Cistanoside A는 파골 세포 활동을 억제하기 위해 P38/MAPK 경로를 중재합니다

추상적인

배경:시스타노사이드 A가지고있다항염증 효과, 항산화,신장 손상 감소, 골다공증 예방, 그러나 그 효과는파골세포 분화, 기능 및 기본 분자 메커니즘은 아직 불분명합니다. 목적: 효과를 조사하기 위해시스타노사이드 A~에파골세포차별화와뼈 흡수시험관 내에서 핵인자 카파-B 리간드(RANKL)의 수용체 활성인자에 의해 유도되는 반응과 그 메커니즘.

방법: 4-6-주된 C57BL/6 생쥐의 대퇴골과 경골에서 골수 대식세포를 채취했습니다. 골수 대식세포 생존능력에 대한 Cistanoside A(5, 10, 20, 40, 80 및 160 μmol/L)의 세포독성 효과는 세포 계수 키트{10}} 분석 키트를 사용하여 검사되었습니다. 다양한 농도의 타르타르산염 저항성 산성 인산분해효소 염색을 통해 농도에 따른 효과를 관찰했습니다.시스타노사이드 A조골세포 분화에 대한 효과적인 개입 농도가 결정되었습니다. 양성 대조군인 Cistanoside A 저용량, 중간 용량, 고용량 그룹(40, 80 및 160μmol/L)이 있었습니다. 세포 부착 후, 조골세포 분화를 유도하기 위해 50 ng/mL RANKL을 첨가하였고, 시스타노사이드 A 저용량, 중용량 및 고용량 그룹에 각각 상응하는 용량의 시스타노사이드 A를 첨가했습니다. F-액틴 고리와 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydroclide 염색을 수행하여시스타노사이드 A의 효과에파골세포의 형성. 뼈 마모 조각의 톨루이딘 블루 염색을 사용하여 파골세포의 뼈 흡수 기능에 대한 Cistanoside A의 효과를 관찰했습니다. JNK/MAPK 경로의 상류 및 하류 단백질의 발현은 웨스턴 블롯에 의해 검출되었습니다. tartrate- resistance acid phosphatase, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk, c-Fos 등 파골세포 분화 및 골흡수 기능과 관련된 유전자의 발현을 RTqPCR로 검출하였다. 결과 및 결론: Tartrate- resistance acid phosphatase 염색, F-actin ring 염색 및 resorptionpit 분석을 통해 Cistanoside A가 유의하게 증가한 것으로 나타났다.RANKL에 의한 파골세포 분화 억제그리고뼈 흡수양성대조군과 비교하여 용량의존적으로 나타났다. RT-qPCR 결과, 양성 대조군과 비교하여 Cistanoside A 고용량군과 저용량군 모두 타르타르산염 저항성 산성 포스파타제, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk 및 용량 의존적 방식의 c-Fos. 웨스턴 블랏 분석 결과, Cistanoside A 고용량군은 개입 10, 20, 30 및 60분에 p-JNK 단백질의 발현을 유의하게 억제하는 것으로 나타났습니다. 양성 대조군과 비교하여 Cistanoside A는 용량 의존적으로 Nfatc1 및 c-Fos 단백질의 발현을 유의하게 억제했습니다. 결론적으로 Cistanoside A는 p-JNK 단백질의 수준을 감소시키고 MAPK 경로의 활성화와 파골세포의 주요 유전자 발현을 억제함으로써 파골세포의 형성과 골흡수를 억제할 수 있습니다.

키워드: 시스타노사이드 A; 파골세포; MAPK; JNK; 랭클; 계급;골다공증; 페닐에타노이드 배당체

파골세포 활동을 억제하기 위해 노력하는 CISTANCHE

0 소개 소개

역학 연구에 따르면 전 세계적으로 인구가 증가하고 고령화됨에 따라 골다공증, 골관절염 등 골용해성 질환의 발병률이 더욱 증가할 것으로 나타났습니다[1]. 현재 연구에 따르면 골용해성 질환의 발병기전에서 파골세포 기능의 과도한 활성화로 인한 골흡수 및 골 재건의 불균형은 골량, 골밀도 및 골 미세구조의 상당한 감소로 이어진다는 것을 보여줍니다. 유해한 악화는 뼈의 취약성을 증가시키고 골절 위험을 증가시킵니다 [2-3]. 따라서 파골세포는 골다공증 치료에 효과적인 제제를 식별하고 개발하기 위한 주요 세포 표적입니다. 그러나 현재 흔히 사용되는 데노수맙(항RANKL 항체), 비스포스포네이트 등 파골세포를 억제하는 약물은 신독성, 골괴사, 자궁내막암 위험, 턱뼈괴사 등의 부작용이 나타난다[4-5 ]. 따라서 파골세포의 활성을 억제할 수 있는 신약을 찾는 것은 임상적 의의가 높다.

파골세포의 분화 및 골흡수 기능은 주로 두 가지 신호 분자인 대식세포 콜로니 자극 인자와 핵 인자 κB 리간드의 수용체 활성화제(RANKL)에 의해 조절됩니다. 파골세포 전구체 세포막에 있는 콜로니 자극 인자 1 수용체(c-fms)는 대식세포 콜로니 자극 인자와 결합하여 핵 인자 카파 B 수용체 활성인자(RANK)의 발현을 촉진합니다. 세포 표면의 RANKL과 RANK 결합은 핵인자 κB, JNK, p38, JNK 등의 전사인자를 활성화시키고, 이는 다시 세포막에서 활성화된 T세포의 핵인자 c1(Nfatc1)인 전사인자 c-Fos를 활성화시킨다. 핵, 뼈 전구체 세포의 파괴를 활성화하여 다핵 세포를 형성하고 결국 파골세포로 분화됩니다[7-9].

시스탄체 데세르티콜라임상에서 가장 일반적으로 사용되는 한약재 중 하나입니다. Orobanchiaceae 식물의 Cistanche Deserticola 또는 Cistanche tuberosum의 비늘 모양의 잎을 말린 다육질의 줄기이다[10]. 전통 의학에서는 Cistanche Deserticola가 성질이 따뜻하고 맛이 달고 짜며 신장과 대장 경락으로 돌아간다고 믿습니다. 신장양(腎陽)을 보양하고 정혈(精血)을 보하며 장(腸)을 보습하고 완하(腎臟)하는 효능이 있으며 신장양(腎陽)과 정혈(血血)부족으로 인한 발기부전, 불임, 근육과 뼈를 치료하는데 쓰인다. 허약함과 같은 질병은 골용해성 질환을 치료하기 위해 전통의학에서 사용하는 간 및 신장 강장 치료 방법과 일치합니다. 약리학적 연구에 따르면 Cistanche Deserticola의 주요 활성 성분은 페닐에타노이드 글리코사이드(phenylethanoid 배당체)이며 이는 안전성이 뛰어나고 광범위한 약리 기능을 가지고 있는 것으로 나타났습니다[11]. Cistanoside A(분자식: C36H48O20)는 중국 전통 의학인 Cistanche Deserticola에서 분리 및 정제된 천연 페닐에탄올 배당체 화합물입니다. 항염증, 항산화, 항종양 효과가 있습니다[12-14]. 연구에 따르면 Cistanche Deserticola A는 에탄올로 인한 급성 간 손상이 있는 생쥐의 일차 세포에서 c-Fos 수준을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났습니다. 다른 연구에서는 Cistanche A가 RANKL/TNF 수용체 관련 인자 6(TRAF6) 경로를 통해 난소를 절제한 골다공증 생쥐의 소주골 구조 매개변수를 개선할 수 있음을 보여주었습니다[16]. 그러나 시스탄체사이드 A가 파골세포 분화와 잠재적인 분자 메커니즘에 미치는 영향에 대한 추가 연구는 부족합니다. 본 연구는 시스탄체사이드 A가 파골세포 분화 및 골흡수 기능에 미치는 in vitro 효과와 잠재적인 분자 메커니즘을 탐색하여 파골세포 분화를 억제하는 새로운 잠재적 약물을 찾는 것을 목표로 합니다.

1 재료 및 방법 재료 및 방법

1.1 디자인

시험관 내 세포 실험을 위해 t-test와 one-way ANOVA를 수행했습니다.

1.2 시간과 장소

산시 의과대학 제2병원 뼈 및 연조직 손상 복구 연구실에서 2022년 12월부터 2023년 12월까지 완료되었습니다.

1.3 재료

1.3.1 실험동물

SPF 등급 4-주령 C57BL/6 마우스(수컷 또는 암컷)를 산시 의과대학 실험동물센터(생산 허가 번호: SCXK(Jin) 2019-0004)에서 구입했습니다. 실험쥐는 실내 온도 26도, 습도 약 55%, 하루 12시간 빛 노출, 자유로운 움직임, 독립적 식사 등 표준 환경에서 사육됐다. 실험 프로토콜은 산시 의과대학 제2병원 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: DW2023031).

1.3.2 시약 및 약물

Cistancheside A(순도 98%, CAS 93236-42-1)는 Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.에서 구입했습니다. 소 태아 혈청 및 고글루코스 MEM 배양 배지는 미국 HyClone Company에서 구입했습니다. 트립신-EDTA분해액0.25%, 적혈구용해액, 1×PBS, 페니실린-스트렙토마이신 혼합물(×100), 톨루이딘블루염색액(1/100, 붕산염법), 로다민표지팔로이딘 반지

펩타이드(Cat. No. CA1610)와 DAPI 염색(Ready-to-use)은 Beijing Solebao Technology Co., Ltd.에서 구입했으며, 마우스 재조합 대식세포 콜로니 자극 인자와 마우스 재조합 종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 RANKL은 Beijing Solebao Technology Co., Ltd.에서 구입했습니다. 베이징저시위안생명공학유한회사; CCK-8 키트는 미국 MCE사에서 구입, tartarte resistance acid phosphatase (TRAP) 염색 키트는 미국 Sigma-Aldrich사에서 구입, RNAiso Plus, Premix type reverse transcription Reagents, TB Green® 빠른 qPCR 믹스,

Prime Script TM RT Master Mix 및 Trizol은 미국 Takara Company에서 구입했습니다. 수지상 세포 특이적 막횡단 단백질(DC-STAMP), TRAP, CTSK, c-Fos, NFATc-1 특이적 PCR 프라이머는 Sangon Bioengineering (Shanghai) Co., Ltd.에서 구입했습니다. -actin 항체, c-Fos 항체, Nfatc1 항체, JNK 항체 및 p-JNK 항체, m-IgG Fc BP-HRP는 미국 Santa Cruz에서 구입했습니다.

생명공학공사.

1.4.6 파골세포의 골흡수 능력을 시험하기 위한 골흡수 실험

골수 대식세포를 7×103/웰의 밀도로 미리 멸균된 소 뼈 조각이 놓인 96-웰 플레이트에 파종했습니다. 각 웰에 100 μL의 배양액을 첨가하고 양성대조군과 Cistanche A 저용량군으로 나누었다. 그룹(40 μmol/L)과 시스탄체사이드 A 고용량 그룹(160 μmol/L), 각 그룹은 5개의 다중 구멍을 갖추고 있으며, 그 중 3개의 다중 구멍은 소 뼈 조각이 배치되고 나머지 2개의 다중 구멍은 사용되었습니다. 골수 대식세포의 발현을 관찰합니다. 접착제 및 파골세포 형성. 세포가 부착된 후 양성대조군과 시스탄체를

파골세포 분화를 유도하기 위해 모든 그룹에 50ng/mL의 RANKL을 첨가했습니다. Cistancheside A 저용량 및 고용량 그룹에는 개입을 위해 각각 40μmol/L 또는 160μmol/L Cistancheside A를 추가하고 배지는 48시간마다 교체했습니다. 14일 배양 후 소뼈편을 꺼내어 뼈편편물을 PBS로 2회 세척한 후 70% 이소프로필알코올을 첨가하고 고출력 초음파세척을 15분간 첨가하여 남은 세포를 씻어내고 톨루이딘블루(1%,용해)를 첨가한다. 물) 염료 용액을 넣고 실온에서 2초 동안 염색합니다. 1분 후, 뼈 조각을 이중 증류수로 헹구어 잔류 염료를 제거합니다. 염색된 뼈 조각은 실체현미경을 사용하여 관찰하고 사진을 찍었고, Image J 소프트웨어를 사용하여 뼈 흡수 열구의 면적을 계산했습니다.

1.4.7 RT-PCR

세포내 골흡수 기능 및 파골세포 관련 유전자의 발현을 검출하기 위해 골수 대식세포를 6-웰 ​​플레이트에 1.5×105/well로 시딩하고, 각 웰에 배양액 100 μL를 첨가하고, 양성대조군은 Cistanche A 저용량군(40μmol/L)과 Cistancheside A 고용량군(160μmol/L)으로 나누어졌습니다. 양성대조군과 Cistancheside A군 모두 50ng/mL RANKL 유도제를 첨가하였다.

파골세포 분화를 유도하기 위해 저용량 및 고용량 Cistancheside A 그룹에 각각 40 μmol/L 또는 160 μmol/L의 Cistancheside A를 첨가하여 중재했습니다. 배지는 48시간마다 교체되었습니다. 유도 후 3~4일 동안 도립현미경으로 관찰을 수행하였다. 현미경으로 보면 골수 대식세포가 방금 융합된 것이 관찰되었습니다. TRIzol을 첨가하여 세포를 용해하고, 클로로포름을 첨가하고, 얼음 위에 10분간 방치한 후 혼합물을 흡인합니다.

1.5 mL EP 튜브에 각 튜브에 200 μL 클로로포름을 추가하고 15초 동안 흔든 다음 얼음 위에 15분 동안 방치하고 4도, 12 000 r/min에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 취하고 추가합니다. 같은 양의 이소프로필 알코올을 넣고 얼음 위에 놓습니다. 10분간 방치한 후 상등액을 버리고 4도, 120,000 r/min에서 원심분리하고, 무효소수와 부피 분율로 75% 에탄올 용액으로 세척한 후 공기 중에서 건조시켜 얻습니다. 총 RNA. cDNA를 합성하기 위한 역전사용 20μL 시스템을 구성하려면 Prime ScriptTMRT Master 믹스 역전사 키트를 사용하십시오. 그런 다음 키트 지침에 따라 PCR 작업 시스템을 구성하고 형광 정량 PCR 기기에서 검출을 수행합니다. PCR 반응 조건은 다음과 같습니다: 95도에서 5분 동안 사전 변성; 95도에서 10초 동안 변성, 어닐링 및 60도에서 30초 동안 신장, 총 40주기. 프라이머 서열은 표 1에 나와 있습니다.

단순 -MEN 배지를 추가하고 3시간 동안 굶긴 후, Cistancheside A 그룹에도 개입을 위해 160 μmol/L Cistancheside A를 추가했습니다. 단식 종료 후 자극을 위해 각 그룹에 100ng/mL RANKL을 첨가했습니다. 자극 시간은 각각 0, 10, 20, 30, 60분이었다. 자극 시간이 끝나면 배양액을 버리고 미리 냉각된 1×PBS로 3회 세척하였다. 추출된 단백질을 사용하여 p-JNK, JNK 및 -actin 단백질의 발현을 검출했습니다.

단백질 추출이 완료되면 겔 전기영동을 이용해 단백질을 분리하고 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다. 1시간 동안 4도에서 차단을 위해 5% 소 혈청 알부민(BSA)을 추가합니다. Blocking 용액을 버리고 TBST 완충액으로 Membrane을 3회 세척한 후 1차 항체를 첨가합니다. (Nfatc1 항체 1:1000, c-Fos 항체 1:1000, p-JNK 항체 1:1000, JNK 항체 1:1000, -actin 항체 1:1000), 4도에서 14-16시간 동안 배양, 세척 TBST 완충액으로 3회 멤브레인을 3회 처리한 후 2차 항체(m-IgG Fc BP-HRP, 희석비 1:5000)를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양한 후 세척 후 형광 용액을 첨가하고 젤 이미징 시스템에서 현상합니다. Lab 소프트웨어는 획득된 밴드의 회색 값을 분석하고 -actin을 내부 기준으로 사용하여 목적 단백질의 상대적 발현을 계산합니다.

1.5 주요 관찰 지표

① Cistancheside A 개입 후 RANKL에 의해 유도된 파골세포 분화 결과; ② Cistancheside A 개입 후 파골세포 표면에 액틴고리 형성 및 파골세포 골흡수 기능 변화; ③ Cistancheside A 개입 후 파골세포의 핵심 유전자 발현; ④ Cistancheside A 개입 후 JNK/미토겐 활성화 단백질 키나제(MAPK) 경로의 하류 단백질과 p-JNK 단백질의 발현.

1.6 통계분석

GraphPad Prism 9 소프트웨어는 통계 분석 및 그리기에 사용되었습니다. 모든 데이터는 x-±s로 표현되었습니다. 그룹 간 비교를 위해 t 테스트와 일원 분산 분석을 선택했습니다. P < 0.05는 유의차로 정의되었습니다. 이 기사의 통계 방법은 산시 의과대학 통계학과에서 개발했습니다.

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