Cistanche Tubulosa 페닐에타노이드 배당체는 미토콘드리아 의존 경로를 통해 Eca-109 세포에서 세포자멸사를 유도합니다
Mar 06, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
CHANGSHUANG FU , JINYU LI , ADILA AIPIRE , LIJIE XIA , YI YANG , QIUYAN CHEN , JIE LV , XINHUI WANG 및 JINYAO LI
추상적인
시스탄체 튜불로사다양한 생물학적 기능을 가지고 있습니다. 본 연구에서는 C. tubulosa의 수용성 페닐에타노이드 배당체(CTPG-W)가 식도암에 미치는 항종양 효과를 조사하였다. Eca-109 세포를 CTPG-W로 처리하고 세포 생존율을 MTT assay로 측정하였다. 세포 사멸, 세포 주기, 미토콘드리아 막 전위(Δψm) 및 활성 산소 종을 유세포 분석으로 분석했습니다. 세포 사멸 경로의 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출되었습니다. CTPG‑W가 세포자살 및 세포 주기 정지 유도를 통해 Eca{4}} 세포의 생존력을 현저히 감소시키는 것으로 확인되었습니다. CTPG-W 처리 후 Eca-109의 Δψm이 현저하게 감소했으며, 이는 B 세포 림프종-2(Bcl{9}}) 관련 X의 상향 조절된 수준 및 하향 조절된 수준과 관련이 있습니다. Bcl{11}}. 결과적으로 시토크롬 c 및 c-Jun NH{13}}말단 키나제의 수준이 증가하여 절단된 폴리(ADP-리보스) 중합효소 및 절단된-카스파제{17}}, {{18} } 및 -9, 하지만 caspase-8는 아닙니다. 이에 따라 Eca 세포의 활성 산소 종의 수준은 눈에 띄는 변화를 보였습니다. 이러한 결과는 CTPG-W가 미토콘드리아 의존성 경로를 통해 Eca{23}} 세포의 세포사멸을 유도함을 나타냅니다.
소개
식도암은 가장 흔한 암 유형 중 하나로 전 세계적으로 11번째로 높은 이환율과 6번째로 높은 사망률을 보이며 2015년에 439,{3}} 사망률을 보였습니다(1). 식도암의 발병률은 지역에 따라 현저하게 다르며, 2012년에는 동부 아시아와 동부 및 남부 아프리카가 가장 높은 발병률을 나타내고 서부 아프리카가 가장 낮은 발병률을 나타냅니다(1,2). 중국에서 2015년 추정된 식도암 사례 및 사망률은 각각 477명,{10}} 및 375명{12}}이었습니다(3). 2005년부터 2015년 사이 사회인구학적 지표 중 중상위권 국가에서 식도암 이환율이 감소했지만, 예후가 좋지 않아 사망률은 여전히 높다(1,4). 외과적 절제와 화학요법 또는 방사선 요법의 조합은 식도암 치료에 사용되었지만 2003년에서 2014년 사이에 5-년 생존율이 남아 있는 것으로 보고되었습니다.<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
중국 전통 약초(CHM)는 비소세포폐암(6), 결장직장암(7), 간세포암(8)을 포함한 다양한 암 유형을 치료하는 데 사용되었습니다. 최근 임상 시험에서 CHM과 화학 요법 또는 방사선 요법의 조합은 삶의 질에 대한 많은 이점과 화학 요법 또는 방사선 요법으로 인한 부작용을 완화하는 것으로 나타났습니다 (9,10). 비소세포폐암, 간암, 위암, 결장직장암, 비인두암 또는 자궁경부암(9). 그러나 식도암에 대한 CHM 치료의 효능과 관련하여 상충되는 증거가 있습니다(10,11). Andrographis paniculata(12,13), Daikenchuto(14), icariin(15), Rosa Roxburghii Tratt 및 Fagopyrum을 포함한 많은 한약 또는 구성 요소가 시험관 내 및 생체 내에서 식도암 세포의 성장을 억제할 수 있다는 것이 수많은 연구에서 밝혀졌습니다. Cymosum(16), Jaridonin(17), Marsdenia tenacissima(18), OP16(새로운 ent-kaurene diterpenoid)(19), Qigesan(20) 및 Tonglian 즙(21). Cistanche는 CHM의 한 유형이며 항산화, 항염 및 신경 보호를 포함한 다양한 생물학적 기능을 발휘합니다(22,23). 우리의 이전 연구는Cistanche tubulosa 페닐에타노이드 배당체(CTPG)는 시험관 내 및 생체 내에서 흑색종 B{0}}F10 세포의 성장을 억제할 수 있습니다(24). 그러나 이전에 사용된 CTPG의 낮은 수용성은 약물 개발을 제한합니다(24). 따라서 수용성 CTPG(CTPG-W)를 사용하여 식도암 세포(Eca{6}})에 대한 항종양 효과를 조사하였다. CTPG-W는 미토콘드리아 의존성 경로를 통한 세포자멸사 유도를 통해 Eca{9}} 세포의 생존력을 용량 의존적으로 억제할 수 있는 것으로 결정되었습니다.
재료 및 방법 동물.
암컷 C57BL/6 마우스(6-8주, ~25g)를 Beijing Laboratory Animal Research Center(Beijing, China)에서 구입하여 온도 조절형(25˚C), 빛 순환형(12/ 12) 신장대학 동물시설(중국 우루무치). 모든 동물은 병원균이 없는 물과 음식을 받았습니다.
세포주 및 배양. 인간 식도 암종 세포주(Eca{0}})는 Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering(생명 과학 기술 대학, Xinjiang University, Urumqi, China)에 의해 보존되었고 RPMI에서 배양되었습니다.{{1} } 배지(Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1% L -글루타민(100mM), 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신(37˚C, 5% CO2를 포함하는 습한 분위기).
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC). CTPG-W(카탈로그 번호 SGJG2{10}}170410)는 Shanghai Upbio Tech Co., Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다. CTPG의 주요 화합물은 우리의 이전 연구(24)에 따라 HPLC에 의해 적격 및 정량화되었습니다. 간단히 말해서, HPLC는 30˚C에서 ZORBAX SB‑C18 컬럼(250x4.6mm, 5µm)에서 수행되었으며 0.2% 포름산 용액과 23%에서 시작하는 메탄올 구배로 1분마다 1ml가 추가되면서 용리되었습니다. 31퍼센트에 도달할 때까지 45분 동안. 총 10μl의 샘플을 주입하여 330nm에서 검출했습니다. echinacoside standard는 Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했으며, acteoside 표준은 Sigma-Aldrich(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에서 구입했습니다. 표준은 CTPG-W의 구성 요소를 분석하는 데 사용되었습니다.
MTT 분석. 세포 증식은 MTT 분석으로 측정되었습니다. Eca{0} 세포를 96-웰 플레이트에 5x1{14}}100µl RPMI{{5 }} 배지/웰에 넣고 37˚C에서 24시간 동안 배양한 다음 다른 농도(0, 200, 400, 600 및 800μg/ml)의 CTPG-W 또는 0.4% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 24시간 동안 처리하고, 48시와 72시. DMSO를 용매 대조군으로 사용했습니다(0.4% DMSO를 함유하는 800㎍/ml CTPG-W). 시스플라틴(20㎍/ml)을 양성 대조군으로 사용하였다. 이어서, 상층액을 실온에서 5분 동안 225 xg에서 원심분리한 후 폐기하고, 100 μl MTT 용액(FBS가 없는 RPMI{29}} 배지에서 0.5 mg/ml)을 각 웰에 첨가하고 37˚C에서 배양했습니다. 3시간 동안 형성된 포르마잔 결정을 200㎕ DMSO에 용해시켰다. 광학 밀도(OD) 값은 {{34}웰 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)로 490nm의 파장에서 측정되었습니다. 상대 세포 생존율은 다음 공식에 따라 계산되었습니다. 세포 생존율(%)=(ODtreated/ODuntreated)x100% Eca-109 세포의 형태는 도립형광현미경(배율, x200)(Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
비장세포 증식을 위해 C57BL/6 마우스를 경추 탈구로 안락사시키고 비장을 분리하였다. 단일 세포 현탁액을 만들고 비장 세포를 100µl RPMI-1640 배지에서 1x1{8}5세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 파종한 다음 다른 농도로 처리했습니다. (0, 200, 400, 600, 800 µg/ml) CTPG-W 24, 48, 72시간, 37˚C, 5% CO2 비장세포의 증식은 전술한 프로토콜에 따라 MTT 분석에 의해 측정되었다. 자극 지수{20}}OD치료/OD미치료.
세포 사멸 및 세포주기 측정. Eca{{0}} 세포를 6{12}} mm 접시에서 2.5x1{27}}5 세포/접시 밀도로 24시간 동안 배양하고 다른 농도로 처리했습니다({{31} }, 200, 400, 600, 800 µg/ml) CTPG-W 또는 0.4% DMSO, 37˚C, 5% CO2에서 24시간 제조업체의 프로토콜에 따라 세포를 수집하고 Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)/Propidium iodide(PI) Apoptosis Detection 키트(Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China)로 염색했습니다. 샘플을 유세포 분석기(BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)로 수집하고 FlowJo 7.6(Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA)으로 분석했습니다. CTPG-W가 세포 주기에 미치는 영향을 분석하기 위해 2.5x105 Eca{24}} 세포를 60mm 배양 접시에 파종하고 CTPG-W(0, 100, 200, 400 µg/ml) 또는 0.4로 처리했습니다. 5% CO2로 37˚C에서 24시간 동안 DMSO 백분율. 모든 세포를 수확하고 얼음처럼 차가운 PBS(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.)로 두 번 세척한 다음 4˚C에서 70% 얼음처럼 차가운 에탄올에 30분 동안 고정했습니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척한 후, 세포를 실온에서 10분 동안 300㎕ PI/RNase 염색 완충액(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 재현탁시켰다. 세포 주기 분포는 유세포 분석기(BD FACSCalibur)에 의해 ModFit LT 3.0 소프트웨어로 분석되었습니다.
미토콘드리아 막 전위(Δψm) 및 활성산소종(ROS) 분석. Δψm을 분석하기 위해 Eca{0}} 세포를 CTPG-W(0, 4{23}}0, 600 및 800 µg/ml) 또는 0.4% DMSO로 처리했습니다. h, 37˚C에서 5% CO2, JC{12}}(Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China)를 사용하여 37˚C에서 20분 동안 미토콘드리아 막 전위 분석 키트로 염색 . JC{15}} 세척 완충액(Beyotime Institute of Biotechnology)으로 두 번 세척한 후 샘플을 300µl JC‑1 세척 완충액으로 재현탁하고 유세포 분석(BD FACSCalibur)으로 분석했습니다. Eca-109 세포에서 JC-1 염료의 형광은 도립 형광 현미경(배율, x200, Nikon Eclipse Ti‑E)으로도 관찰되었습니다. ROS 분석을 위해 Eca{21}} 세포를 CTPG-W(0, 400, 600, 800 µg/ml)로 2, 4, 6, 12, 24시간 동안 처리하고 반응성 산소 종으로 염색했습니다. 제조사의 프로토콜에 따라 37˚C에서 20분 동안 Assay Kit(Beyotime Institute of Biotechnology). 얼음처럼 차가운 PBS로 3번 세척한 후, 샘플을 유세포 분석기(BD FACSCalibur)로 수집하고 FlowJo 7.6 소프트웨어로 분석했습니다.
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성. CTPG-W의 자유 라디칼 소거 활성은 DPPH를 용해시키기 위해 메탄올이 에탄올로 대체됨에 따라 약간의 수정을 가한 공개된 프로토콜에 따라 DPPH 자유 라디칼 분석으로 결정되었습니다(25,26). 정상 상태 측정을 위해 에탄올에 녹인 15{27}} µl DPPH(1{29}}0 mmol/l)를 다양한 농도의 CTPG-W(25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500, 600 µg/ml) 50 µl PBS에 넣고 실온에서 30분 동안 암실에서 배양합니다. 517 nm에서의 흡광도는 CTPG-W의 존재 및 부재하에서 검출되었다. 총 50μl의 비타민 C가 양성 대조군으로 사용되었습니다. DPPH 라디칼 소거 활성은 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다. Scavenging(%)=[1-(A sample-Ablank)/A0] x100, 여기서 Ablank는 대조군(DPPH 제외)의 흡광도이고, 샘플은 샘플의 흡광도이고 A0는 DPPH가 있는 PBS의 흡광도입니다.
웨스턴 블롯 분석. Eca{0}} 세포는 5% CO2와 37˚C에서 24시간 동안 CTPG-W(0, 200, 600 µg/ml) 또는 0.4% DMSO로 처리되었습니다. PBS로 두 번 세척한 후 세포를 방사선 면역침전 분석 용해 완충액(Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, China)에서 20분 동안 얼음에서 용해시켰다. 4˚C에서 10,{13}} xg에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 수집하고 제조업체의 프로토콜에 따라 비신코닌산 키트(Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 단백질 농도를 검출했습니다. 웨스턴 블롯 분석은 이전 설명(24)에 따라 수행되었습니다. caspase{17}}(카탈로그 번호 D120077), caspase{19}}(카탈로그 번호 D155240), caspase{21}}(카탈로그 번호 D220078), B 세포 림프종{17}}에 대한 항체 {24}}(Bcl{25}}) 관련 X(Bax)(카탈로그 번호 D220073) 및 Bcl-2(카탈로그 번호 D260117), 및 항-마우스 IgG-고추냉이 퍼옥시다제(HRP) )(카탈로그 번호 D111050) 및 항토끼 IgG-HRP(카탈로그 번호 D110058)는 BBI Life Sciences(중국 상하이)에서 구입했습니다. caspase-3(cat. no. E-AB-10050) 및 활성 caspase-3(cat. no. E-AB-22115)에 대한 항체는 Elabscience( 중국 우한). caspase{42}}(cat. no. 9492), poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)(cat. no. 9542), cytochrome c(cat. no. AC909), c-Jun NH{ {48}}말단 키나제(JNK)(카탈로그 번호 9252S) 및 -액틴(카탈로그 번호 58169)은 Cell Signaling Technology, Inc.(Danvers, MA, USA)에서 입수했습니다. 모든 1차 및 2차 항체를 1:1로 희석했습니다.{54}} 1차 항체는 4℃에서 밤새 배양하고, 2차 항체는 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
제조업체의 프로토콜에 따라 향상된 화학발광 분석 키트(Beyotime Institute of Biotechnology)를 사용하여 표적 단백질을 검출했습니다.
통계 분석. 통계적 유의성은 Tukey의 사후 검정을 통한 일원 분산 분석으로 계산되었으며 결과는 처리군과 대조군 사이에서 GraphPad Prism 5.{2}} 소프트웨어(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 분석되었습니다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시되었습니다. 피<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa 페닐에타노이드 배당체(CTPG)
결과
CTPG‑W는 Eca‑109 세포의 성장을 억제합니다. CTPG-W의 성분은 echinacoside 및 acteoside의 표준물질과 비교한 HPLC(그림 1)에 의해 적격 및 정량화되었습니다. 피크 머무름 시간과 피크 면적에 따르면 CTPG-W는 echinacoside 39.16%, acteoside 2.44%를 함유하고 있었다. 먼저, CTPG-W가 Eca-109 세포의 생존력에 미치는 영향을 MTT 분석으로 확인했습니다. CTPG-W를 200mg/ml로 DMSO에 용해시키고 10% 열 불활성화 FBS를 함유하는 RPMI{12}} 배지로 표시된 농도로 희석했습니다. Eca{15}} 세포를 CTPG-W로 처리하고 표시된 시점에서 MTT 분석으로 세포 생존력을 분석했습니다. CTPG‑W 치료는 용량 및 시간 의존적으로 Eca{17}} 세포의 생존력을 크게 감소시켰습니다(P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG‑W는 Eca‑109 세포에서 세포자멸사를 유도합니다. CTPG-W가 apoptosis 또는 necrosis의 유도를 통해 Eca{2}} 세포의 성장을 억제하는지 여부를 조사하기 위해 세포에 다양한 농도의 CTPG-W를 처리했습니다. 24시간 후, Annexin V/PI 염색으로 Eca{5}} 세포의 세포자멸사와 괴사가 감지되었습니다. 도 3A에 도시된 바와 같이, Annexin V-/PI plus 세포는 괴사 세포로서 게이팅되었고, Annexin V plus /PI plus 및 Annexin V plus /PI- 세포는 세포 사멸 세포로서 게이팅되었다. CTPG-W는 600 및 800 µg/ml CTPG-W의 처리에서 괴사성 Eca 세포도 유의하게 증가했지만(P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG‑W는 Eca‑1{5}}9 세포의 S기에서 세포 주기 정지를 유도합니다. 암세포 주기의 교란은 세포 성장을 억제하고 세포자멸사를 촉진할 것입니다(27). Eca-109 세포의 세포 주기 분포는 24시간 동안 CTPG-W 처리 후 PI 염색으로 검출되었습니다. CTPG-W 치료 시 S기 세포가 증가하고 G0/G1기 세포가 전반적으로 유의한 감소를 나타내는 것으로 관찰되었습니다(P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG‑W는 Δψm을 감소시키고 시토크롬 c의 방출을 유도합니다. 아폽토시스는 미토콘드리아 의존성 경로에 의해 유도될 수 있습니다(28,29). BCL{5}} 단백질 패밀리의 pro-apoptotic 및 anti-apoptotic 구성원은 미토콘드리아 막 완전성의 조절에서 중요한 역할을 합니다(30,31). 24시간 동안 CTPG-W 처리 후, Δψm은 JC-1 염색을 사용하여 평가되었습니다. JC‑1 응집체(FL‑2에서 감지된 적색 형광)는 Δψm이 감소할 때 단량체(FL-1에서 감지된 녹색 형광)로 분해됩니다(32). 도 5A에 도시된 바와 같이 FL{16}} + FL{17}}/ plus 세포의 빈도가 용량 의존적으로 크게 증가하여 Eca-109 세포의 Δψm이 감소했음을 나타냅니다. Eca-109 세포의 형광 변화는 도립형광현미경으로도 관찰되었다(Fig. 5B). CTPG‑W의 농도가 증가함에 따라 적색 형광은 감소하고 녹색 형광은 증가하여 유세포 분석 데이터와 일치합니다. 또한 cytosol에서 cytochrome c의 수준이 Δψm 감소의 결과로 현저하게 증가하는 것으로 관찰되었습니다(그림 5C). 이는 CTPG-W 처리의 결과로 Δψm이 감소한 FL-1 + FL{23}}/ + 세포의 증가된 수로부터 도출된 결론을 강화합니다. JNK는 사이토크롬 c(33-35)의 방출을 유발하는 BCL{25}} 단백질 패밀리의 활성화를 조절할 수 있다고 보고되었습니다. 또한 CTPG-W 처리 후 JNK의 수준이 현저하게 상향 조절되는 것으로 결정되었다(도 5C). 결과는 CTPG-W가 미토콘드리아 의존성 경로를 통해 Eca{30}} 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있음을 나타냅니다.
세포 내 ROS 생성에 대한 CTPG‑W의 효과. ROS는 Δψm을 감소시켜 세포자멸사를 유도할 수 있습니다(36). CTPG-W가 ROS 생성을 증가시킬 수 있는지 조사하기 위해 Eca{2}} 세포를 다양한 농도의 CTPG-W로 처리했습니다. 표시된 시점에서 세포를 수집하고 DCFH-DA로 염색하였다. Eca{5}} 세포에서 세포내 ROS의 생성은 유세포 분석에 의해 결정되었습니다. 도 6A에 도시된 바와 같이, 800 µg/ml CTPG-W는 2-6h에서 ROS 생성을 유의하게 증가시켰고 12-24 h에서 감소했습니다. 또한 400 µg/ml CTPG‑W는 12-24 h에서 ROS 생산을 크게 증가시켰습니다. 또한 200 µg/ml CTPG-W는 ROS 생산을 크게 변경하지 않았습니다. ROS 생성의 동적 변화는 Eca{15}} 세포 사멸과 관련될 수 있습니다. 또한 CTPG-W가 자유 라디칼 소거 활성을 갖는 것으로 확인되었으며(그림 6B), 이는 12시간 후 800µg/ml CTPG-W로 처리된 Eca{18}} 세포에서 ROS 생성 감소와 관련이 있을 수 있습니다.
CTPG‑W는 caspase‑3, caspase‑7, caspase‑9 및 PARP의 활성을 상향 조절합니다. Δψm 감소로 인한 시토크롬 c의 방출은 카스파제 프로테아제를 활성화시켜 세포자멸사를 유도할 수 있습니다(29,30,37). 24시간 동안 CTPG-W 처리 후, 웨스턴 블롯 분석에 의해 caspase-3, 7, 8, 9 및 PARP의 활성화가 검출되었습니다. 대조군과 비교하여 cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-7, cleaved-caspase-3 및 cleaved-PARP의 수준은 있지만 cleaved-caspase{{ 20}}, CTPG 처리에 의해 용량 의존적으로 상향조절되었다(도 7). 이러한 결과는 CTPG-W가 Δψm을 감소시키고 시토크롬 c 방출을 촉진하여 Eca{24}} 세포의 세포사멸을 유도하는 카스파제를 활성화함을 나타냅니다.
Cistanche tubulosa 추출물
논의
전통적인 CHM은 외인성 사멸 수용체, 내인성 미토콘드리아 및 소포체 스트레스 경로를 포함한 다양한 경로를 통해 식도암 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있습니다(29). 우리의 이전 연구는 C. tubulosa의 주요 성분인 CTPG가 미토콘드리아 의존성 경로를 통한 세포자멸사 유도를 통해 흑색종 B16-F1{23}} 세포의 성장을 억제한다는 것을 보여주었습니다(24). 본 연구에서는 CTPG-W가 Eca-109 세포에 미치는 항종양 효과를 조사한 결과 CTPG-W가 Eca-109 세포의 성장을 억제하고 세포자멸사를 유도하며 세포주기 정지, 감소된 Δψm, 사이토크롬 c 및 활성화된 카스파제의 방출 증가. CTPG 및 CTPG-W는 암세포에서 세포자멸사 및 세포 주기 정지를 유도할 수 있습니다. 그러나 CTPG(26.64% echinacoside, 10.19% acteoside, 1.71% isoacteoside)와 CTPG-W(39.16% echinacoside 및 2.44% acteoside)의 성분이 다르기 때문에 정확한 메커니즘이 다릅니다. CTPG는 G0/G1기에서 B{21}F10 세포를 정지시켰지만 CTPG-W는 S기에서 Eca{26}} 세포를 정지시켰습니다(24). ROS 생산은 CTPG에 의해 용량 의존적으로 증가했지만 CTPG-W 치료 시작(2-6 h) 및 대조군과 비교하여 12시간 후에 유의하게 감소하였다. 가능한 이유는 CTPG-W의 주성분이 에키나코사이드이기 때문입니다. 많은 연구에서 echinacoside가 ROS 생성 및 ROS 유도 세포자멸사를 억제하여 신경 보호 및 노화 방지 효과를 발휘할 수 있다고 보고했습니다(38-40). 유사하게, 본 연구에서 자유 라디칼 소거 활성이 관찰되었다. 따라서 고용량의 CTPG-W에 포함된 verbascoside, iso-verbascoside 및 salidroside를 포함한 일부 성분이 즉시 ROS 생성을 유도하여 Eca{39}} 세포의 세포자멸사를 유발할 수 있다고 추측되었습니다(41,42). ROS는 echinacoside에 의해 소거되었습니다. CTPG와 CTPG-W에 의한 ROS 생산의 차이에 대한 또 다른 가능한 이유는 이 연구와 이전 연구에서 서로 다른 세포주가 사용되었기 때문입니다(24). Dong et al(43)은 echinacoside가 ROS 수준의 증가 없이 산화적 DNA 손상의 생성을 통해 인간 SW480 결장직장암 세포의 세포자멸사를 유도할 수 있다고 보고했습니다.
CTPG-W 처리는 Δψm을 감소시키고 caspase의 절단을 촉진하는 cytochrome c의 방출을 유발했습니다-9(28). 일관되게, 절단된 카스파제-9의 수준은 CTPG-W 처리에 의해 상향 조절되었습니다. 결과적으로 활성 caspase-9는 caspase-3를 활성화하여 세포자멸사를 유도할 수 있습니다(44). 절단된 카스파제 수준도 CTPG-W 처리에 의해 상향 조절되었습니다. 그러나 caspase{12}}는 CTPG-W에 의해 활성화되지 않아 외부 사멸 수용체 경로가 CTPG-W에 의해 유도된 세포자멸사에 관여하지 않음을 나타냅니다. 이러한 관찰은 CTPG-W가 미토콘드리아 의존성 경로의 활성화를 통해 Eca{16}} 세포의 세포자멸사를 유도함을 나타냅니다.
PARP는 게놈 안정성에 중요한 역할을 하며 활성 카스파제, 특히 카스파제-3 및 -7(45)에 의해 절단될 수 있습니다. CTPG-W 처리는 PARP를 절단하여 DNA 복구를 억제하고 세포자멸사를 유발할 수 있는 caspase-3 및 -7를 활성화하는 것으로 결정되었습니다.
CTPG-W는 또한 용량 및 시간 의존적으로 인간 간세포 암종 BEL{3}} 세포의 성장을 억제합니다(미공개 데이터). CTPG-W가 Eca{5}} 및 BEL{6}} 세포의 성장을 억제하지만 비장세포의 증식을 촉진하는데, 이는 CTPG-W의 다당류(~50%) 함량 때문일 수 있습니다(46 ). 유사하게, 많은 연구에서 다당류가 비장세포의 증식을 촉진할 수 있다고 보고했습니다({10}}). 마우스 모델에서 CTPG-W는 대조군에 비해 비장 지수를 유의하게 증가시켰으나 체중과 심장, 간, 신장, 폐를 포함한 기타 장기 지수에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(미공개 데이터), CTPG-W가 정상 세포에 세포 독성 효과가 없음을 나타냅니다.
종합적으로, 데이터는 CTPG-W가 미토콘드리아 의존성 경로를 통한 세포자멸사 유도에 의해 Eca{1}} 세포의 성장을 억제함을 나타냅니다.
cistanche의 이점: 항세포자멸사
감사의 말
저자는 원고를 연마한 Dr. Jianhua Yang(Baylor College of Medicine)에게 감사드립니다.
자금 조달
이 연구는 핵심 학문 생물학 입찰 프로젝트를 위한 13차 5개년 계획(보조금 번호 17SDKD0202), Xinjiang Normal University 및 Xinjiang의 특수 환경 생물 다양성 적용 및 규제 핵심 연구소(보조금 번호 XJTSWZ-2017-04)의 지원을 받았습니다. JL 및 중국 국립 자연 과학 재단 보조금(보조금 번호 31760260) XW.
데이터 및 자료의 가용성
본 연구 동안 사용 및 분석된 데이터 및 자료는 합리적인 요청이 있는 경우 교신저자에게 제공됩니다.
저자의 기여
CF, AA, YY 및 QC가 실험을 수행했습니다. LX, JLv, XW는 데이터와 준비된 수치를 분석하였다. JinyuL과 JinyaoL이 프로젝트를 디자인하고 원고를 작성했습니다.
윤리 승인 및 참여 동의
모든 동물 실험은 Xinjiang 주요 생물 자원 및 유전 공학 연구소의 동물 실험 윤리 위원회(승인 번호 BRGE-AE001, Xinjiang University)의 승인을 받았습니다.
출판에 대한 환자 동의
해당되지 않습니다.
경쟁 관심
저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.
참고문헌
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