응고, 프로테아제 활성화 수용체 및 당뇨병성 신장 질환: ENOS가 결핍된 생쥐로부터의 교훈
Feb 02, 2024
내피 산화질소 합성효소(eNOS) 기능 장애는 다음과 같은 질병의 진행과 예후를 악화시키는 것으로 알려져 있습니다.당뇨병 신장 질환(DKD). 이것이 달성되는 메커니즘 중 하나는 낮은 eNOS 수준이 신장 손상을 촉진하는 응고항진성과 연관되어 있다는 것입니다. 외인성 응고 단계에서는 조직 인자(인자 III)와 활성 인자 X(FXa)와 같은 하류 응고 인자가 프로테아제 활성화 수용체(PAR)의 활성화를 통해 염증을 악화시킵니다. 최근에는 진행성 DKD의 모델로서 당뇨병 쥐에서 eNOS 발현이 부족하거나 감소하면 신장에서 신장 조직 인자 수준과 PAR1 및 2 발현이 증가하는 것으로 나타났습니다. 또한 응고 인자 또는 PAR의 약학적 억제 또는 유전적 삭제염증 완화eNOS가 결핍된 생쥐의 DKD에서. 이 리뷰에서는 eNOS, 응고 및 PAR 간의 관계를 요약하고 DKD 환자 관리를 위한 새로운 치료 옵션을 제안합니다.
키워드:당뇨병성 사구체경화증; 인자 Xa;염증; 조직 인자
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소개
환자 수당뇨병 신장 질환(DKD)는 전 세계적으로 증가하고 있습니다(de Boer 외. 2011; Kainz 외. 2015; Ogurtsova 외. 2017). DKD는 당뇨병 합병증이 있는 환자의 주요 사망 원인 중 하나입니다(Afkarian et al. 2013). 더욱이, DKD는 진행성이며 신장 대체 요법이 필요한 말기 신장 질환의 주요 원인입니다(Gregg et al. 2014; Liyanage et al. 2015). 일본에서는 당뇨병성 신장병이 신규 투석 환자의 39% 이상을 차지합니다(Nitta et al. 2020). 따라서 개발은새로운 치료법DKD 환자를 관리하려면 옵션이 필요합니다.
DKD 발병기전의 시스템. 응고항진성은 DKD와 관련이 있습니다(Goldberg 2009; Domingueti et al. 2016). 혈액 내 피브리노겐 수치 증가는 낮은 추정 사구체 여과율, 높은 단백뇨 및 심각한 조직학적 손상과 관련이 있는 것으로 나타났으며, 이는 말기 신장 질환으로의 진행을 예측하는 인자였습니다(Dalla Vestra et al. 2005; Pan et al. al. 2018; Zhang 외 2018). 일부 연구에서는 DKD의 섬유소 분해 산물인 D-이량체 수준과 신장 기능 장애 사이의 상관관계를 보여주었습니다(Domingueti et al. 2018; Pan et al. 2018). DKD의 응고항진성은 여러 요인에 의해 결정될 가능성이 높습니다. 예를 들어, 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템은 조직 인자(TF, 인자 III)를 활성화하고 혈전증을 증가시킵니다(Dielis et al. 2005). 그렇지 않으면 고혈당증, 이상지질혈증, 염증 또는 내피 기능 장애가 DKD 발병 기전 하에서 혈전 형성 상태에 관여합니다(Goldberg 2009).
미세혈관 합병증으로 진행되는 DKD에는 내피 기능 장애가 존재합니다(Goldberg 2009; Nakagawa et al. 2011). 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 생성 장애 또는 eNOS 활성 감소(예: eNOS 인산화 장애)는 DKD의 내피 기능 장애의 특징입니다(Nakagawa et al. 2011; Cheng et al. 2012). 우리는 eNOS 발현의 상실이 TF 수준의 상승 및 외인성 응고 시스템 활성과 연관되어 있음을 보여 주었습니다(Li et al. 2010; Wang et al. 2011a). 이는 만성 신장 환자의 혈전증 사건과 밀접하게 연관되어 있습니다. 질병(Kolachalama et al. 2018).
혈전증 발생 위험이 증가할 뿐만 아니라, 외인성 응고 단계에 존재하는 활성 인자 FVII(FVIIa), 활성 인자(FXa) 및 트롬빈과 같은 응고 프로테아제는 프로테아제 활성화 수용체를 통해 조직 손상을 매개합니다. PAR) 의존 메커니즘(Madhusudhan et al. 2016; Posma et al. 2019). 이 리뷰에서는 eNOS가 결여된 당뇨병 쥐에서 얻은 결과를 요약하고 응고-PAR 경로, eNOS 수준 및DKD 발병기전.
조직 인자/프로테아제 활성화 수용체 경로
인자 III으로 알려진 조직 인자(TF)는 인자 VII(FVII)와 상호작용하는 47 kDa 막횡단 단백질입니다(Grover and Mackman 2018). TF/FVIIa 복합체는 외인성 응고 캐스케이드의 활성화제이며 FX 및 FIX의 활성화를 촉매합니다. FXa와 활성화된 보조 인자 V(FVa)는 트롬빈을 생성하는 혈전 생성 복합체를 형성합니다. 마지막으로 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 전환하여 혈전을 형성합니다(Grover and Mackman 2018). TF는 혈관 평활근 세포와 외막 섬유아세포 모두에서 발현됩니다. 염증 조건 하에서 내피 세포 또는 단핵구와 같은 순환 세포에서 그 발현이 유도됩니다(Østerud and Bjørklid 2006).
프로테아제 활성화 수용체(PAR)는 4개의 PAR 단백질(PAR1-4)로 구성된 G 단백질 결합 수용체 수퍼패밀리의 구성원입니다. PAR은 N-말단 끝에서 프로테아제에 의해 절단되고, 묶인 리간드를 포함하는 새로운 N-말단에 결합하면 활성화됩니다. PAR의 4가지 구성원(PAR1-4)은 특정 응고 프로테아제에 의해 활성화됩니다. TF와 FVIIa 복합체는 PAR2를 활성화하고 Xa 인자는 PAR1과 PAR2를 모두 활성화하며 트롬빈은 PAR1, PAR3 및 PAR4를 활성화합니다(Camerer et al. 2000; Coughlin 2005; Rothmeier 및 Ruf 2012; Zhao 외 2014). TF, 응고 프로테아제 및 PAR 사이의 관계는 그림 1에 나와 있습니다.
PAR은 신장 세포에서 광범위하게 발현되는 것으로 알려져 있으며 신장 손상의 병태생리학에 관여합니다. PAR1과 PAR2는 모두 인간이나 마우스에서 유래한 사구체 내피 세포, 메산지움 세포, 신장 관형 세포에서 발현됩니다. PAR2, PAR3 및 PAR4는 인간 족세포에서 발현됩니다. PAR1, PAR3 및 PAR4는 쥐의 족세포에서 발현됩니다(Tanaka et al. 2005; Vesey et al. 2005; Madhusudhan et al. 2012; Dong et al. 2015; Madhusudhan et al. 2016).
PAR의 유해하거나 보호적인 효과는신장 손상입증되었으며, 축적된 데이터에 따르면 PAR은 사이토카인과 케모카인의 생성을 자극하여 염증을 악화시키는 것으로 나타났습니다(Rothmeier and Ruf 2012; Isermann 2017; Posma et al. 2019). 이러한 발견과 일치하게, PAR1 및 PAR2 작용제는 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP1) 및 플라스미노겐 활성화 인자 억제제-1(PAI-1)와 같은 염증 매개체 및 내피 세포의 전섬유화 분자의 발현을 촉진합니다. , 간질 및 신장 관형 세포(Vesey et al. 2005; Vesey et al. 2013; Ellinghaus et al. 2016; Waasdorp et al. 2016; Oe et al. 2019). 생체 내 연구에서 PAR1의 부족 또는 PAR1 억제제의 존재는 초승달 사구체신염 또는 폐쇄성 신장 손상 모델에서 염증을 감소시켰습니다(Cunningham et al. 2000; Waasdorp et al. 2019; Lok et al. 2020). 마찬가지로, 신장 손상에 대한 PAR2 억제의 치료 효과에는 다음이 동반되었습니다.염증 감소신장에서(Hayashi 외 2016; Du 외 2017; Han 외 2019; Watanabe 외 2019)
DKD의 내피 산화질소 합성효소 다형성
내피 산화질소 합성효소(eNOS)는 세 가지 NOS 동형체 중 하나이며 혈관 내피에서 NO 생성에 기여합니다(Walford and Loscalzo 2003). 혈관 내피에서 eNOS에 의해 생성된 NO는 혈관 이완 조절, 항염증 및 혈전 형성 예방에 중요한 역할을 합니다(Walford and Loscalzo 2003). 손상된 eNOS 발현은 DKD의 발생과 관련이 있습니다. 최근 인간을 대상으로 실시된 메타 분석에서는 eNOS(NOS3) 유전자의 G894T(rs1799983), C-786T(rs2070744) 및 인트론 4b/4a(rs{10}})가 DKD 개발(Dellamea et al. 2014; Zhang et al. 2015; Dong et al. 2018). 이러한 변종 중에서 eNOS 기능에서 G894T(Glu298Asp) 다형성의 역할은 잘 특성화되어 있습니다. 298Glu를 사용한 세포와 비교하여 298Asp를 사용한 형질감염된 CHO 세포에서 NO 생성 또는 아질산염 축적의 감소가 나타났습니다(Noiri et al. 2002). 종합적으로, 이러한 결과는 eNOS 기능 장애에 의한 NO 생산 감소가 인간의 DKD 진행에 중요하다는 것을 나타냅니다.
인간 당뇨병성 신장병의 모델로서 eNOS가 결여된 당뇨병 마우스
인간 DKD와 유사한 신뢰할 수 있는 전임상 모델의 확립은 새로운 치료 옵션을 연구하는 데 필수적입니다. eNOS 다형성과 DKD 사이의 연관성을 보여주는 증거에 기초하여, 많은 연구에서 유형 I 및 유형 II DM의 eNOS 녹아웃 모델이 인간 DKD를 모방한 성공적인 모델 중 일부라는 것이 입증되었습니다(Brosius et al. 2009; Azushima et al. al.2018). eNOS가 결여된 스트렙토조토신에 의해 유도된 당뇨병 쥐는 인간 DKD와 유사한 심각한 알부민뇨, 혈관간 확장, 사구체 기저막의 비후, 세동맥 유리질증을 발생시키는 것으로 나타났습니다(Nakagawa et al. 2007). 유사하게, eNOS가 결여된 제2형 당뇨병 쥐(db/db)는 심각한 사구체 경화증과 알부민뇨를 나타냈습니다(Zhao et al. 2006).
eNOS가 결핍된 당뇨병 쥐의 TF 증가
NO는 혈전 형성과 혈소판 응집을 억제합니다(Walford and Loscalzo 2003). eNOS가 결여된 당뇨병 쥐에서 사구체 혈전 형성이 관찰되었기 때문에(Nakagawa et al. 2007), 손상된 eNOS 발현은 TF 의존성 응고의 증가와 연관될 가능성이 높습니다. DKD에서 eNOS와 TF 사이의 연관성은 이전 보고서(Li et al. 2010; Wang et al. 2011a; Oe et al. 2016)에서 다루어졌습니다(그림 2).
eNOS 발현의 감소 또는 부족은 당뇨병 아키타 마우스에서 신장 TF 활성을 증가시킵니다. 우리는 다양한 발현 수준의 eNOS(eNOS+/+, eNOS+/-)를 갖는 I형 DM 모델인 당뇨병 아키타(Ins2Akita/+) 마우스에서 TF 발현을 특성화했습니다. 및 eNOS-/-)(Wang et al. 2011a). 우리는 DKD의 심각도가 eNOS 발현 감소와 관련이 있음을 발견했습니다. 요중 알부민 배설, 사구체 경화증, 사구체 여과율 감소는 다음 순서로 악화되었습니다: eNOS+/+; Ins2Akita/+ < eNOS+/-; Ins2Akita/+ < eNOS-/-; Ins2Akita/+. 흥미롭게도 신장 TF 발현 및 활성은 eNOS+/-에서 증가했습니다. Ins2Akita/+ 및 eNOS-/-; Ins2Akita/+ 마우스와 eNOS+/+의 마우스 비교; Ins2Akita/+ 마우스. 사구체 피브린 침착은 eNOS+/-에서도 현저했습니다. Ins2 Akita/+ 및 eNOS-/-; Ins2 Akita/+ 마우스. 또한, 신장 Tf mRNA 발현은 질병 중증도, 요중 알부민 배설 및 상관관계가 있었습니다.신장 염증성사이토카인 발현.
고지방식이와 eNOS 부족은 당뇨병 쥐의 TF를 상승적으로 증가시킵니다.
많은 연구에서 비만과 혈전증 사이의 연관성이 입증되었습니다(Samad 및 Ruf 2013). 예를 들어, 대사 질환 상태에서 TLR{1}}NF-kB 경로의 상향 조절은 TF 수준을 증가시킵니다(Lv et al. 2009; Owens et al. 2012; Rogero and Calder 2018). 더욱이, 포화 지방산 팔미테이트는 ROS 및 JNK 경로 의존 메커니즘과 세포외 히스톤을 통해 히스톤 H3 방출을 유도하여 단핵구에서 TF 발현을 증가시킵니다(Shrestha et al. 2013). 응고, eNOS 및 이상지질혈증 사이의 관계에 초점을 맞춘 우리의 이전 연구에서는 eNOS 결핍과 고지 방식이 TF 발현에 미치는 결합 효과를 입증했습니다(Li et al. 2010). 해당 연구에서는 eNOS가 없는 쥐에게 저용량 STZ를 투여하여 DM을 발병시키고 고지 방식을 먹였습니다. eNOS 발현의 부족은 요중 알부민 배설과 조직학적 손상을 증가시켰으며, 이는 고지방식으로 인해 더욱 악화되었습니다. TF의 발현과 활성은 eNOS 발현 부족과 고지방 식이요법으로 인해 시너지 방식으로 마우스 신장에서 증가했습니다. 흥미롭게도, 면역반응성 TF 수준의 증가는 사구체 단핵구/대식세포 마커를 이용한 공동 국소화 실험에 의해 입증되었습니다.
TF에 대한 항체 중화는 eNOS 녹아웃 마우스의 당뇨병 신장 염증을 개선합니다
TF 의존성 응고의 증가는 염증 증가와 관련이 있습니다(Witkowski et al. 2016). TF 의존성 응고 시스템의 억제가 개선되었습니다.염증성 질환, 예를 들어 LPS 유발 패혈증(Pawlinski et al. 2010). DKD에서 염증과 TF 사이의 인과 관계를 밝히기 위해 우리는 eNOS가 결핍된 마우스에서 당뇨병 신장 염증에 대한 TF에 대한 중화 항체의 단기 효과를 조사했습니다(Li et al. 2010). 결과는 항-TF 항체의 투여가 TF 중화 4일 후 마우스 신장에서 Tnfa, Ccl2, Tgfb 및 Col4 mRNA와 같은 염증 및 섬유증 관련 유전자의 신장 발현 수준을 현저하게 감소시키는 것으로 나타났습니다.
응고 FXa 억제제는 eNOS가 결여된 당뇨병 쥐의 신장 손상을 개선합니다
TF/VIIa의 하류에 위치한 응고 FXa도 PAR 의존 경로를 통해 염증에 기여합니다. DKD에서의 역할은 여러 동물 모델에서 입증되었습니다. Sumiet al. (2011)은 FXa 억제제인 폰다파리눅스(fondaparinux)가 db/db 마우스에서 요중 단백질 수준, 사구체 비대 및 섬유소 침착을 감소시킨다는 것을 입증했습니다. eNOS가 결여된 DKD 마우스에서 FXa 억제의 치료 효과가 우리 그룹에 의해 입증되었습니다(Oe et al. 2016). 경구 FXa 억제제인 Edoxaban(50mg/kg/일)을 eNOS-/-에 투여했습니다. Ins2Akita/+ 마우스를 3개월 동안 투여한 결과 혈관간 기질 증식과 같은 조직학적 손상이 개선된 것으로 나타났습니다. 신장의 염증성 유전자의 발현 수준은 edoxaban에 의해 감소되었습니다 (표 1). FXa는 PAR1과 PAR2를 모두 활성화합니다. FXa 매개 신장 손상의 메커니즘을 밝히기 위해 우리는 FXa 억제제의 항염증 효과가 PAR2-/- 마우스 및 FXa 억제제를 사용하는 PAR2-/- 마우스에서 발견된 것과 유사하다는 것을 입증했습니다. . 이러한 발견은 FXa가 DKD에서 PAR{17}}의존 메커니즘을 통해 염증을 유발할 가능성이 있음을 시사합니다. 대조적으로, edoxaban은 eNOS+/+에서 사구체 손상을 개선하지 못했습니다. Ins2Akita/+ 마우스는 FXa 억제의 치료 효과가 I형 당뇨병 마우스의 eNOS 의존성 과다응고성과 연관되어 있음을 시사합니다.
DKD의 기타 응고 인자
트롬빈은 혈관 염증을 진행시키는 PAR1을 표적으로 하기 때문에(Chen and Dorling 2009), 트롬빈은 DKD를 악화시킬 가능성이 있습니다. 그러나 DKD 발병기전에서 트롬빈의 보호적 또는 유해한 역할이 입증되었습니다. 저용량 트롬빈(50pM)은 예방한 반면, 고용량 트롬빈(20nM)은 족세포에서 포도당 유발 세포사멸을 악화시켰습니다(Wang et al. 2011b). eNOS가 결여된 당뇨병 쥐에 대한 다비가트란과 같은 트롬빈 억제제의 효과는 향후에 밝혀져야 합니다.
피브리노겐은 다양한 염증 상태에 관여합니다. 흥미롭게도, 부분적인 감소 또는 피브리노겐의 부재는 신장 허혈-재관류 모델 또는 폐쇄성 신장 섬유증에 유익했습니다(Sörensen et al. 2011; Craciun et al. 2014). eNOS가 결여된 당뇨병 쥐에서 사구체 피브린 침착이 증가하기 때문에(Nakagawa et al. 2007; Li et al. 2010; Wang et al. 2011a), DKD 발병기전에서의 역할을 밝히는 것은 추가 연구가 필요합니다.
eNOS가 결여된 당뇨병 마우스에서 PAR1 및 PAR2의 발현
PAR의 발현 증가는 신장 손상과 관련이 있습니다. 우리와 다른 사람들은 당뇨병성 신장병증, 에이드나인 유발 신장 손상, 폐쇄성 신장 섬유증 및 시스플라틴 유발 신장 손상이 있는 동물 모델에서 Par1 및/또는 Par2 mRNA의 발현 수준이 증가했음을 입증했습니다(Chung et al. 2013; Hayashi 외 2016; Oe 외 2016; Watanabe 외 2019). 더욱이, 제2형 당뇨병 모델인 db/db 마우스에서 사구체 PAR2 단백질 수준이 증가했습니다(Sumi et al. 2011). 우리는 당뇨병 쥐에서 PAR 발현과 eNOS 결핍 사이의 연관성을 입증했습니다(Oe et al. 2016). Par1 mRNA의 발현 수준은 eNOS-/-에서 유의하게 더 높았습니다. eNOS-/-보다 Ins2Akita/+ 마우스; Ins2Akita/+ 및 비DM 마우스. 마찬가지로, Par2의 발현은 eNOS-/-에서 상당히 높았습니다. Ins2Akita/+ 마우스는 비 DM 마우스보다 대조적으로, Par4 mRNA 수준은 유전자형 간에 차이가 없었습니다. eNOS의 부족은 DKD에서 염증을 악화시킵니다(Wang et al. 2011a). 전염증성 사이토카인이 PAR을 증가시키는 것으로 보고되었기 때문에(Nystedt et al. 1996), eNOS 부족으로 인한 염증 증가는 DKD에서 신장 Pars 발현을 유도할 가능성이 높습니다. 종합적으로, 우리의 연구 결과는 eNOS가 부족한 당뇨병 신장에서 TF의 경우와 유사하게 PAR1과 PAR2의 발현 수준이 증가함을 시사했습니다 (그림 2).
PAR2 삭제로 eNOS가 감소된 생쥐의 당뇨병성 신장 손상 개선
우리와 다른 사람들은 이전 연구에서 DKD에서 PAR2의 역할을 다루었습니다. Par2 결실은 eNOS가 있는 당뇨병 야생형 Akita 마우스(Ins2Akita/+)에서 사구체 손상에 영향을 미치지 않았습니다(Oe et al. 2016). 더욱이, PAR2가 결여된 STZ 유발 당뇨병 쥐는 당뇨병 야생형 쥐에 비해 알부민뇨가 감소했지만 혈관간 확장은 증가한 것으로 나타났습니다(Waasdorp et al. 2017). 종합적으로, 이들 결과는 DKD의 초기 및 경증 모델에서 신장 손상에 대한 PAR2 억제의 치료 효과가 없거나 경미하다는 것을 입증합니다. 대조적으로, 우리는 eNOS(eNOS+/-; Ins2Akita/+)의 발현이 감소된 당뇨병 아키타 마우스에서 DKD에 대한 PAR2 결핍의 영향을 입증했습니다(Oe et al. 2016). PAR2의 결핍은 요중 알부민 배설 수준, 혈관간 확장 및 GBM 두께를 크게 감소시켰습니다. Tnfa, Tgfb 및 Col4를 포함한 전염증성 및 섬유증 관련 유전자의 발현 수준도 마우스 신장에서 감소했습니다. 이러한 결과는 PAR2가 초기가 아니라 eNOS 결핍으로 인한 비교적 진행된 당뇨병 사구체 손상에서 병원성이 있음을 시사합니다 (표 1).
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