Cistanche Tubulosa 페닐에타노이드 배당체는 미토콘드리아 의존 경로를 통해 Eca-109 세포에서 세포사멸을 유도합니다

소개

식도암은 전 세계적으로 이환율이 11번째로 높고 사망률이 6번째로 높은 가장 흔한 암 유형 중 하나이며, 2015년에 약 439,{3}} 사망자가 발생했습니다. 식도암 발생률은 지역에 따라 현저하게 다릅니다. 2012년 아시아와 동부 및 남부 아프리카는 발생률이 가장 높았고 서부 아프리카는 발생률이 가장 낮았습니다. 중국의 경우 식도암 추정 건수와 사망률은 각각 477명000과 375명000이었습니다. 식도암의 이환율은 2005년부터 2015년까지 사회인구통계학적 지수 중·상위권 국가에서 감소했지만 예후가 좋지 않아 사망률은 여전히 ​​높다. 식도암 치료에는 수술적 절제와 화학요법 또는 방사선요법을 병용하는 방법이 사용되어 왔지만, 2003년부터 2014년까지 5-년 생존율이 유지된 것으로 보고되었습니다<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous study그것을 증명했다Cistanche tubeulosa 페닐에타노이드 배당체(CTPG)는 시험관 내 및 생체 내에서 흑색종 B16-F10 세포의 성장을 억제할 수 있습니다(24). 그러나 이전에 사용된 CTPG의 낮은 수용성으로 인해 약물 개발이 제한되었습니다. 따라서 수용성 CTPG(CTPG-W)를 이용하여 식도암세포(Eca{5}})에 대한 항종양 효과를 조사하였다. CTPG-W는 미토콘드리아 의존 경로를 통한 세포사멸 유도를 통해 용량 의존적으로 Eca{8}} 세포의 생존을 억제할 수 있음을 확인하였다.

성기능 개선을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

재료 및 방법

동물.

암컷 C57BL/6 마우스(6-8주, ~25 g)를 베이징 실험실 동물 연구 센터(베이징, 중국)에서 구입하여 온도 조절(25˚C), 광 순환(12/ 12) 신장대학교 동물시설(중국 우루무치). 모든 동물은 병원균이 없는 물과 음식을 받았습니다.

세포주 및 배양.

인간 식도암 세포주(Eca-109)는 신장 생물자원 및 유전공학 핵심 연구소(중국 우루무치 신장대학교 생명과학기술대학)에서 보존되었으며 RPMI에서 배양되었습니다.{{1} } 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China)이 보충된 배지(Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), 1% L - 글루타민(100mM), 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신, 37˚C, 5% CO2를 함유한 가습 환경.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC).

CTPG-W(카탈로그 번호 SGJG20170410)는 Shanghai Upbio Tech Co., Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다. CTPG의 주요 화합물은 이전 연구(24)에 따라 HPLC에 의해 검증되고 정량화되었습니다. 간단히 말하면, HPLC는 ZORBAX SB-C18 컬럼(250x4.6mm, 5μm)에서 30˚C에서 수행되었으며 0.2% 포름산 용액과 23%부터 시작하는 메탄올 구배로 용출되었습니다. 매 분마다 1ml가 추가되었습니다. 31%에 도달할 때까지 45분 동안. 총 10 µl 샘플을 주입하고 330 nm에서 검출했습니다. 에키나코사이드 표준품은 Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd.(중국 상하이)에서 구입했고, 액티오사이드 표준품은 Sigma-Aldrich(Merck KGaA, 독일 다름슈타트)에서 구입했습니다. 표준은 CTPG-W의 구성 요소를 분석하는 데 사용되었습니다.

MTT 분석.

세포 증식은 MTT 분석으로 측정되었습니다. Eca{{0}} 세포를 100 µl RPMI{{5에서 5x103 세포의 밀도로 96-웰 ​​플레이트에 접종했습니다. }} 배지/웰에 넣고 37˚C에서 24시간 동안 배양한 후 다양한 농도(0, 200, 400, 600 및 800μg/ml)의 CTPG-W 또는 0.4% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 24시간 동안 처리합니다. 48시간과 72시간. DMSO를 용매 대조군(0.4% DMSO를 함유한 800μg/ml CTPG-W)으로 사용했습니다. 시스플라틴(20μg/ml)을 양성 대조군으로 사용했습니다. 이어서, 실온에서 5분 동안 225 xg로 원심분리한 후 상층액을 버리고 100 μl의 MTT 용액(FBS가 없는 RPMI{29}} 배지에서 0.5 mg/ml)을 각 웰에 첨가하고 37˚C에서 3분간 배양했습니다. 시간. 형성된 포르마잔 결정을 200μl DMSO에 용해시켰다. 광학 밀도(OD) 값은 96-웰 마이크로플레이트 판독기(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하여 490nm의 파장에서 측정되었습니다. 상대 세포 생존율은 다음 공식에 따라 계산되었습니다: 세포 생존율(%)=(OD처리된/OD처리되지 않은)x100%. Eca-109 세포의 형태는 도립형광현미경(배율, x200)(Nikon Eclipse Ti-E, Nikon Corporation, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰했습니다.

비장세포의 증식을 위해, C57BL/6 마우스를 경추 탈구로 안락사시키고, 비장을 분리하였다. 단일 세포 현탁액을 만들고 비장 세포를 100μl RPMI-1640 배지에서 1x105 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후 다양한 농도로 처리했습니다. (0, 200, 400, 600 및 800 µg/ml)의 CTPG-W를 5% CO2 및 37˚C에서 24, 48 및 72시간 동안 사용합니다. 비장세포의 증식은 전술한 프로토콜에 따라 MTT 분석으로 측정하였다. 자극지수=OD처리됨/OD처리되지 않음.

세포 사멸 및 세포주기 측정. Eca{0}} 세포를 2.5x105 세포/접시의 밀도로 60 mm 접시에서 24시간 동안 배양하고 다양한 농도로 처리했습니다({{31} }, 200, 400, 600 및 800 µg/ml) CTPG-W 또는 0.4% DMSO, 5% CO2, 37˚C에서 24시간 동안. 제조업체의 프로토콜에 따라 세포를 수집하고 FITC(Annexin V-플루오레세인 이소티오시아네이트)/요오드화 프로피듐(PI) 세포사멸 검출 키트(Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China)를 사용하여 염색했습니다. 샘플은 유동 세포 계측법 (BD FACSCalibur, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)으로 수집하고 FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA)으로 분석했습니다. CTPG-W가 세포주기에 미치는 영향을 분석하기 위해 2.5x105 Eca-109 세포를 60mm 배양 접시에 파종하고 CTPG-W(0, 100, 200 및 400μg/ml) 또는 0.4μg/ml를 처리했습니다. 5% CO2, 37˚C에서 24시간 동안 % DMSO. 모든 세포를 수확하고 얼음처럼 차가운 PBS(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.)로 두 번 세척한 다음 4˚C에서 70% 얼음처럼 차가운 에탄올에 30분간 고정했습니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척한 후, 세포를 300μl PI/RNase 염색 완충액(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 실온에서 10분 동안 재현탁시켰습니다. 세포주기 분포는 유동 세포 계측법 (BD FACSCalibur)을 통해 ModFit LT 3.0 소프트웨어로 분석되었습니다.

천연 시스탄체 투불로사피로 방지간 보호 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

미토콘드리아 막 전위(Δψm) 및 활성 산소종(ROS) 분석.Δψm을 분석하기 위해 Eca{0}} 세포를 CTPG-W(0, 400, 600 및 800 μg/ml) 또는 0.4% DMSO로 처리하여 5% CO2, 37˚C에서 24시간, 제조업체의 프로토콜에 따라 JC-1(Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China)를 사용하여 미토콘드리아 막 전위 분석 키트로 37˚에서 20분 동안 염색했습니다. 씨. JC-1 세척 완충액(Beyotime Institute of Biotechnology)으로 두 번 세척한 후 샘플을 300μl JC-1 세척 완충액으로 재현탁하고 유세포 분석기(BD FACSCalibur)로 분석했습니다. Eca-109 세포에서 JC-1 염료의 형광은 도립형광현미경(배율, x200, Nikon Eclipse Ti-E)으로도 관찰되었습니다. ROS 분석을 위해 Eca{21}} 세포를 CTPG-W(0, 400, 600 및 800 µg/ml)로 2, 4, 6, 12 및 24시간 동안 처리하고 Reactive Oxygen Species Assay로 염색했습니다. 키트(Beyotime Institute of Biotechnology)를 제조업체의 프로토콜에 따라 37˚C에서 20분 동안 사용합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척한 후 유세포 분석기(BD FACSCalibur)로 샘플을 수집하고 FlowJo 7.6 소프트웨어로 분석했습니다.

그림 1. CTPG-W의 적격한 제어. CTPG-W의 성분을 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 정성, 정량분석하고 에키나코사이드, 액티오사이드 표준품과 비교하였다. CTPG-W, 수용성 페닐에타노이드 배당체C. 세뇨관.

2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH) 라디칼 소거 활성. CTPG-W의 자유 라디칼 소거 활성은 DPPH를 용해시키기 위해 메탄올을 에탄올로 대체했기 때문에 약간의 수정을 가한 공개된 프로토콜에 따라 DPPH 자유 라디칼 분석으로 결정되었습니다(25,26). 정상 상태 측정을 위해 에탄올에 용해된 150μl DPPH(100mmol/l)를 다양한 농도의 CTPG-W(25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 및 600 µg/ml)을 50 µl PBS에 용해시키고 실온에서 30분 동안 암실에서 배양했습니다. 517 nm에서의 흡광도는 CTPG-W 존재 및 부재 하에서 검출되었습니다. 총 50 μl의 비타민 C가 양성 대조군으로 사용되었습니다. DPPH 라디칼 소거 활성은 소거(%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100 공식을 사용하여 계산되었습니다. 여기서 Ablank는 대조군(DPPH 제외)의 흡광도입니다. 는 샘플의 흡광도이고 A0는 DPPH가 포함된 PBS의 흡광도입니다.

웨스턴 블롯 분석. Eca{0}} 세포를 CTPG-W(0, 200, 600 µg/ml) 또는 0.4% DMSO로 37˚C, 5% CO2에서 24시간 동안 처리했습니다. 다음 PBS로 2회 세척, 세포 

그림 2. Eca{2}} 세포와 비장세포의 성장에 대한 CTPG-W의 효과. (A) Eca-109 세포를 24, 48 및 72시간 동안 다양한 농도의 CTPG-W로 처리한 후 MTT 분석을 통해 세포 생존력을 검출했습니다. (B) 24시간 동안 CTPG-W 처리 시 Eca-109 세포의 형태학적 변화. (C) C57BL/6 마우스의 비장 세포를 24, 48 및 72시간 동안 다양한 농도의 CTPG-W로 처리한 다음 MTT 분석으로 증식을 분석했습니다.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. 세뇨관.

얼음 위에서 20분 동안 Radioimmunoprecipitation Assay Lysis 완충액(Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, China)에서 용해되었습니다. 4˚C에서 10,000 xg, 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 수집하고 제조사의 프로토콜에 따라 bicinchoninic acid 키트(Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 단백질 농도를 검출했습니다. 웨스턴 블롯 분석은 이전 설명(24)에 따라 수행되었습니다. 카스파제-7(카탈로그 번호 D120077), 카스파제-8(카탈로그 번호 D155240), 카스파제{10}}(카탈로그 번호 D220078), B세포 림프종에 대한 항체 {13}}(Bcl-2)-연관 X(Bax)(카탈로그 번호 D220073) 및 Bcl-2(카탈로그 번호 D260117) 및 항마우스 IgG-양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) )(카탈로그 번호 D111050) 및 항토끼 IgG-HRP(카탈로그 번호 D110058)는 BBI Life Sciences(중국 상하이)에서 구입했습니다. 카스파제-3(카탈로그 번호 E-AB-10050) 및 활성 카스파제-3(카탈로그 번호 E-AB-22115)에 대한 항체는 Elabscience( 중국 우한). 카스파제-7(카탈로그 번호 9492), 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP)(카탈로그 번호 9542), 시토크롬 c(카탈로그 번호 AC909), c-Jun NH{에 대한 기타 항체 {37}}말단 키나제(JNK)(카탈로그 번호 9252S) 및 -액틴(카탈로그 번호 58169)은 Cell Signaling Technology, Inc.(Danvers, MA, USA)에서 구입했습니다. 모든 1차 및 2차 항체는 1:1로 희석되었습니다000. 1차 항체는 4˚C에서 밤새 배양되었고 2차 항체는 37˚C에서 1시간 동안 배양되었습니다.

그림 3. CTPG-W에 의해 유도된 Eca-109 세포의 세포사멸. 세포를 24시간 동안 다양한 농도의 CTPG-W로 처리하였다. (A) 세포사멸 및 괴사 Eca-109 세포를 유세포 분석으로 분석했습니다. 위쪽 패널은 개별 도트 플롯을 나타내고 아래쪽 패널은 요약 데이터를 나타냅니다. * 피<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. 세뇨관.

제조사의 프로토콜에 따라 강화된 화학발광 분석 키트(Beyotime Institute of Biotechnology)를 사용하여 표적 단백질을 검출하였다.

통계 분석. 통계적 유의성은 Tukey's post hoc test를 이용한 일원분산분석을 통해 계산하였고, 결과는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 이용하여 치료군과 대조군을 대상으로 분석하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시되었습니다. 피<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

신장 기능 개선을 위한 시스탄체 투불로사 추출물 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

결과

CTPG‑W는 Eca‑109 세포의 성장을 억제합니다.

CTPG-W의 성분은 HPLC로 검증 및 정량화되었으며(그림 1), 이는 echinacoside 및 acteoside의 표준과 비교되었습니다. 피크 유지 시간과 피크 면적에 따르면 CTPG-W는 39.16%의 echinacoside와 2.44%의 acteoside를 함유하고 있습니다. 첫째, Eca-109 세포의 생존 가능성에 대한 CTPG-W의 효과는 MTT 분석을 통해 결정되었습니다. CTPG-W를 DMSO에 200mg/ml로 용해하고 10% 열 불활성화 FBS를 포함하는 RPMI{11}} 배지로 표시된 농도로 희석했습니다. Eca-109 세포를 CTPG-W로 처리하고 표시된 시점에서 MTT 분석으로 세포 생존율을 분석했습니다. CTPG‑W 치료는 용량 및 시간 의존 방식으로 Eca{16}} 세포의 생존 가능성을 크게 감소시켰습니다(P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

그림 4. Eca-109 세포의 세포 주기 분포에 대한 CTPG-W의 효과. 다양한 농도의 CTPG-W를 사용하여 Eca-109 세포를 24시간 동안 처리하고 세포 주기 분포를 유세포 분석법으로 분석했습니다. * 피<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. 세뇨관.

CTPG‑W는 Eca‑109 세포에서 세포사멸을 유도합니다. CTPG-W가 세포사멸 또는 괴사 유도를 통해 Eca{2}} 세포의 성장을 억제하는지 조사하기 위해 세포를 다양한 농도의 CTPG-W로 처리했습니다. 24시간 후 Annexin V/PI 염색을 통해 Eca{5}} 세포의 세포사멸과 괴사가 검출되었습니다. 도 3A에 도시된 바와 같이, Annexin V- /PI+ 세포는 괴사 세포로 게이팅되었고, Annexin V+ /PI+ 및 Annexin V+ /PI- 세포는 아폽토시스 세포로 게이팅되었습니다. CTPG-W는 주로 용량 의존적으로 Eca{14}} 세포의 세포사멸을 유도했지만, 괴사성 Eca{16}} 세포도 600 및 800 µg/ml CTPG-W 처리 하에서 크게 증가했습니다(P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG‑W는 Eca‑109 세포의 S 단계에서 세포 주기 정지를 유도합니다. 암세포 주기의 교란은 세포 성장을 억제하고 세포사멸을 촉진합니다(27). Eca-109 세포의 세포주기 분포는 24시간 동안 CTPG-W 처리 후 PI 염색으로 검출되었습니다. CTPG-W 처리 시 S기의 세포가 증가하고 G0/G1기의 세포가 전반적으로 유의미한 감소를 나타내는 것으로 관찰되었습니다(P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG‑W는 Δψm을 감소시키고 시토크롬 c의 방출을 유도합니다. 세포사멸은 미토콘드리아 의존 경로에 의해 유도될 수 있습니다(28,29). BCL-2 단백질 계열의 세포사멸 촉진 및 항아포토시스 구성원은 미토콘드리아 막 완전성 조절에 중요한 역할을 합니다(30,31). 24시간 동안 CTPG-W 처리 후 JC-1 염색을 사용하여 Δψm을 평가했습니다. JC-1 집합체(FL-2에서 감지된 빨간색 형광)는 Δψm이 감소할 때 단량체(FL-1에서 감지된 녹색 형광)로 분해됩니다(32). 그림 5A에 도시된 바와 같이, FL{16}} FL-2-/+ 세포의 빈도는 용량 의존적으로 크게 증가했으며, 이는 Eca-109 세포의 Δψm이 감소했음을 나타냅니다. Eca-109 세포의 형광 변화는 도립형광현미경으로도 관찰되었습니다(그림 5B). CTPG-W의 농도가 증가함에 따라 빨간색 형광은 감소하고 녹색 형광은 증가했으며 이는 유세포 분석의 데이터와 일치합니다. 또한 세포질 내 시토크롬 c 수준이 눈에 띄게 증가한 것으로 관찰되었으며(그림 5C), 이는 Δψm 감소의 결과입니다. 이는 CTPG-W 처리의 결과로 Δψm 감소한 FL-1+ FL-2-/+ 세포 수의 증가에서 도출된 결론을 뒷받침합니다. JNK는 시토크롬 c(33-35)의 방출을 유발하는 BCL-2 단백질 계열의 활성화를 조절할 수 있는 것으로 보고되었습니다. 또한 CTPG-W 치료 후 JNK 수준이 눈에 띄게 상향조절되는 것으로 확인되었습니다(그림 5C). 결과는 CTPG-W가 미토콘드리아 의존 경로를 통해 Eca{32}} 세포의 세포사멸을 유도할 수 있음을 나타냅니다.

그림 5. Δψm의 감소와 시토크롬 c 및 JNK의 상향 조절. Eca-109 세포를 24시간 동안 다양한 농도의 CTPG-W로 처리했습니다. (A) Δψm은 JC-1 염색으로 검출되었고 샘플은 유세포 분석으로 분석되었습니다. 개별 도트 플롯은 JC-1 형광의 변화를 나타냅니다. FL-1+ FL-2-/+ 셀의 빈도는 하단 패널에 표시됩니다. ***피<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

그림 6. CTPG-W 처리 시 Eca-109 세포의 ROS 수준과 CTPG-W의 항산화 활성. (A) Eca-109 세포를 다양한 농도의 CTPG-W로 처리하고 ROS 수준을 지정된 시점에서 유동 세포 계측법으로 분석했습니다. * 피<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

세포 내 ROS 생성에 대한 CTPG‑W의 효과.ROS는 Δψm을 감소시켜 세포사멸을 유도할 수 있습니다(36). CTPG-W가 ROS 생산을 증가시킬 수 있는지 조사하기 위해 Eca{2}} 세포를 다양한 농도의 CTPG-W로 처리했습니다. 표시된 시점에 세포를 수집하고 DCFH-DA로 염색했습니다. Eca-109 세포에서 세포내 ROS의 생성은 유세포 분석을 통해 결정되었습니다. 그림 6A에서 볼 수 있듯이, 800 µg/ml CTPG-W는 2-6시간부터 ROS 생성을 크게 증가시켰고, 12-24시간부터 감소했습니다. 또한 400 µg/ml CTPG‑W는 12-24시간부터 ROS 생산량을 크게 증가시켰습니다. 또한, 200μg/ml CTPG-W는 ROS 생산을 눈에 띄게 변경하지 않았습니다. ROS 생산의 동적 변화는 Eca{15}} 세포 사멸과 연관될 수 있습니다. 또한 CTPG-W는 자유 라디칼 소거 활성을 갖는 것으로 확인되었으며(그림 6B), 이는 12시간 후 800 µg/ml CTPG-W로 처리한 Eca{18}} 세포에서 ROS 생성 감소와 관련이 있을 수 있습니다.

그림 7. CTPG-W 처리 후 절단된 카스파제 및 절단된 PARP의 수준. CTPG-W로 24시간 동안 처리된 Eca{4}} 세포로부터 단백질을 분리하였고, 절단된 카스파제 및 절단된-PARP의 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 검출하였다. DMSO, 디메틸 설폭사이드; CTPG-W, 수용성 페닐에타노이드 배당체C. 세뇨관; PARP, 폴리(ADP-리보스) 중합효소.

CTPG-W는 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-9 및 PARP의 활성을 상향 조절합니다. Δψm 감소로 인한 시토크롬 c의 방출은 카스파제 프로테아제를 활성화하여 세포사멸을 유도할 수 있습니다(29,30,37). 24시간 동안 CTPG-W 처리 후, 웨스턴 블롯 분석을 통해 카스파제-3, 7, 8, 9 및 PARP의 활성화가 검출되었습니다. 대조군과 비교하면 cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-7, cleaved-caspase-3 및 cleaved-PARP 수준은 있지만 cleaved-caspase 수준은 아닙니다.{20 }}는 CTPG 치료에 의해 용량 의존적으로 상향조절되었습니다(그림 7). 이러한 결과는 CTPG-W가 Δψm을 감소시키고 시토크롬 c 방출을 촉진하여 Eca-109 세포의 세포사멸을 유도하는 카스파제를 활성화한다는 것을 나타냅니다.

논의

전통적인 CHM은 외인성 사멸 수용체, 내인성 미토콘드리아 및 소포체 스트레스 경로를 포함한 다양한 경로를 통해 식도암 세포의 세포사멸을 유도할 수 있습니다(29). 우리의 이전 연구에서는 C. tubeulosa의 주요 구성 요소인 CTPG가 미토콘드리아 의존 경로를 통한 세포사멸 유도를 통해 흑색종 B16-F10 세포의 성장을 억제한다는 것을 입증했습니다(24). 본 연구에서는 Eca-109 세포에 대한 CTPG-W의 항종양 효과를 조사한 결과 CTPG-W가 Eca-109 세포의 성장을 억제하고 세포사멸을 유도하며 세포주기를 정지시키는 것으로 확인되었다. Δψm 감소, 시토크롬 c 방출 및 활성화된 카스파제 증가. CTPG와 CTPG-W는 암세포에서 세포사멸과 세포주기 정지를 유도할 수 있습니다. 그러나 CTPG(26.64% 에키나코사이드, 10.19% 액티오사이드, 1.71% 아이소액티오사이드)와 CTPG-W(39.16% 에키나코사이드, 2.44% 액티오사이드)의 성분이 다르기 때문에 정확한 메커니즘이 다릅니다. CTPG는 G0/G1 단계에서 B16-F10 세포를 정지시켰지만, CTPG-W는 S 단계에서 Eca{26}} 세포를 정지시켰습니다(24). ROS 생성은 CTPG에 의해 용량 의존적으로 증가했지만 고용량 CTPG-W에 의해 시간 의존적으로 변화를 나타냈으며 이는 CTPG-W 치료 시작(2-6 h) 및 12시간 후에 대조군에 비해 현저히 감소했습니다. 가능한 이유는 CTPG-W의 주요 성분이 에키나코사이드(echinacoside)이기 때문입니다. 여러 연구에서 에키나코사이드가 ROS 생성과 ROS 유발 세포사멸을 억제하여 신경 보호 및 노화 방지 효과를 발휘할 수 있다고 보고했습니다(38-40). 마찬가지로, 본 연구에서도 자유라디칼 소거 활성이 관찰되었습니다. 따라서 고용량 CTPG-W에 함유된 verbascoside, iso-verbascoside 및 salidroside를 포함한 일부 성분은 즉시 ROS 생성을 유도하여 Eca{39}} 세포의 세포 사멸을 유발할 수 있다고 추측되었습니다 (41,42). ROS는 echi에 의해 청소되었습니다.나코사이드. CTPG와 CTPG-W에 의한 ROS 생산의 차이에 대한 또 다른 가능한 이유는 본 연구와 이전 연구에서 서로 다른 세포주가 사용되었기 때문입니다(24). Dong 등(43)은 echinacoside가 ROS 수준의 증가 없이 산화성 DNA 손상 생성을 통해 인간 SW480 대장암 세포의 세포사멸을 유도할 수 있다고 보고했습니다.

CTPG-W 처리는 Δψm을 감소시키고 시토크롬 c의 방출을 유발하여 카스파제의 절단을 촉진합니다-9(28). 일관되게, 절단된 카스파제-9의 수준은 CTPG-W 처리에 의해 상향조절되었습니다. 이어서, 활성 카스파제-9는 카스파제-3를 활성화하여 세포사멸을 유도할 수 있습니다(44). 절단된 카스파제-3의 수준도 CTPG-W 처리에 의해 상향 조절되었습니다. 그러나 카스파제-8는 CTPG-W에 의해 활성화되지 않았으며, 이는 외인성 사멸 수용체 경로가 CTPG-W에 의해 유도된 세포사멸에 관여하지 않았음을 나타냅니다. 이러한 관찰은 CTPG-W가 미토콘드리아 의존 경로의 활성화를 통해 Eca{16}} 세포의 세포사멸을 유도한다는 것을 나타냅니다.

PARP는 게놈 안정성에서 중요한 역할을 하며 활성 카스파제, 특히 카스파제-3 및 -7(45)에 의해 절단될 수 있습니다. CTPG-W 처리는 PARP를 절단하여 DNA 복구를 억제하고 세포사멸을 유발할 수 있는 카스파제-3 및 -7를 활성화시키는 것으로 확인되었습니다.

CTPG-W는 또한 용량 및 시간 의존적으로 인간 간세포 암종 BEL{3}} 세포의 성장을 억제합니다(미공개 데이터). CTPG-W는 Eca{5}} 및 BEL{6}} 세포의 성장을 억제하지만 비장세포의 증식을 촉진하는데, 이는 CTPG-W의 다당류 함량(~50%) 때문일 수 있습니다(46). ). 마찬가지로, 여러 연구에서 다당류가 비장세포의 증식을 촉진할 수 있다고 보고했습니다(46-49). 마우스 모델에서는 CTPG-W가 대조군에 비해 비장 지수를 유의하게 증가시켰으나 체중과 심장, 간, 신장, 폐를 포함한 기타 장기 지수에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었습니다(미공개 데이터). 이는 CTPG-W가 정상 세포에 세포독성 효과가 없음을 나타냅니다.

종합적으로, 데이터는 CTPG-W가 미토콘드리아 의존 경로를 통해 세포사멸을 유도하여 Eca{1}} 세포의 성장을 억제한다는 것을 나타냅니다.

성기능 개선을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%