Cistanche Deserticola 추출물은 조골세포의 뼈 형성을 증가시킵니다--파트 I
Mar 15, 2022
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테마오 리a등
추상적인
우리는 의 효과를 조사했습니다.시스탄체데저스티콜라엄마. (CD) 켜기뼈형성배양된 조골세포에 의해 방법 광물성 결절 형성 분석을 사용하여 CD의 시험관 내 효과를 조사했습니다.(시스탄체데저티콜라)~에뼈형성. Alkaline phosphatase(ALP), bone morphogenetic protein(BMP){0}} 및 osteopontin(OPN) mRNA 발현을 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응으로 분석했습니다. CD의 작용 메커니즘(시스탄체데저티콜라)추출물은 Western blotting을 사용하여 조사되었습니다. CD의 생체 내 항 골다공증 효과(시스탄체데저티콜라)추출물은 난소 절제된 마우스에서 평가되었습니다.
중요한 발견들
CD(시스탄체데저티콜라)추출물은 배양된 조골세포의 증식, 이동 또는 상처 치유에 영향을 미치지 않았지만 ALP, BMP{0}} 및 OPN mRNA 및 뼈 광물화를 증가시켰습니다. 미토겐 활성화 단백질 키나제(MAPK) 또는 핵 인자(NF)-kB 억제제 감소 CD(시스탄체데저티콜라)추출물 유도뼈 형성및 ALP, BMP-2 및 OPN 표현식입니다. 그러나 CD(시스탄체데저티콜라)추출물은 파골세포 형성에 영향을 미치지 않았습니다. 또한, CD(시스탄체데저티콜라)추출물은 생체 내 난소 절제술로 인한 골 손실을 예방했습니다.
결론
CD(시스탄체데저티콜라)소설일지도 모른다뼈 형성골다공증 치료제.
키워드뼈 형성; 시스탄체데저스티콜라; 한약재; 조골세포
소개
뼈는 '뼈 리모델링'이라는 지속적인 재생 및 복구 과정을 겪는 여러 유형의 세포로 구성된 복잡한 조직입니다. 뼈 재형성을 담당하는 두 가지 주요 세포 유형은 뼈를 재흡수하는 파골세포와 새로운 뼈를 형성하는 조골세포입니다. 뼈 리모델링은 여러 전신 호르몬(예: 부갑상선 호르몬, 1,{1}}디하이드록시 비타민 D3, 성 호르몬, 칼시토닌)과 국소 인자(예: 산화질소, 프로스타글란딘, 성장 인자, 사이토카인)에 의해 조절됩니다.[1] 골다공증은 뼈의 흡수와 형성이 조화되지 않고 과도한 뼈 분해가 뼈 형성을 초과할 때 발생합니다.[2] 현재 골다공증 치료제로는 비스포스포네이트, 칼시토닌, 에스트로겐이 있으며, 이는 파골세포 활성을 억제하여 골량을 유지하는 골흡수 억제제이다.[3] 그러나 골량을 증가시키거나 회복시키는 이러한 약물의 효과는 상대적으로 작으며 확실히 연간 2%를 넘지 않습니다.[3] 따라서 새로운 자극을 주는 teriparatide와 같은 골 형성제가 필요합니다.뼈형성확립된 골다공증의 특징인 섬유주 미세구조의 변화를 교정합니다.[4,5] 새로운뼈형성주로 조골세포의 기능이며, 조골세포 계통의 세포 증식을 증가시키거나 조골세포의 분화를 유도함으로써 작용하는 제제는 골 형성을 향상시킬 수 있습니다.[5,6]
골다공증의 기전은 아직 불분명하지만, 골형성 단백질(BMP)과 같은 골 성장 인자의 가용성 또는 효과 감소와 관련이 있을 가능성이 있습니다.[7] 변형 성장 인자-b 슈퍼패밀리와 구조적으로 관련이 있는 BMP는 원래 이소성 유도 능력에 의해 확인되었습니다.뼈 형성설치류에서.[8] BMP는 다음에서 중요한 역할을 합니다.뼈형성알칼리성 포스파타제(ALP) 활성과 프로테오글리칸, 콜라겐, 오스테오폰틴(OPN) 합성을 자극하여 뼈 세포 분화를 촉진합니다.[9] 최근 연구에서는 BMP{1}}, ALP 및 OPN 유전자에서 골다공증과 특정 다형성 사이의 연관성을 발견했으며, 이는 이들이 골다공증 발병과 관련이 있음을 시사합니다.[10]
시스탄체데저스티콜라엄마. (Orobanchaceae, CD로 약칭)(시스탄체데저티콜라)중국의 토종 허브이며 진정, 진통 및 면역 자극 특성으로 인해 치료제로 전통 의학에서 널리 사용됩니다.[11] 현대 약리학 연구에 따르면 CD(시스탄체데저티콜라)추출물은 면역을 자극하고[12] 자유 라디칼을 제거하고[13] 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 활성을 증가시킬 수 있습니다.[14] 항염증제 및 항산화제는 증가시켜 골다공증을 치료할 가능성이 있습니다.뼈 형성및/또는 골 흡수 억제.[15,16] 그러나 CD의 효과(시스탄체데저티콜라)뼈 세포 기능에 대해서는 아직 결정되지 않았습니다. 여기, 우리는 CD(시스탄체데저티콜라)추출물은 배양된 조골세포의 증식, 이동 또는 상처 치유 활성에 영향을 미치지 않았지만 ALP, BMP{0}} 및 OPN 발현 및 뼈 광물화를 증가시켰습니다. 또한, 우리는 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 및 핵 인자(NF)-kB 신호 전달 경로가 유전자 발현 및 뼈 광물화의 CD 매개 증가에 관여할 수 있음을 보여줍니다. 이에 반해 CD(시스탄체데저티콜라)추출물은 시험관 내에서 파골세포 생성을 억제하지 않았습니다. 특히, CD를 가진 쥐의 치료(시스탄체데저티콜라)추출물은 생체 내 난소 절제술로 인한 골 손실을 예방했습니다. 따라서 우리의 데이터는 CD가(시스탄체데저티콜라)자극하는 데 사용할 수 있습니다뼈형성골다공증 치료용.
시스탄체 데저티콜라면역력을 높이다
재료 및 방법
Cistanche Deserticola 추출물 및 재료
CD(시스탄체데저티콜라)추출물은 Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company(대만 가오슝)에서 구입했습니다. CD의 추출 및 분리(시스탄체데저티콜라)이전에 설명된 대로 따랐습니다(스펙트럼 데이터를 기반으로 베타-시토스테롤, 다우코스테롤, 숙신산, 트리아콘탄올, 악테오사이드, 베타인 및 다당류를 포함한 화학 조성을 확인했습니다).[17] p-세포외 신호 조절 키나제(ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-말단 키나제(JNK), JNK, p-p65 및 p65에 특이적인 토끼 다클론 항체는 Santa Cruz Biotechnology( 미국 산타크루즈). 오스테오칼신 ELISA 키트는 Biosource Technology(벨기에 Nivelles)에서 구입했습니다. Type-I 콜라겐 ELISA 키트의 C-말단 텔로펩티드는 Cross Laps(Herlev, Denmark)에서 구입했습니다. p38 우성-음성 돌연변이는 Dr. J. Han(South-Western Medical Center, Dallas, USA)에 의해 제공되었습니다. JNK 우성-음성 돌연변이는 Dr. M. Karin(University of California, San Diego, USA)에 의해 제공되었습니다. ERK2 우성-음성 돌연변이는 Dr. M. Cobb(South-Western Medical Center)에 의해 제공되었습니다. 다른 모든 시약은 Sigma-Aldrich(St Louis, USA)에서 구입했습니다.
세포 배양
쥐 조골 세포주 MC3T3-E1은 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, USA)에서 구입했습니다. 세포는 95% 공기, 5% CO2에서 20mm HEPES 및 10% 열-불활성화 소태아 혈청, 2mm-글루타민, 페니실린(100U/ml) 및 스트렙토마이신(100mg)이 보충된 a-MEM과 함께 배양되었습니다. /ml).
광물성 결절 형성 측정
광물화된 결절 형성은 설명된 대로 평가되었습니다.[18] 간단히 말해서, 조골세포는 비타민 C(50 mg/ml)와 b-glycerophosphate(10 mm)가 포함된 배지에서 2주 동안 배양하였고, 배지는 3일마다 교체하였다. CD로 배양 후(시스탄체데저티콜라)세포를 12일 동안 추출하고, 세포를 0.15m NaCl(pH 7.4)을 포함하는 20mm Tris 완충 식염수로 두 번 세척하고, 30분 동안 얼음처럼 차가운 75%(v/v) 에탄올에 고정하고, 공기 중에서 건조한. 칼슘 침착은 alizarin red-S 염색을 사용하여 결정되었습니다. 간단히 말해서, 에탄올로 고정된 세포와 기질을 40mm alizarin red-S(pH 4.2)로 1시간 동안 염색하고 물로 광범위하게 헹구었습니다. 결합된 염색은 10%(w/v) 세틸피리디늄 클로라이드로 용리되었고 샘플의 알리자린 레드-S는 550 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하고 표준 곡선과 비교했습니다. 알리자린 레드-S 1몰은 약 2몰의 칼슘을 선택적으로 결합합니다.
시스탄체 데저티콜라에 좋다뼈 형성
정량적 실시간 중합효소 연쇄반응
총 RNA는 TRIzol 키트(MDBio Inc., Taipei, Taiwan)를 사용하여 조골세포에서 추출되었습니다. 2 mg total RNA와 oligo(dT) 프라이머를 사용하여 역전사를 수행했습니다.[19,20] 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)은 TaqMan® one-step PCR Master Mix(Applied Biosystems, Carlsbad, 미국). 서열 특이적 프라이머 및 Taqman® 프로브를 사용하여 총 cDNA를 첨가했습니다({6}}ml 반응당 100ng). b-actin을 내부 대조군으로 포함하여 모든 표적 유전자 프라이머 및 프로브를 상업적으로 구입했습니다(Applied Biosystems). qPCR 분석은 StepOnePlus 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)에서 3회 수행되었습니다. 사이클링 조건은 10-95도에서 최소 중합효소 활성화 후 15초 동안 95도 및 60초 동안 60도의 40 사이클이었습니다. 임계값은 비-템플릿 대조군 배경 위에 설정되었고 표적 유전자 증폭의 선형 단계 내에서 전사체가 검출된 사이클 수(CT로 표시됨)를 계산했습니다.
웨스턴 블롯 분석
세포 용해물은 이전에 설명한 대로 준비되었습니다. [21,22] 단백질은 SDS-PAGE로 분리하고 Immobilon 폴리비닐 디플루오라이드 막(Millipore, Billerica, USA)으로 옮겼습니다. 블롯은 실온에서 1시간 동안 4% 소 혈청 알부민으로 차단된 다음 실온에서 1시간 동안 p{6}} 또는 p-p65(1:1000)에 대한 토끼 항인간 항체로 조사되었습니다. 3회 세척 후, 블롯을 실온에서 1시간 동안 퍼옥시다제-접합 당나귀 항-토끼 이차 항체(1:1000)와 함께 인큐베이션하였다. 얼룩은 X-OMAT LS 필름(Eastman Kodak, Rochester, USA)을 사용하여 향상된 화학 발광에 의해 시각화되었습니다.
난소절제술로 인한 골다공증
4주령의 암컷 ICR 마우스(22~28g)가 이 연구에 사용되었습니다. 마우스를 트리클로로아세트알데히드(100 mg/kg) 마취하에 양측으로 난소 절제하고 대조군 마우스는 비교를 위해 가짜 수술(Sham)을 했습니다. 다양한 농도의 CD를 경구 투여한 후 골밀도와 골밀도를 측정하였다.(시스탄체데저티콜라)4주 동안 이틀에 한 번씩 추출합니다. 총 체내 골밀도와 골밀도는 이중 에너지 X선 흡수계(DEXA; XR{2}}; Norland, Fort Atkinson, USA)를 사용하여 이전에 설명한 대로 작은 대상에 대한 모드를 사용하여 결정했습니다.[18, 23] 모든 프로토콜은 기관 지침을 준수했으며 중국 의과대학 동물 관리 위원회의 승인을 받았습니다.
통계 분석
통계 분석은 Prism 4.{4}}1소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). 주어진 값은 평균 SEM입니다. 두 샘플 간의 통계 분석은 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. Bonferroni의 사후 검정을 사용하여 일원 분산 분석을 사용하여 2개 이상의 그룹에 대한 통계적 비교를 수행했습니다. 모든 경우에 P < 0.05는="" 유의미한="" 것으로="">
시스탄체 데저티콜라에 좋다뼈 형성
결과
시스탄체 데저스티콜라추출물은 조골세포에 의해 뼈의 광물화를 증가시킵니다. CD의 추가(시스탄체데저티콜라)24시간 또는 48시간 동안의 추출물은 MTT 분석에서 마우스 조골세포 MC3T{3}}E1 세포의 증식에 영향을 미치지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 조골세포 분화는 세포 증식 및 이동을 포함하는 복잡한 과정이기 때문에 CD 처리 후 MC3T3-E1 세포의 이동 능력도 테스트했습니다.(시스탄체데저티콜라)발췌. Transwell 및 상처 치유 분석을 사용하여 CD가(시스탄체데저티콜라)추출물은 조골세포 이동에 영향을 미치지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 광물화된 결절의 형성은 조골세포 성숙의 지표 중 하나입니다. Alizarin red S 염색은 조골세포를 CD 첨가에 의해 농도 의존적으로 비타민 C(50 ug/ml)와 -glycerophosphate(10 mm)가 포함된 배지에서 2주 동안 배양했을 때 광물성 결절이 형성되었음을 보여주었다.(시스탄체데저티콜라)(그림 1a). 따라서 CD(시스탄체데저티콜라)추출물은 배양된 조골세포에 의해 뼈 결절 형성을 유도하지만 증식이나 이동은 아닙니다. 우리는 또한 CD의 역할을 조사했습니다.(시스탄체데저티콜라)RANKL에 의해 유도된 파골세포 형성에서 추출물이 발견되었지만 효과가 발견되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음).
Cistanche Deserticola 추출물은 배양된 조골세포에서 알칼리성 인산분해효소, 뼈 형태형성 단백질{0}} 및 오스테오폰틴 발현을 증가시킵니다.
분화된 조골세포는 높은 수준의 효소 발현과 상관관계가 있는 상승된 ALP 활성을 나타냅니다.[18] 우리는 CD로 치료하는 것을 발견했습니다.(시스탄체데저티콜라)72시간 동안 추출물은 조골세포 ALP 활성을 유의하게 증가시켰습니다(그림 1b). 조골세포 분화에서 BMP-2, ALP 및 OPN의 중요한 역할을 감안할 때 우리는 CD가(시스탄체데저티콜라)추출물은 BMP{0}}, ALP 및 OPN 발현을 조절하여 조골세포 분화에 효과를 발휘합니다. CD로 세포 치료(시스탄체데저티콜라)ALP, BMP{0}} 및 OPN의 증가된 mRNA 발현을 농도 의존 방식으로 추출하여(그림 1c), CD가(시스탄체데저티콜라)추출물은 ALP, BMP{0}} 및 OPN 발현을 상향 조절하여 조골 세포의 분화를 유도합니다.
Cistanche Deserticola 추출물은 mitogen-activated protein kinase pathway를 통해 뼈 결절 형성을 증가시킵니다.
MAPK가 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었습니다.뼈형성[24,25] 그래서 우리는 다음으로 이 신호전달 경로가 CD에 관여하는지 여부를 조사했습니다.(시스탄체데저티콜라)추출물 유도 뼈 광물화. ERK 억제제 U0126, p38 억제제 SB203580 또는 JNK 억제제 SP600125를 사용한 세포의 전처리 감소된 CD(시스탄체데저티콜라)추출물 증가 뼈 광물화(그림 2a, 3a 및 4a). 또한 억제제는 CD를 차단했습니다.(시스탄체데저티콜라)추출물 유도 ALP, BMP{1}} 및 OPN 발현(그림 2b–4c). ERK2, p38 또는 JNK 돌연변이 감소 CD를 사용한 세포 형질감염(시스탄체데저티콜라)ALP, BMP{1}} 및 OPN mRNA 발현의 추출물 증가(그림 2c, 3c 및 4c). 다음으로 CD 후 ERK, p38 및 JNK 활성화를 직접 조사했습니다.(시스탄체데저티콜라)추출물 처리. CD와 세포 배양(시스탄체데저티콜라)추출물은 ERK, p38 및 JNK 인산화를 유도했습니다(그림 2d, 3d 및 4d). 따라서 ERK, p38 및 JNK는 증가된뼈형성CD에 의해 유발(시스탄체데저티콜라)조골세포 치료.
Cistanche Deserticola 추출물은 핵 인자-kB 경로를 통해 뼈 결절 형성을 증가시킵니다
앞서 언급했듯이 NF-kB 활성화는 다음을 위해 필요합니다.뼈형성.[26,27] 다음으로 우리는 NF-kB 활성화가 다음과 같은지를 결정하기 위해 Calbiochem(Darmstadt, Germany)에서 구입한 NF-kB 억제제 pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC) 및 N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone(TPCK)으로 조골 세포를 처리했습니다. CD에 참여(시스탄체데저티콜라)추출물 유도 뼈 광물화. 그림 5a는 PDTC 또는 TPCK로 조골 세포를 전처리하면 CD를 억제한다는 것을 보여줍니다.(시스탄체데저티콜라)추출물 유도 골 결절 형성, 또한 ALP, BMP{1}} 및 OPN 발현의 증가를 감소시켰습니다(그림 5b 및 5c). NF-kB p65 소단위의 인산화는 NF-kB 활성화의 지표이며[28] 이와 일치하여 우리는 CD가(시스탄체데저티콜라)추출물은 조골세포에서 p65 인산화를 증가시켰습니다(그림 5d). 이러한 결과는 NF-kB 활성화가 CD 추출물로 유도된 ALP, BMP{4}} 및 OPN 발현 및 골 결절 형성에 중요함을 나타냅니다.
그림 4 c-Jun N-말단 키나제(JNK)의 관여시스탄체데저스티콜라(CD) 조골 세포에서 추출물 유도 뼈 광물화. (a) 세포를 {{1}웰 플레이트에 플레이팅하고 비타민 C(50mg/ml) 및 b-글리세로포스페이트(10mM)를 포함하는 배지에서 2주 동안 배양했습니다. 세포를 CD로 동시에 처리하였다.(시스탄체데저티콜라)추출물(26mg/ml) + SP600125(3mM). 광물화된 결절 형성은 alizarin red-S 염색으로 평가되었습니다(n=5). (b, c) 세포를 30분 동안 SP600125로 전처리하거나 JNK 돌연변이로 또는 24시간 동안 형질감염시킨 후 CD 추출물 및 알칼리성 인산분해효소(ALP) 활성 및 ALP, 골형성 단백질(BMP){8}} 및 osteopontin (OPN) mRNA 발현은 ALP kit와 정량적 실시간 중합효소연쇄반응으로 측정하였다. (d) 세포를 표시된 시간 간격 동안 CD 추출물로 처리하고 p-JNK 발현을 웨스턴 블롯팅으로 조사하였다. *피< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(시스탄체데저티콜라)추출물 처리군.
난소 적출 마우스에서 Cistanche Deserticola 추출물에 의한 골 손실 억제
CD의 효과를 확인하려면(시스탄체데저티콜라)골 손실에 대한 추출물, 난소 절제술에 의해 암컷 마우스에서 골다공증이 유발되었습니다. 예상대로 난소 절제된 마우스는 감소된 총 체내 골밀도와 골밀도를 나타냈습니다(그림 6a 및 6b). CD로 치료(시스탄체데저티콜라)4주 동안 추출물은 용량 의존적 방식으로 골밀도 및 골무기질 함량의 손실을 억제했습니다(그림 6a 및 6b). ALP의 혈중 농도는 조골 활성을 반영할 수 있습니다.[29] 그림 6c와 같이 CD(시스탄체데저티콜라)추출물은 난소 절제술에 의해 유도된 혈청 ALP 활성의 감소를 억제했습니다. 또한, CD(시스탄체데저티콜라)추출물은 또한 osteocalcin의 수치를 증가시켰습니다.뼈형성, 그리고 뼈 흡수의 마커인 I형 콜라겐의 C-말단 텔로펩티드 수준을 감소시켰습니다(그림 6d 및 6e). 따라서 이러한 발견은 CD의 효능과 효능을 뒷받침합니다.(시스탄체데저티콜라)생체 내에서 뼈 손실을 예방하는 추출물.
그림 6 난소절제술 유도에 의한 골밀도 및 골밀도 감소시스탄체데저스티콜라(CD) 추출물. 암컷 ICR 마우스는 가짜 수술을 받거나 난소 절제술을 받았습니다. 난소 절제된 마우스는 표시된 농도의 CD로 처리되었습니다.(시스탄체데저티콜라)경구 섭취로 추출합니다. 총체내 골밀도(a), 골밀도(b), 혈청 알칼리성 인산분해효소(ALP) 활성(c), 혈청 오스테오칼신(d), 혈청 C-말단 텔로펩티드 I형 콜라겐(e) 4가지를 측정하였다. 수술 후 몇 주. 데이터는 평균 SE, n=8–10 마우스/그룹으로 표시됩니다. *P < 0.05,="" 가짜와="" 비교;="" #p="">< 0.05,="" 난소절제군과="">
논의
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에서: '시스탄체데저스티콜라추출물 증가뼈형성조골세포'에 의해테마오 리a외
---© 2012 저자. JPP © 2012 왕립 약사회 2012약학 및 약리학 저널, 64, pp. 897–907
