를 순차적으로 활성화했습니다. 마지막으로 CTPG(시스탄체세뇨관페닐에타노이드 배당체) 생쥐에서 H22 세포의 성장을 억제하고 종양 생쥐의 생존율을 향상시켰습니다. 결론: 이러한 결과는 CTPG가 외인성 및 내인성 세포사멸 경로를 통해 H22 세포 성장을 억제함을 시사한다.

배경

간암은 전 세계적으로 암 발병률 6위, 암 사망 4위를 차지했습니다. 또한 사회인구학적 지수가 낮은 국가에서는 암 발병률 4위, 암 사망률 1위를 기록했습니다. 중국에서 간암은 2015년 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인입니다[2]. 전 세계적으로 원발성 간암의 90% 이상이 간세포암종(HCC)입니다[3]. 현재 간 절제술은 간세포암종 치료의 주요 옵션입니다. 그러나 간세포암종 환자의 30% 미만이 간경화 절제술의 기준을 충족했으며 전체 5-년 생존율은 높은 재발률로 인해 여전히 35-50%만큼 낮습니다[4, 5 ]. 중등도에서 진행된 간세포암종 환자를 위한 치료 옵션의 이용 가능성은 매우 제한적입니다. 분자 표적 약물인 소라페닙은 진행성 간세포암종의 1차 치료제로 FDA의 승인을 받았습니다. 그러나 소라페닙은 약 3개월의 생존기간만 연장하고 반응률은 4% 미만이다[6, 7]. HCC에 대한 새로운 약물이나 전략을 개발하는 것이 시급합니다. 한의학(TCM) 단독 또는 다른 전략과 결합하여 간세포암종 치료에 사용되어 왔으며 생존 시간 연장, 삶의 질 향상, 부작용 감소 등의 임상적 이점을 보여주었습니다[8, 9].시스탄체, TCM의 일종으로 다음과 같은 다양한 생물학적 기능을 가지고 있습니다.항산화, 항염, 노화방지,및 신경 보호 [10, 11]. 페닐에타노이드 배당체는 주요 활성 성분으로 간주되어 왔습니다.시스탄체, 항산화, 항염, 간보호, 신경보호 등 다양한 활성을 가지고 있다[12-15]. 우리 그룹은 다음과 같이 보고했습니다.Cistanche tubulosa 페닐에타노이드 배당체(CTPG)는 흑색종 B{0}}F10 세포에서 세포자멸사를 유도하고 마우스에서 종양의 성장을 억제할 수 있습니다[16]. 이 연구에서 우리는 시험관 내 및 생체 내에서 HCC H22 세포에 대한 CTPG의 항종양 효과를 측정하고 그 메커니즘을 조사했습니다. 우리는 CTPG가 외부 및 내부 신호 전달 경로를 통해 H22 세포에서 세포 사멸을 유도하고 마우스에서 H22 종양의 성장을 억제한다는 것을 발견했습니다.

행동 양식

세포주

마우스 H22 간세포 암종 세포는 Xinjiang University(Xinjiang, Xinjiang, Urumqi) Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering에서 얻었고 100U/ml 페니실린 및 100ug/ml가 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco)에서 배양되었습니다. 스트렙토마이신 및 5% CO2의 가습 분위기에서 37도에서 10% 열불활성화 소태아혈청(Gibco).

MTT 분석

CTPG는 Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.(Hetian, Xinjiang, China)에서 구입했으며 CTPG의 주요 화합물은 고성능 액체 크로마토그래피로 적격 및 정량화되었습니다[16]. 세포 생존율은 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2, 5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)(Sigma, St. Louis, MO , 미국) 분석. H22 세포를 웰당 1{20}0 ul 배지에 2 × 1{15}}4 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고 37도에서 배양했습니다. 24시간 후, 세포를 24시간, 48시간 및 72시간 동안 각각 다른 농도의 CTPG(0, 100, 200, 300 및 400ug/ml) 또는 0.3% DMSO(400ug/ml CTPG와 동일)로 처리했습니다. . 1000rpm에서 7분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 100ul의 MTT 용액(PBS 중 5mg/ml)을 각 웰에 첨가했습니다. 플레이트를 37도에서 4시간 동안 인큐베이션하고 100ul DMSO를 첨가하여 형성된 포르마잔 결정을 용해시켰다. OD490 값은 96- 웰 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)로 감지되었습니다. 세포 생존율은 공식에 따라 계산되었습니다: 세포 생존율(퍼센트)=(ODtreated/ODuntreated) × 100%.

아폽토시스의 검출

H22 세포를 24시간 동안 다양한 농도의 CTPG(0, 1{6}}0, 200, 300, 400ug/ml) 또는 0.3% DMSO로 처리한 다음 Annexin V FITC/ Propidium iodide (PI) Apoptosis Detection Kit (YEASEN, China) 제조사의 지침에 따른 것. 샘플을 유세포 분석법(BD FACSCalibur, USA)으로 분석했습니다.

미토콘드리아 막 전위 검출

H22 세포에 다양한 농도의 CTPG(0, 200, 400 ug/ml)를 24시간 동안 처리한 다음 막 투과성 JC{6}} 염료(Beyotime, China)로 20시간 동안 염색했습니다. 37도에서 최소 . JC{9}} 완충액으로 두 번 세척한 후 샘플을 JC{11}} 완충액 300ul로 재현탁하고 유세포 분석(BD FACSCalibur, USA)으로 분석했습니다.

세포주기 분석

H22 세포를 60mm 배양 접시에 접종하고 다양한 농도의 CTPG(0, 1{18}}0, 200, 300 및 400ug/ml) 또는 0.3% DMSO로 처리했습니다. 24시간 모든 세포를 수집하고 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 -20도에서 2시간 동안 70% 얼음처럼 차가운 에탄올에 고정하고 PBS로 두 번 세척한 다음 300ul Propidium iodide/RNase 염색 완충액(BD Biosciences)에 재현탁했습니다. 실온에서 10분 후, 유세포 분석기(BD FACSCalibur, USA)로 샘플을 수집하고 ModFit LT 3.0 소프트웨어로 세포 주기 분포를 분석했습니다.

Hoechst 33,258 염색

H22 세포 핵의 형태적 변화는 막 투과성 DNA 결합 염료 Hoechst 33,258 염색에 의해 분석되었다. H22 세포를 6-웰 플레이트에 2ml 배지에서 1 × 105 cells/well의 농도로 시딩했습니다. 60% ~ 70% 컨플루언스 후, 세포를 24시간 동안 CTPG(0, 100, 200, 300 및 400ug/ml)로 처리하였다. 세포를 수집하고 10분 동안 4도에서 4% 얼음처럼 차가운 파라포름알데히드로 고정하였다. PBS로 세척한 후 세포를 Hoechst 33,258(Beyotime, China)로 4도에서 10분간 염색하였다. 샘플은 도립형광현미경(Nikon Eclipse Ti-E, Japan)으로 관찰하였다.

웨스턴 블롯

Anti-caspase-3, anti-cleaved caspase-3, Anti-Bcl{5}} 및 anti-Bax는 Beyotime Biotech Co., Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다. 안티-카스파제-7, 안티-절단-카스파제-7, 안티-카스파제{13}}, 안티-절단-카스파제-8, 안티-카스파제{18}}, 안티 -cleaved-caspase-9, 항-PARP, 항-절단된 PARP, 항-마우스 IgG-HRP 및 항-토끼 IgG-HRP는 Cell Signaling Technology에서 구입했습니다. 항액틴은 Beijing ComWin Biotech Co., Ltd.(Beijing, China)에서 구입했습니다.

H22 세포를 다양한 농도의 CTPG(0, 1{6}}0, 200, 300 및 400ug/ml) 또는 0.3% DMSO로 24시간 동안 처리했습니다. 세포를 수집하고 얼음 위에서 30분 동안 Cell Lysis Solution RIPA(Beijing ComWin Biotech Co., Ltd)로 용해시켰다. 샘플을 회전(4도에서 15분 동안 12,{11}g)하여 상층액을 수집하고 단백질 농도를 BCA 키트(Thermo Fisher Scientific, USA)로 측정했습니다. 각 샘플에서 동일한 양의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 멤브레인(Biosharp, China)으로 옮겼습니다. 5% 무지방 우유를 함유한 TBST 완충액으로 차단한 후, 막을 각각 양고추냉이 과산화효소(HRP)에 접합된 해당 1차 항체 및 2차 항체와 함께 배양했습니다. TBST로 세척한 후 ECL assay kit(Beyotime, China)로 표적 단백질을 검출하였다.

동물 및 윤리 선언문

6-8주 된 수컷 Kunming 마우스를 Xinjiang Medical University의 Animal Laboratory Center(Urumqi, Xinjiang, China)에서 구입했습니다. 마우스는 Xinjiang University의 표준 온도 조절, 빛 주기 동물 시설에 보관되었습니다. 모든 동물 연구는 Xinjiang University의 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 Xinjiang University의 Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering(BRGE-AE001)의 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

종양 마우스 연구

종양 마우스 모델의 유도를 위해 수컷 Kunming 마우스의 오른쪽 옆구리에 1{13}}0 ul PBS에 1 × 1{7}}6 H22 세포를 피하 주사했습니다. 3일 후, 마우스를 무작위로 3개의 그룹(7마리/그룹)으로 나누었다. 대조군은 종양 주위에 0.1 ml DMSO를 피하 주사하였다. CTPG-200 및 CTPG{10}} 그룹은 종양 주위에 0.1ml DMSO에 200 또는 400mg/kg CTPG를 피하 주사했습니다. 마우스는 최대 21일 동안 2일마다 처리되었습니다. 25일까지 캘리퍼스를 사용하여 종양 크기를 측정하고 다음 공식에 따라 종양 부피를 계산했습니다. 25일 후, 이 연구가 끝날 때까지 종양 마우스의 생존을 매일 모니터링했습니다.

통계 분석

통계적 유의성은 처리군과 대조군 사이의 분산의 일원 분석에 의해 계산되었습니다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현되었습니다. p < 0.05는="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="">

결과

CTPG는 시험관 내에서 H22 세포의 생존력을 감소시켰습니다.

HCC에 대한 CTPG의 항종양 효과를 조사하기 위해 H22 세포를 시험관 내에서 다양한 농도의 CTPG(0, 100, 200, 300 및 400ug/ml)로 처리했습니다. 24시간 후 도립현미경을 이용하여 H22 세포의 형태를 관찰하였다. 우리는 H22 세포의 형태가 CTPG 처리에 의해 극적으로 변화되었음을 발견했습니다. CTPG 농도가 증가함에 따라 세포가 작고 둥글게되었으며 세포 수도 크게 감소했습니다 (그림 1a). MTT 분석은 각각 24시간, 48시간 및 72시간 동안 CTPG 처리 후 H22 세포의 생존력을 분석하는 데 사용되었습니다. CTPG는 용량 의존적 및 시간 의존적 방식으로 H22 세포 생존력을 유의하게 감소시켰다(그림 1b). 300ug/ml의 CTPG가 최고의 억제율에 도달했습니다(그림 1c). H22 세포에 대한 CTPG의 IC50 값은 24시간에 236ug/ml이고 48시간에 169.8ug/ml입니다.

CTPG는 H22 세포에서 세포 사멸을 유도했습니다.

H22 세포의 감소된 생존율이 세포자멸사 유도에 의해 매개되는지 여부를 조사하기 위해 H22 세포에 다양한 농도의 CTPG(0, 100, 200, 300 및 400ug/ml)를 24시간 동안 처리하고 염색하였다. PI 및 Annexin V와 함께. 유세포 분석 결과는 CTPG가 용량 의존적 방식으로 H22 세포(초기 및 후기 세포사멸 포함)의 세포사멸을 유의하게 유도함을 보여주었습니다(그림 2a). 고용량의 CTPG도 H22 세포의 괴사를 유의하게 증가시켰지만 괴사는 세포자멸사(52.6%)에 비해 낮은 비율(8.3%)로 인해 H22 세포 성장 억제에 미미한 역할을 했습니다. 또한 CTPG 처리 후 H22 세포의 총 단백질이 분리되었고 항-세포자멸사 B 세포 림프종 2(Bcl{20}}) 및 pro-apoptotic BCL{22}}관련 X 단백질(Bax)의 발현이 다음으로 검출되었습니다. 웨스턴 블롯. Grayscale 스캐닝 데이터는 Bax 및 Bcl{23}}의 발현 수준이 각각 증가 및 감소함을 보여주었다. Bax/Bcl{24}} 비율이 크게 증가했습니다(그림 2b). 이러한 결과는 CTPG가 H22 세포에서 세포자멸사를 유도함을 시사한다.

CTPG는 H22 세포에서 염색체 응축 및 세포 주기 정지를 유도합니다

약물에 의해 유도된 DNA 손상 및 세포 주기 정지는 종양 세포 성장을 억제하고 종양 세포에서 세포자멸사를 유발할 수 있다고 보고되었다[17, 18]. 24시간 CTPG 처리 후 H22 세포의 핵 형태를 확인하기 위해 H22 세포를 Hoechst 33,342로 염색하고 도립 형광 현미경을 사용하여 관찰했습니다. CTPG 처리된 세포는 핵의 밝게 응축된 염색질의 용량 의존적 증가를 보인 반면, 처리되지 않은 세포는 균일하게 염색된 핵을 나타냈다(그림 3a). H22 세포의 세포 주기 분포는 24시간 동안 CTPG 처리 후 PI 염색에 의해 추가로 분석되었습니다. 그림 3b에서 보는 바와 같이 CTPG 처리는 G{12}}/G{13}} 및 G2/M기 세포의 비율을 유의하게 증가시켰고 S기 세포의 비율을 유의하게 감소시켰는데, 이는 CTPG가 G{12}}/G{13}}를 유도함을 시사한다. 0 H22 세포에서 /G1 및 G2/M 위상 정지. 고용량의 CTPG는 또한 sub G1 세포의 비율을 상당히 증가시켰습니다.

CTPG는 미토콘드리아 막 전위를 감소시키고 사이토크롬 c의 방출을 증가시켰습니다

미토콘드리아 의존성 경로는 세포자멸사 유도에 중요한 역할을 한다[19, 20]. 미토콘드리아 막 전위(Δψm)의 변화는 JC-1 응집체(적색 형광)로 인한 JC{3}} 염색으로 모니터링할 수 있으며 Δψm의 감소와 함께 단량체(녹색 형광)로 분해될 수 있습니다[21]. 24시간 동안 CTPG 처리한 후, H22 세포를 JC{8}} 염료로 염색하였다. 유세포 분석 데이터에 따르면 FL-2 채널의 적색 형광과 FL{10}} 채널의 녹색 형광은 CTPG 처리 시 유의하게 감소했다가 증가했습니다. PE-FITC + 세포의 비율이 크게 증가하여(그림 4a), 이는 CTPG가 H22 세포에서 Δψm을 감소시켰음을 시사합니다. 이는 증가된 Bax/Bcl{13}} 비율과 일치합니다. 결과적으로, 우리는 CTPG 처리시 사이토크롬 c의 방출이 유의하게 증가하는 것을 관찰했습니다(그림 4b). 이러한 결과는 CTPG가 미토콘드리아 의존성(내인성) 경로를 통해 H22 세포에서 세포자멸사를 부분적으로 유도할 수 있음을 나타냅니다.

CTPG 활성화 카스파제 경로 및 DNA 복구 방지

다음으로 외부 및 내부 신호 전달 경로를 통해 CTPG에 의해 유도된 카스파제의 활성화를 분석했습니다. 24시간 동안 CTPG 처리한 후, 전체 단백질이 H22 세포에서 분리되었고 프로카스파아제 및 절단 카스파아제 수준이 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다. 무처리 또는 DMSO 대조군과 비교하여 CTPG 처리는 절단된 caspase-8(외인성 경로)의 수준뿐만 아니라 절단된 caspase-9(내인성 경로)의 수준도 유의하게 상향 조절했습니다(그림 1a). 5). 순차적으로 활성화된 caspase-8 및 -9는 그림 5에서 관찰된 다운스트림 pro-caspase-3 및 -7를 절단했습니다. 활성화된 caspase-3는 DNA를 절단했습니다. 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP)의 복구 효소는 DNA 복구를 방지하고 그림 3a에서 관찰된 바와 같이 DNA 손상을 축적합니다.

이러한 결과는 CTPG가 외부 및 내부 신호 전달 경로를 통해 H22 세포에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 나타냅니다.

CTPG는 생체 내에서 H22 HCC의 성장을 억제하고 종양 마우스의 생존율을 향상시킵니다

마지막으로, H22 세포의 피하 주사에 의해 확립된 종양 마우스 모델에서 HCC에 대한 CTPG의 항종양 효과를 평가하였다. H22 세포 주입 3일 후, 종양 마우스에 CTPG를 8회 처리하였다. 표시된 시점에서 마우스의 체중 및 종양 크기를 모니터링하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 각 그룹의 마우스 체중은 유의한 차이가 없었으며, 이는 선택된 CTPG 용량이 명백한 부작용이 없음을 시사한다. 흥미롭게도 2{12}}0mg/kg 및 400mg/kg의 CTPG로 처리된 마우스에서 종양 성장이 유의하게 억제되었습니다(그림 6b). 또한 두 가지 용량의 CTPG 처리는 실험 종료 시 대조군(0/7)과 비교하여 종양 마우스(3/7, 3/7)의 생존을 크게 개선했습니다(그림 6b). 우리는 또한 CTPG가 용량 의존적 방식으로 수컷 Kunming 마우스에서 분리된 비장 ​​세포의 증식을 유의하게 증가시키는 것을 발견했으며(그림 6c), 이는 CTPG가 면역 자극 효과가 있음을 시사합니다.

논의

TCM은 오랜 역사 동안 암을 비롯한 다양한 질병을 치료하는 데 사용되었습니다. TCM은 항종양 효과를 발휘하기 위해 외인성(사망 수용체 매개) 및 내인성(미토콘드리아 의존) 신호 전달 경로를 통해 다양한 유형의 종양 세포에서 세포자멸사를 유도할 수 있다고 보고되었습니다[22-25]. 두 경로는 각각 caspase-8와 -9를 활성화할 수 있습니다[24, 26]. 여기에서 우리는 CTPG가 아폽토시스 및 세포 주기 정지의 유도를 통해 H22 세포 성장을 유의하게 억제한다는 것을 발견했습니다. 절단된 caspase-8 및 -9의 수준은 CTPG 처리에 의해 상당히 상향 조절되었으며, 이는 외부 및 내부 신호 전달 경로가 모두 세포자멸사 유도에 관여함을 시사합니다. 우리의 이전 연구는 CTPG가 절단된 caspase의 수준을 증가시켰지만 caspase가 아닌{16}} 미토콘드리아 의존적 경로에 의해 흑색종 B{12}}F10 세포에서 세포자멸사를 유도했음을 보여주었습니다.{16}} [16] CTPG는 다른 유형의 종양 세포에서 뚜렷한 신호 전달 경로를 활성화할 수 있습니다.

미토콘드리아 막 무결성은 Bax 및 Bcl{1}}을 포함한 BCL{0}} 단백질 계열의 구성원에 의해 엄격하게 규제됩니다[27, 28]. Bax 대 Bcl-2의 비율은 미토콘드리아 의존적 세포자멸사 경로에서 중요한 역할을 합니다[29]. CTPG로 처리한 H22 세포에서 Bax/Bcl-2 비율이 크게 상향 조절되어 본 연구에서 관찰된 Δψm의 감소와 사이토크롬 c의 방출을 유발할 수 있습니다. 결과적으로 pro-caspase{11}}가 절단되고 활성화되었습니다. 마지막으로 활성 caspase{12}} 및 -9 개시자는 caspase{14}} 실행자를 활성화하여 DNA 복구를 방지하기 위해 PARP를 절단합니다. 종합하면, 이러한 결과는 CTPG가 외부 및 내부 신호 전달 경로를 통해 H22 세포에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 시사했습니다.

종양 마우스 모델에서 CTPG는 H22 HCC의 성장을 유의하게 억제하고 종양 마우스의 생존을 크게 개선했습니다. 흥미롭게도 CTPG는 용량 의존적으로 Kunming 마우스의 비장세포 증식을 촉진했으며 이는 이전 연구와 일치합니다[16].

이러한 결과는 CTPG가 직접적인 항종양 효과와 간접적인 면역 강화를 통해 마우스에서 H22 HCC의 성장을 억제할 수 있음을 시사했습니다.

결론

CTPG는 시험관 내 및 생체 내에서 H22 세포의 성장을 억제하고 외부 및 내부 신호 전달 경로를 통해 H22 세포에서 세포 사멸을 유도했습니다. 이 데이터는 CTPG가 HCC 치료의 잠재적 후보일 수 있음을 나타냅니다.