SARS-CoV-2에 대한 잠재적인 다중 표적 생체 활성 화합물에 대한 벤잘아세토페논 유도체의 전산 조사 Ⅱ
Jun 26, 2023
3.7.2. 3CLpro-carmofur 복합체의 안정성
복잡한 3CLpro-carmofur는 평형 기간(60ns) 이후 150ns의 시뮬레이션 동안 안정적인 역학을 보여주었습니다. 백본 및 복합체의 평균 RMSD 값은 각각 2.34Å 및 2.81Å이었습니다. N 및 C-말단 잔류물은 최대 잔류 변동(~10Å)을 보였다. 그러나 안정적이고 보존된 비결합 상호작용에 관여하는 잔류물은 상대적으로 훨씬 적은 변동(~2.0Å)을 보였다. Rg 값은 ~30ns 동안 폴딩 패턴을 나타냈습니다(그림 10) 안정한 리간드 결합을 나타내는 부분 전개를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, 3CLpro와 carmofur docked complex가 점유한 초기 및 최종 평균 표면적은 각각 145.97 nm2 및 148.49 nm2인 것으로 관찰되었다. 복합체가 차지하는 평균 소수성 표면적은 148.32 nm2로 단백질 풀림과 바인딩 포켓의 유연성을 나타냅니다. 보충 동영상(S2)은 3CLpro에 대한 carmofur의 자세한 바인딩 모드와 안정적인 역학을 나타냅니다. 이 단지는 6 안정을 형성했습니다.H-이 중 4개의 결합은 시뮬레이션 전체에서 일관되었습니다. 이러한 안정적인H-결합 상호작용은 안정적인 복합체 형성을 촉진합니다. 복합 3CLpro-carmofur 복합물의 추정된 상대 결합 에너지는− 16.67kcal/몰. 또한 결합 에너지에 기여하는 주요 잔기들은 잔기별 분해 에너지를 계산하여 확인하였다. 잔류물Thr25 (목스25), 메트49, Cys142, Met165, Leu167, Arg188,그리고글렌189안정적인 복합체 형성을 선호했습니다. 다만, 잔류물Asn142그리고Glu166상호 작용을 선호하지 않았습니다. 이들 잔류물 중에서,메트165기여 에너지가 가장 적기 때문에 결합 에너지에 상당한 기여를 보였다(− 9.12kJ/mol). 그러나 다른 상호 작용하는 잔류물에 대한 기여 에너지는− 1.42 ~− 5.601 kJ/mol로 안정한 착화합물 형성에도 관여하였다.
3.7.3. PLpro - 4-hydroxycordoin(c30) 복합체의 안정성
PLpro–4-hydroxycordoin(c30) 복합체는 150ns 동안 안정적인 동역학 및 유사한 추세를 보여주었습니다. RMSD 값은 백본과 복합체에 대해 각각 ~1.2~1.5Å 및 ~1.8~2.2Å에서 ~80ns까지 안정적이었습니다. ~80ns 후, RMSD는 단백질의 표면적 증가로 인해 상대적으로 더 높은 것으로 나타났습니다(각각 ~1.5–2.3Å 및 ~2.2~3.5Å). C에 대해 플로팅된 잔류 변동은 4-하이드록시코르도인(c30), 즉 Val203, Met207, Tyr208, Met209, Ile223, Pro224 및 Pro248에서 관찰된 변동이 다른 잔류물과 비교하여 잔류물에서 안정한 비결합 접촉의 형성을 나타냈습니다. 비 상호 작용 잔류 물. Rg 값은 Rg 값의 꾸준한 감소에 의해 밝혀진 바와 같이 조밀한 구형을 형성함으로써 MD 시뮬레이션 동안 안정적인 착물 형성을 보였다. 보충 동영상(S3)은 4-hydroxycordoin(c30)과 PLpro의 바인딩 모드를 보여줍니다. 두 시트 사이의 잔기에 의해 형성된 루프는 결합 포켓에 가깝고 분자와 최대 접촉을 갖는 것으로 관찰되었습니다. 그러나 이 루프의 유연한 특성으로 인해 ~85ns 이후 MD 시뮬레이션 동안 SASA 및 리간드 이동이 증가하는 바인딩 포켓이 열리는 것을 보여주었습니다. PLpro 및 4-hydroxycordoin(c30) 도킹 복합체가 차지하는 초기 및 최종 표면적은 각각 169.50 nm2 및 170.29 nm2였습니다. 복합체가 차지하는 평균 표면적은 170nm2이었다. 착물은 2개가 일치하는 3개의 H-결합을 형성하였다. 4- hydroxycordoin(c30)과 PLpro의 결합 친화력은 상대 결합 에너지를 계산하여 추정했습니다. 복합체는 -16.28 kcal/mol의 결합 에너지를 나타냈다. 결합 에너지에서 개별 잔기의 기여에 대한 더 많은 구조적 통찰력을 얻기 위해 잔기 분해 에너지를 분석했습니다. 7개의 잔기가 안정한 복합체 형성에 상당히 기여하고 기존의 비결합 상호작용, 즉 Val203, Met207, Tyr208, Met209, Ile223, Pro224 및 Pro248을 선호하는 것으로 관찰되었다(도 11). 가장 중요한 것은 Tyr208, Met209, Ile223 및 Pro224 잔기가 각각 -2.97, -3.89, -3.82 및 -2.91kJ/mol의 가장 낮은 기여 에너지를 기록함으로써 결합 친화도에 상당한 기여를 한다는 점입니다. 이 기사와 관련된 보충 비디오는 https://d oi.org/10.1016/j.compbiomed.2022.105668에서 찾을 수 있습니다.
3.7.4. PLpro-GRL-0617 복합체의 안정성
PLpro-GRL-0617 복합체는 안정적이었고 최대 120ns까지 유사한 RMSD 값을 나타냈습니다. 백본에 대한 RMSD 값은 ~1.3Å에서 ~3.0Å 범위이고 복합체에 대해 ~1.8Å에서 ~4.5Å 범위입니다. 백본 RMSD 값의 꾸준한 감소는 ~120 ns(~3.{{20}} Å에서 2.0 Å) 후에 관찰되었으며 전체 기간 동안 안정적으로 유지되었습니다. MD 시뮬레이션 기간(150ns). 마찬가지로 복잡한 RMSD 값은 ~4.5Å에서 ~3.0Å 범위의 RMSD 값에서 비슷한 꾸준한 감소를 보였습니다. ~120ns 후 RMSD 값은 150ns까지 3.8Å까지 추가로 증가했습니다. Gly164, Asp165, Thr211, Leu212, Asn216, Ile223, Ala247, Pro248 및 Tyr265의 잔류 변동은 다른 상호작용하지 않는 잔류물에 비해 상대적으로 적었다. Cys225, Val226 및 Cys227은 국소 유연성 증가로 인해 최대 6Å까지 최대 잔류 변동을 보였지만 시뮬레이션 중에 리간드 상호 작용이 관찰되었습니다. 또한, Rg 값은 ~70ns까지 안정한 착물 형성을 보였다. 또한 리간드 바인딩 포켓 "Lys158에서 Val166"에 인접한 루프 영역의 유연성으로 인해 다른 바인딩 포켓을 향한 리간드 이동이 관찰되었습니다(보충 영화 S4). 이는 Rg 값 ~70의 증가로도 입증되었습니다. ns. 또한 GRL-0617은 안정적인 Rg 패턴에 의해 지원되는 150ns MD 시뮬레이션 전체에서 안정적인 비접착 접촉을 형성했습니다. 처음에 SASA는 유연한 바인딩 포켓과 향상된 SASA 값을 보여주었습니다. 이로 인해 리간드 GRL- 0617의 재배향이 트리거되었을 수 있습니다. PLpro 및 GRL- 0617 도킹 복합체가 차지하는 초기 및 최종 표면적은 각각 164.32 nm2 및 162.263 nm2로 기록되었습니다. 복합체가 차지하는 평균 표면적은 165.02nm2이었다. 유사하게, 증가된 SASA 값은 결합 포켓 잔기의 유연한 성질로 인해 주로 선호되는 안정한 복합체 형성을 위한 결합 포켓 개방을 나타냈다. 복합체는 시뮬레이션 기간 동안 2개의 H-결합이 일치하는 4개의 H-결합을 형성했습니다. 또한, PLpro-GRL-0617 복합체는 -11.83 kcal/mol의 결합 에너지를 나타내었다. 또한, 결합 에너지에서 개별 잔기의 기여도에 대한 구조적 통찰력은 잔기당 분해 에너지를 계산하여 정량화되었습니다. 9개의 잔기가 안정한 복합체 형성에 상당한 기여를 하고 기존의 비결합 상호작용, 즉 Thr211, Leu212, Asn216, Ile223, Cys225, Val226, Cys227, Ala247 및 Pro248을 선호하는 것으로 관찰되었다(도 12). 가장 중요한 것은 잔기 Ile223, Cys225, Val226 및 Cys227이 각각 - 0.91, - 0.74, - 1.86 및 - 1.08 kJ/mol의 가장 낮은 기여 에너지를 기록함으로써 결합 친화도에 상당한 기여를 나타냈습니다. .
이 기사와 관련된 보충 비디오는 https://d oi.org/10.1016/j.compbiomed.2022.105668에서 찾을 수 있습니다.
그림 5. 세포 성분, 분자 기능 및 생물학적 과정을 나타내는 벤잘아세토페논 유도체에 의한 조절 단백질의 GO 분석.
3.7.5. 스파이크 단백질의 안정성 - 말로토필리펜 D(c42) 복합체
스파이크 단백질-말로토필리펜 D(c42) 복합체는 다른 연구된 복합체와 유사하게 100ns의 평형 기간 후에 안정적인 역학을 보였다. RMSD 값은 백본 및 복합체에 대해 각각 ~1.2Å ~ 3Å 및 1.8Å ~ ~4Å 사이에서 다양했습니다. 이 복합체가 100ns 후에 평형 상태에 도달함에 따라 시뮬레이션은 200ns로 추가로 확장되었습니다. 관찰된 평균 백본 및 복잡한 RMSD 값은 각각 ~2.6Å 및 ~3.8Å이었습니다. C에 대해 플로팅된 잔류 변동은 다른 비상호작용 잔류물과 비교하여 말로토필리펜 D(c42)와의 비결합 접촉에 참여하는 잔류물에 대해 더 적은 변동을 나타냈다. 그러나 잔기 Alal344-Trp353 및 Glu516-Thr523에 의해 형성된 유연한 루프 영역은 매우 역동적이었고 더 높은 변동(~3Å)을 보였습니다. Phe342, Leu368 및 Ile434를 포함하여 리간드-단백질 상호 작용에 적극적으로 관여하는 잔기는 변동이 가장 적었습니다(보충 영화 S5). 또한, MD 시뮬레이션 동안 안정한 복합체가 형성되었고 10ns 후 Rg 값의 감소에 의해 밝혀진 바와 같이 조밀한 구형을 확립했습니다. 이 복합체는 리간드와 단백질 사이에 안정한 복합체를 형성하는 데 필요한 적절한 폴딩을 나타내는 100ns 후 안정적인 Rg 값을 따랐습니다. 스파이크 단백질과 말로토필리펜 D(c42) 도킹 복합체가 차지하는 초기 및 최종 표면적은 각각 112.38 nm2 및 112.6 nm2이었다. 복합체가 차지하는 평균 표면적은 111.4nm2이었다. 보충 영화(S5)는 스파이크 단백질과 함께 말로토필리펜 D(c42)의 상세한 결합 모드를 보여줍니다. 이 복합체는 6개의 H-결합을 형성했으며 그 중 3개는 일치했습니다. 스파이크 단백질에 대한 말로토필리펜 D(c42)의 결합 친화도는 상대 결합 에너지를 계산하여 추정하였다. 또한 결합에너지는 -34.10 kcal/mol로 나타났다. 또한, 잔기당 기여도 에너지는 Phe342, Ala363, Asp364, Tyr365, Leu368, Leu371, Ala372, Phe374, Ile434, Trp436, Val511 및 Leu513과 같은 결합 포켓으로부터의 12개 잔기가 안정한 복합체 형성에 크게 기여한다는 것을 보여주었다(도 1b). 13). 바인딩 포켓의 잔기 Phe342, Leu368, Ile434 및 Trp436은 각각 -5.78, -9.39, -4.71 및 -4.20 kJ/mol의 최소 잔기 분해/기여 에너지를 기록함으로써 결합 친화도에 상당한 기여를 나타냈습니다.
그림 7. 예측항바이러스 스펙트럼여러 바이러스에 대한 벤잘아세토페논 유도체의 벤잘아세토페논 유도체의 대부분이 헤르페스 바이러스(12.57%)에 대해 활성이 있고 트라코마(0.57%)에 대해 가장 적게 활성인 것으로 예측되었습니다.
3.7.6. 스파이크 단백질의 안정성 - DRI-C23041 복합체
스파이크 단백질-DRI-C23041 복합체도 스파이크 단백질 말로토필리펜 D(c42) 복합체와 유사하게 100 ns의 평형 기간 이후에 안정적인 동역학을 보였다. 초기에 백본 및 복합 RMSD 값은 백본 및 복합에 대해 각각 ~1.8Å에서 5Å 및 ~2Å에서 ~5.1Å으로 점차 증가했습니다. 잔기 Val367, Leu368, Asp339, Asp364, Asp389 및 Leu441은 DRI-C23041과 안정적인 비결합 상호작용에 참여하기 때문에 변동이 상대적으로 적었습니다(~4.0Å). 잔기 Ala475 내지 Asn487에 의해 형성된 유연한 루프는 최대 잔차 변동(~11.0Å)을 나타냈다. 또한, ~18 Å의 일정한 Rg 값에 의해 안정한 복합체가 형성되었습니다. 또한, Rg 값이 19.5Å으로 증가한 것으로 입증된 복합체의 부분 전개 시 약 ~63ns에서 리간드의 반시계 방향 회전이 관찰되었습니다(보충 영화 S6). 그러나, 리간드는 원래의 위치를 되찾고 안정적인 형태를 차지했으며, 복합체는 Rg 값이 18.3Å으로 감소하여 조밀한 구형 모양을 형성했습니다. 리간드의 이러한 구조적 전이는 150ns MD 시뮬레이션 동안 안정적인 착물 형성을 선호했습니다. 스파이크 단백질과 DRI-C23041 도킹 복합체가 차지하는 초기 및 최종 표면적은 109.379 nm2 및 107.334 nm2이었다. 복합체가 차지하는 평균 표면적은 110.57nm2이었다. 이 복합체는 4개의 H-결합을 형성했으며 그 중 2개는 일치했습니다. 스파이크 단백질에 대한 DRI-C23041 간의 상대적인 결합 에너지는 -3.10 kcal/mol인 것으로 밝혀졌다. 잔기당 기여 에너지는 결합 포켓으로부터 11개의 잔기, 즉 Asp339, Glu340, Asp364, Asp389, Asp398, Asp405, Glu406, Asp427, Asp428, Asp442 및 Glu516이 안정한 복합체 형성에 크게 기여한다는 것을 밝혀냈고(도 14), 이들 잔류물은 각각 - 11.90 kJ/mol에서 - 27.17 kJ/mol까지 변화하는 잔류물 분해/기여 에너지당 최소 점수를 기록했습니다.
3.7.7. 주성분 및 동적 교차 상관 행렬
우리는 150ns MD 시뮬레이션, 즉 5개의 복합체에 대해 100-150ns, 스파이크 단백질-말로토필리펜 D 복합체에 대해 150-200ns에서 얻은 안정적인 궤적에서 나타나는 형태적 유연성과 형태의 다양성을 탐구하기 위해 주성분 분석을 수행했습니다. 최대 집합 동작은 처음 10개의 고유 벡터/주요 구성 요소에 의해 캡처됩니다. 따라서 처음 두 개의 고유 벡터/PC(주요 구성 요소)를 자세히 자세히 연구했습니다. 그림 15는 처음 두 고유 벡터의 2D 투영을 나타냅니다. 본 연구에서 사용된 표준 분자, 즉 3CLpro, PLpro 및 스파이크 단백질을 각각 표적으로 하는 Carmofur, GRL-0617 및 DRI-C23041은 시뮬레이션 동안 더 큰 형태의 다양성을 나타내는 것으로 관찰되었습니다(빨간색 선으로 표시됨). 15A–C) 그러나 선택된 리간드, 즉 3'-(3-methyl-2-butenyl)-4' -O- -D-glucopyr anosyl{{22} 3CLpro, PLpro 및 스파이크 단백질을 표적으로 하는 },2'-dihydroxychalcone, 4-hydroxycordoin 및 mallotophilippen D는 각각 시뮬레이션 동안 형태의 다양성이 덜한 것으로 나타났습니다. 이는 3'-(3-methyl-2-butenyl)-4' -O- -D-glucopyranosyl-4,2' -dihydroxychalcone과 3CLpro, 4-PLpro가 포함된 하이드록시코르도인과 스파이크 단백질이 포함된 말로토필리펜 D는 시뮬레이션 동안 잘 평형화되고 안정화되었습니다. 또한, 복합체(표준 분자)가 차지하는 더 큰 형태 공간은 다양한 형태의 최대 수로 더 높은 형태 유연성을 나타냈다. 흥미롭게도, 화합물 3'-(3-methyl-2-butenyl)-4' -O- -D-glucopyranosyl-4,2' -dihydroxychalcone, {{ 51}}3CLpro, PLpro 및 스파이크 단백질을 포함하는 하이드록시코르도인 및 말로토필리펜 D는 각각의 대조군/표준에 비해 상대적으로 훨씬 적은 형태 공간을 차지했습니다. 따라서 우리는 스크리닝된 분자가 표준 약물보다 더 효과적일 수 있다고 제안합니다(그림 15D-F).
복합체에서 관찰된 C 원자의 동적 교차 상관은 리간드 결합 도메인의 집합적 움직임에 대한 더 많은 구조적 통찰력을 얻습니다. 그림 16은 모든 시뮬레이션 착물에서 C 원자의 공동 잔류 운동을 나타냅니다. 대각선의 호박색 선은 각 잔기 자체와 강한 자기 상관관계를 나타냅니다. 반상관에 대한 상관의 진폭은 각각 황색에서 파란색으로 조정됩니다. 착물 3'-(3-메틸-2-부테닐)-4' -O- -D 글루코피라노실-4,2' -디하이드록시 칼콘-3 결합 부위 잔기인 CLpro는 3CLpro의 N-말단 도메인과 상관관계가 없음을 보여줍니다. 그러나, 반상관의 진폭은 중간 정도인 반면 복잡한 3CLpro-carmofur(표준)는 훨씬 더 작은 진폭으로 유사한 반상관을 나타냈습니다. 따라서, 우리는 3'-(3-methyl-2-butenyl)- 4' -O- -D-glucopyranosyl-4,2' -dihydroxychalcone의 결합을 제안합니다. 구조적 전이를 선호하고 표준 분자, 즉 carmofur와 비교하여 강화된 비결합 상호작용으로 안정적인 복합체 형성을 촉진합니다. 마찬가지로, 또 다른 복잡한 4-hydroxycordoin PLpro는 잔기 50-175 사이에 강한 상관관계를 보였지만, PLpro에 결합된 표준 약물 GRL-0617과의 복합체에서 동일한 잔기는 상대적으로 약한 협력 운동을 보였습니다. N-말단 영역과 함께 175에서 240 범위의 결합 포켓 잔기에 의해 표현되는 협동 운동은 GRL-0617- PLpro 복합체를 안정화시키는 활성 부위 잔기의 중요성을 드러냈다. 바인딩 포켓 상관관계는 복잡한 GRL-0617-PLpro에서 손실되었습니다. 표준 분자 DRI-C23041-스파이크 단백질 복합체는 390~470번 잔기에 대해 강한 협동 운동을 보인 반면, 복잡한 스파이크-말로토필리펜 D의 이러한 잔기는 반협조적인 움직임을 보였다.운동. 또한, 스파이크-말로토필리펜 D 복합체는 항모든 잔류물에 의해 표현되는 강한 자기 상관을 제외하고 협력 운동.
따라서, 동적 교차 상관 매트릭스는 연구된 복합체의 형태적 유연성을 강조하는 단백질의 협동 및 반협동 운동을 보여주고 반대쪽의 비협조 운동에 의해 조정되는 안정적인 비결합 상호작용은 바인딩 포켓의 개폐를 유발했습니다. MD 시뮬레이션 동안 안정적인 복합체 형성을 촉진하는 잔류 물.
그림 9. 3CLpro-3'-(3-methyl-2-butenyl)-4'-O- -D-glucopyranosyl-4을 설명하는 매개변수, 2'-dihydroxychalcone 복합 구조 안정성. (a) 백본 및 복합체의 RMSD, (b) RMSF, (c) Rg, (d) SASA, (e) H-결합 상호작용의 수, 및 (f) 결합 포켓 잔기의 중요성을 강조하는 기여 에너지 플롯 안정적인 복합체 형성
표 6
결합 자유 에너지의 MM-PBSA 계산 및 최고 히트 복합체의 상호 작용 에너지.
4. 토론
면역 부스터는 면역이 약화된 상태에서 더 널리 퍼져 있기 때문에 COVID-19를 포함한 여러 전염병에 대한 예방에 중요한 역할을 할 수 있는 것으로 나타났습니다. 이전에는 COVID-19를 다루는 면역 부스터의 역할이 화학 정보학 및 생물 정보학 접근 방식을 사용하여 설명되었습니다[34]. 유사하게, 본 연구는 벤잘아세토페논(플라보노이드의 전구체)[35]을 신종 코로나바이러스에 대한 면역 촉진제 및 항바이러스제로 조사하려고 시도했습니다.
처음에 화합물을 검색하고 Lipinski의 5 법칙에 의해 설명된 바와 같이 분자량, H-결합 기증자, 수용자 및 친유성을 기반으로 약물 유사성 예측을 수행했습니다. 여기서 대부분의 벤잘아세토페논은 경구 생체이용률을 시사하는 긍정적인 약물 유사성 점수로 확인되었습니다[16]. 또한, 경구 생체이용률을 향상시키기 위해 음의 약물 유사성 점수를 갖는 벤잘라세토 페논의 구조에 약간의 변형을 가할 수 있습니다. 그러나 그들의 생물학적 기능이 영향을 받아서는 안된다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 긍정적인 약물 유사성 점수를 가진 상위 5개 리간드, 즉 abyssinone VI(c1), isobavachalcone(c11), 4-hydroxycordoin(c30), mallotophilippen E(c31) 및 oxygenated xanthohumol(c39)은 그들의 약물에 대해 예측되었습니다. 친유성, 수용성, 약동학 및 약물유사성 등이 약물 작용에 대해 고려해야 할 핵심 제약 사항입니다. 흥미롭게도, 이 5개의 안타 중 어느 것도 Lipkinski(분자량<500, number of H-bond acceptors <10, number of H-bond donors <5, and XLogP<5) [36] and Veber (number of rotatable bonds ≤10, and the total polar surface area ≤140, also questions 500 molecular weight cutoff in Lipinski rule of 5) [37] rules.
또한 저산소증 유도 인자(HIF)-1, p53, NF-kB(nuclear factor kappa B), toll-like receptor, tumor necrosis 등 총 55가지 경로가 벤잘아세토페논에 의해 조절되었습니다. factor(TNF), forkhead box, sub-group O(FoxO), estrogen, Wnt, NOD-like receptor, interleukin-17 (IL-17) 신호 전달 경로 및 사이토카인-사이토카인 수용체 상호 작용이 확인되었습니다. ~에 관한면역 조절. HIF 발현 및 안정화는 저산소증 및 미생물 관련 병인에 의해 유발되는 것으로 보고되었다. 또한 HIF는숙주 면역 기능, 식세포 살균 능력 및 T 세포의 분화를 촉진하고 세포 독성 활동을 합니다. 또한 HIF 신호 전달 경로는 염증, 대식세포 대사 및 양극화, 미생물 감염(바이러스 및 박테리아 모두), 항원 제시 및선천성 면역[38]. 유사하게, HIF-1 신호 경로(hsa04066)는 FLT1, GAPDH, HMOX1, NOS2, TFRC 및 TIMP1 유전자의 조절을 통해 조절되는 것으로 확인되었습니다.면역 체계코로나 바이러스 감염에서 감염된 조직의 염증을 처리합니다. 또한, p53 신호 전달 경로는면역 반응주요 규제 기관의 활성화를 통해면역 신호 경로.
그림 10. 3CLpro-Carmofur 복합 구조 안정성을 설명하는 매개변수. (a) 백본 및 복합체의 RMSD, (b) RMSF, (c) Rg, (d) SASA, (e) H결합 상호작용의 수, 및 (f) 안정한 복합체에서 결합 포켓 잔기의 중요성을 강조하는 기여 에너지 플롯 형성.
그림 11. PLpro-4-hydroxycordoin 복합 구조 안정성을 설명하는 매개변수. (a) 백본 및 복합체의 RMSD, (b) RMSF, (c) Rg, (d) SASA, (e) H-결합 상호작용의 수, 및 (f) 결합 포켓 잔기의 중요성을 강조하는 기여 에너지 플롯 안정적인 복합체 형성
또한 p53 신호 전달 경로의 여러 유전자가 사이토카인 생산, 병원체 감지, 염증 및 죽은 세포 제거에서 보고되었습니다[39]. 따라서 벤잘아세토페논은 p53 신호 경로(hsa04115)에서 CASP8, CCND2, CHEK1 및 MDM2 유전자를 조절하는 데 관여할 수 있으며, 사이토카인을 유발하여 면역력을 높이고 신체에서 죽은 조직을 제거할 수 있습니다. TNF 또는 IL과 같은 염증성 사이토카인은 선천 및 적응 면역 반응에 영향을 미칩니다. 또한 IL-6 또는 TNF[40]와 같은 단일 사이토카인의 차단을 통해 생성된 병인을 수용함으로써 그 중요성이 설명되었습니다. 여기에서 벤잘아세토페논은 또한 염증과 직접적으로 관련된 NF-kB(hsa04064), TNF(hsa04668) 및 IL-17(hsa04657) 신호 경로 및 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용(hsa04060)과 같은 다중 경로를 조절하는 것으로 예측되었습니다. 사이토카인. Toll-like 수용체는 일반적으로 센티넬 세포(수지상 세포 및 대식세포)에서 발현되어 미생물 유래 구조적으로 보존된 분자를 인식하고 다음에서 중요한 역할을 합니다.선천적 면역 체계. 또한 특정 어댑터 분자를 모집하고, NF-kB와 같은 전사 인자를 활성화하고, 선천적 면역 반응의 결과를 설명하고, 병원체에 대한 선천적 면역 반응의 여러 측면에서 중요한 역할을 합니다[41]. 여기서 벤잘아세토페논은 toll-like receptor signaling pathway에서 CASP8, CD14, CD86 3가지 단백질을 조절하는 것으로 확인되었다. 또한, 이마(Fox) 전사 인자의 FoxO 아과(subfamily)는 세포 및 항상성 기능에 중요한 역할을 합니다.면역 관련 세포T 세포, B 세포, 호중구 및 기타 비림프 계통을 포함합니다[42]. 또한 벤잘아세토페논은 0.0137의 잘못된 발견률로 130개의 배경 단백질에 대해 3개의 단백질(CAT, CCND2 및 MDM2)을 조절하여 FoxO 신호 경로(hsa04068)를 조절했습니다. 마찬가지로, 에스트로겐 수용체는 면역 세포를 발달시킨 다음 막 개시 스테로이드 신호 전달에 참여하는 것으로 알려져 있습니다. 또한 I형 인터페론과 선천적 사이토카인 생산을 생성하고 선천적 면역 세포의 반응을 개발하거나 기능합니다[43]. 마찬가지로, 본 연구는 벤잘아세토페논이 인터페론과 사이토카인 생성을 유발하고 면역 세포의 빠른 반응을 도울 수 있는 세 가지 단백질, 즉 MMP2, PGR 및 RARA의 조절을 통해 에스트로겐 신호 전달 경로(hsa04915)를 조절하는 것으로 입증되었습니다. 마찬가지로 Wnt 신호는 자연 살해 세포 발달, T 세포 개시, 조직 복구에 대한 대식세포 작용, T 세포 흉선 생성에서 매우 다양한 면역 세포 조절을 포함한 여러 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다[44]. 여기서 벤잘라세토 페논은 CCND2, CTNNB1 및 MMP7의 세 가지 단백질의 조절을 통해 Wnt 신호 전달 경로(hsa04310)를 조절하고 자연 살해 세포, T 세포 및 대식세포의 발달 및 조절에 기여할 수 있습니다. 유사하게, NOD 유사 수용체는 미생물 인식에서 기능하고, 숙주 방어 메커니즘이 보고되고 또한 숙주의 선천적 면역 반응을 유발한다. 또한 NOD 유사 수용체 계열은 3가지 단백질, 즉 CASP8, CCL2 및 CYBA의 조절을 통해 조절되는 숙주-병원체 상호작용 및 염증 반응[45]과 관련이 있습니다.
Benzalacetophenones-targets-pathways 상호 작용에서 전체 네트워크의 여러 매개 변수를 평가했습니다. 이웃과 모든 노드의 평균 연결성은 "이웃 연결성"[46]으로 정의됩니다. 이 변수는 위에서 언급한 네트워크에서 이웃에 의해 63.8%로 정의되었습니다. 또한 "betweenness centrality"는 다른 노드 사이의 최단 경로에 존재하는 노드 빈도를 측정합니다. 이것은 노드가 네트워크의 노드 사이에서 다리 역할을 하도록 지시합니다. 이것은 이웃 수와 1로 상관관계가 있는 것으로 관찰된 하나[47]에 떨어지는 독립 노드의 최단 경로와 빈도를 식별하는 데 도움이 됩니다. 유사하게 "근접 중심성"은 다른 노드에 대한 '가까움'을 기반으로 각 노드를 계산합니다. 노드 사이의 최단 경로를 계산합니다. 이는 주어진 네트워크에 대한 개별 노드의 영향을 가장 빠르게 이해하는 데 도움이 됩니다[47]. 본 연구에서는 근접 중심성이 2% 정도 이웃에 의존하는 것으로 관찰되었다.
새로운 바이러스에 대한 새로운 항바이러스제를 식별하는 동안 잘 알려진 바이러스에 대한 항바이러스 특성을 추적하는 것은 쉬운 게임이 될 수 있습니다. 이를 가정하여 항바이러스 생물학적 스펙트럼에서 관심 있는 벤잘라세토 페논을 조사하였다. 여기에서 선택된 벤잘아세토페논이 아데노, 사이토메갈로, 간염, 헤르페스, 트라코마, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 피코르나, 수두, 코뿔소 및 인간 면역결핍 바이러스에 대한 항바이러스 특성을 가지고 있음이 관찰되었습니다. 또한 GO 분석을 통해 인유두종 바이러스 감염(hsa05165), 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 감염(hsa05167), 바이러스 발암(hsa05203), HTLV-I 감염(hsa05166), 단순 헤르페스 감염(hsa05168)과 같은 감염성 질병 경로의 조절도 확인했습니다. ) 및 KEGG 데이터베이스와 관련된 바이러스 감염과 관련된 바이러스성 심근염(hsa05416). 이러한 결과는 우리가 신종 코로나바이러스에 대한 벤잘아세토페논의 가능한 항바이러스 특성을 조사하도록 더욱 자극했습니다.
SARS-CoV-2에 대한 벤잘아세토페논의 가능한 항바이러스 작용을 평가하기 위해 우리는 in silico 분자 도킹 및 모든 원자 명시적 MD 시뮬레이션을 사용하여 새로운 코로나바이러스의 3개 표적, 즉 3CLpro에 대한 리간드의 결합 친화도를 조사했습니다. PLpro 및 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인. 여기서, 모든 벤잘아세토페논은 - 5.0 kcal/mol 미만의 결합 에너지를 기록했습니다. 추가 화합물은 4-클로로칼콘(c4), 오보찰콜락톤(c17), 4'-O-메틸바바칼콘(c22) 및 말로토필리펜 E( c31) 3CLpro,2'-하이드록시칼콘(c2), 4-클로로칼콘(c4), 4-하이드록시칼콘(c5), 오카닌(c7), 2',3,4,4',6 ′-펜타히드록시칼콘(c8), 칼콘(c10), (플러스)-테프로손(c12), 피노셈브린칼콘(c13), 4′-O-메틸바바칼콘(c22) 및 2′,4′-디히드록시-6′ - 메톡시-3',5'-디메틸칼콘(c43) with PLpro 및 2'-하이드록시 칼콘(c2), 4-클로로칼콘(c4), 칼콘(c10), 데스메틸크산 토후몰(c21), 4 ′-O-메틸바바칼콘(c22), 7- methoxypraecansone B(c29), 말로토필리펜 C(c41) 및 2′ ,4′-dihydroxy-6′ -methoxy-3′ ,5 ′-디메틸칼콘(c43)과 스파이크 단백질. 또한 3CLpro는 nsp5에 존재하며 자동 절단을 거치고 모든 다운스트림 레플리카제 서브유닛을 방출하여 기능성 단백질에 영향을 미치는 유비퀴틴 시스템을 변경합니다[48]. H-결합 상호작용이 없었다. 코로나바이러스의 바이러스 주기는 pp1a 및 pp1ab를 통해 촉발된 레플리카제 단백질에 의해 조절되며 주로 4-하이드록시코르도인(c30)과 결합 친화력이 − 두 리간드 모두 8.2 kcal/mol. 마찬가지로, 코로나바이러스는 ACE2를 숙주 세포에 들어가기 위한 관문으로 사용하며[50,51] 주로 abyssinone VI(c1)의 표적이 되었습니다. 이러한 결과는 "다중-화합물(들)-다중 단백질(들)" 상호작용 이론을 통해 다중 단백질에 대한 친화성으로 인해 바이러스 해부 구조의 다양한 부위를 표적으로 삼는 데 활용될 수 있는 (유사 범주의) 다중 분자를 반영합니다. 제시된 연구의 중요한 측면 중 하나는 조사 중인 총 벤잘아세토페논의 7.71%를 포함하는 바이러스 침입 억제제를 확인하는 것입니다(그림 7). 따라서, 스파이크 단백질 수용체-결합 도메인을 갖는 벤잘아세토페논의 결합은 스파이크 단백질로 추가되었고 정상 세포 항상성을 문지르는 직접적인 열쇠이다. 또한 고려해야 할 중요한 측면 중 하나는 비합리적인 평가인 '올바른 분자-올바른 대상-올바른 기간'이 '다중 구성요소'를 통해 해결할 수 있는 코로나-19를 포함한 관심 병인에 대한 빠른 속도 저하를 유발할 수 있다는 점입니다. - "단일 화합물-단일 표적" 상호작용 이론에 대한 다중 단백질" 상호작용. 또한, 이 연구는 일부 특정 경로, 즉 TNF, NF-kB 및 IL-17 신호 경로 및 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용(그림 17)의 조절을 지적했습니다.면역 조절또한 사이토카인 폭풍을 조작합니다.
그림 16. 벤잘아세토페논(A, C, E) 및 표준 약물(B, D, F)과 3CLpro, PLpro 및스파이크 단백질. 호박색으로 표시된 양의 영역은 C 원자(Cij=1)의 강하게 상관된 움직임을 나타내는 반면, 음의 영역은파란색으로 표시된 영역은 반상관 동작(Cij=-1)을 나타냅니다.
이전에는 상동성 모델링, 분자 도킹, MD 시뮬레이션 및 MM-PBSA 평가를 구현하여 약물 수송 가변성, 단백질 알로스테릭 억제 식별, 선택적 효소 억제에서 키랄성의 영향, 취소 불가능한 모드 탐색을 구현하기 위한 여러 조사가 이루어졌습니다. 수용체의 리간드-단백질 상호작용 평가[52–56]. 유사하게, 현재 작업에서 확인된 잠재적 리드 화합물 및 표준 분자와 각각의 표적과의 분자간 상호작용 안정성은 150ns에 대한 고전적 MD 시뮬레이션을 통해 분석되었습니다(200ns에 대한 스파이크 단백질 - 말로토필리펜 D(c42) 복합체). 결과는 3'-(3-methyl-2-butenyl)-4' -O- -D-glucopyranosyl-4, 2' -dihydroxychalcone (c35)이 표준 분자 carmofur와 비교하여 3CLpro의 안정적인 역학. 이전에 carmofur는 3CLpro의 Cys145 잔기와 상호작용하여 Vero E6 세포(EC50=24.30 μM)에서 코로나바이러스 복제를 억제하는 것으로 보고되었습니다[57]. 마찬가지로, 본 연구에서 carmofur는 -1.42 kJ/mol의 기여 에너지 점수를 매겨 Cys145 잔류물과 상호작용할 것으로 예상되는 반면, 3'-(3-methyl-2-butenyl)-4 ' -O- -D-glucopyranosyl-4,2' -dihydroxychalcone 화합물은 Cys145에 대해 - 4.24 kJ/mol을 기록했습니다. 또한 Cys145–His41은 SARS-CoV-2 다단백질의 절단에 중요한 역할을 하는 3CLpro의 두 촉매 다이애드 잔기입니다[58]. 또한 다른 연구 그룹도 3CLpro에 대한 새로운 항바이러스제를 설계하기 위해 Cys145를 표적으로 삼는 잠재적인 역할을 보고했습니다[59,60]. 흥미롭게도 우리는 150ns MD 시뮬레이션 동안 두 화합물 모두에서 보존된 결합 부위 상호작용(Thr25, Met49 및 Met165)을 관찰했습니다. 마찬가지로 4-hydroxycordoin(c30)은 PLpro의 억제제로 선별되었으며 표준 분자인 GRL-0617에 비해 안정적인 복합체를 형성했습니다. 이전에 GRL-0617은 SARS-CoV-2에 감염된 Vero E6 세포에서 IC50이 2.1μM인 강력한 PLpro 억제제로 보고되었습니다[61, 62]. 현재 연구에서 GRL-0617 및 4-hydroxycordoin(c30)은 모두 안정적인 RMSD를 형성하고 각각 150ns 및 200ns MD 생산 실행 동안 Ile223 및 Pro248과 공통 상호 작용을 공유했으며 둘 다 적합한 것으로 나타났습니다. PLpro 억제제로 안타.
또한 이전에 Bojadzic et al. DRI-C23041은 0.52 μM의 IC50으로 스파이크 단백질 RBD 도메인을 억제한다고 보고했습니다[63]. 본 연구에서, mallotophilippen D(c42)는 스파이크 단백질 조절인자로 확인되었으며, 표준 분자인 DRI-C23041에 비해 스파이크 단백질의 RBD 도메인에 대해 더 나은 결합 친화력을 보였다. MM-PBSA 결과에서 말로토필리펜 D(c42)의 결합 자유 에너지가 -34.10 kcal/mol인 반면 DRI-C23041에서는 -3.10 kcal/mol로 스파이크 단백질에 대한 말로토필리펜 D(c42)의 더 높은 친화도를 나타냈다. . 또한, DRI-C23041과 mallotophilippenD(c42)는 모두 150ns MD 시뮬레이션 동안 스파이크 단백질 RBD 도메인의 일반적인 잔기 Leu368과 상호작용하는 것으로 밝혀졌습니다. PCA 및 DCCM에 대한 복합체 조사는 또한 3CLpro, PLpro 및 스파이크 단백질을 포함하는 찰콘이 표준 분자에 비해 다양한 형태의 최소 수로 상대적으로 훨씬 더 적은 형태 공간 및 형태 유연성을 점유함으로써 시뮬레이션 동안 잘 평형화되고 안정화됨을 입증했습니다. 현재, 4-hydroxycordoin(c30), 가장 높은 약물 유사성 점수를 가진 화합물은 FLT1, CD86, CASP8, RARA, KLK3, PLAT, CTNNB1, HMOX1 및 TOP2A와 같은 9개의 단백질을 규제합니다. CASP8, CNNNB1, TOP2A, CD86, PLAT 및 HMOX1과 같은 6개의 단백질이 바이러스 감염과 관련이 있는 것으로 추적되었습니다. CASP8은 카스파제 8을 암호화합니다. CASP8- 의존성 세포사멸 세포와 RIP(receptor-interacting protein) 1과 3에 의존하는 괴사성 세포사 경로를 표적으로 하는 바이러스 병원체. 따라서 CASP8 활성을 획득하면 RIP1과 3을 억제하여 세포내 바이러스 병원체에 대한 숙주 방어에서의 역할[64]. 마찬가지로 CTNNB1은 카테닌 -1을 암호화하고 인터페론 단백질 합성을 담당하며[65], 면역 반응의 주요 조절자입니다. 또한 바이러스 감염을 방해할 수 있습니다[66]. 마찬가지로, TOP2A는 토포이소머라제 2를 암호화하고 그것의 억제는 만성 바이러스 감염 동안 텔로미어 데옥시리보핵산 손상과 T 세포 기능 장애를 유발합니다[67]. 또한 CD86는 T-림프구 활성화 항원 CD86를 코딩하고 항바이러스 CD8과 T-세포 기능 및 면역 감시를 제어합니다[68]. PLAT는 플라스미노겐 활성제를 암호화하고 폐의 유해한 염증 및 국소 피브린 응고 형성에 기여합니다. 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 숙주 방어에 연루될 수 있습니다[69]. 마찬가지로 HMOX1은 heme oxygenase 1을 암호화합니다. 이전에는 SARS-CoV-2 개방 해독 프레임 3a 단백질이 높은 신뢰도로 인간 HMOX1 단백질에 결합하는 것으로 보고되었습니다. HMOX1 경로는 혈소판 응집을 억제할 수 있으며 무엇보다도 항혈전 및 항염증 특성을 가질 수 있으며, 이 모든 특성은 COVID-19 환자에서 관찰되는 중요한 의학적 상태입니다[70].
이전에는 SARS-CoV-2의 게놈 RNA가 면역 유전자를 조작하고 그 기능을 박탈할 수 있는 것으로 나타났습니다. 또한, 게놈 RNA가 인터루킨 상호작용을 유발할 수 있고 또한 사이토카인 폭풍을 유발할 수 있다는 지적이 있다[71]. 또한 COVID 감염에서 microRNA(miRNA)의 비트 부분을 탐색하여 면역 반응의 인식과 공격을 피하는 연구도 있습니다. 순식간에 SARS-CoV-2는 솜이나 스펀지 역할을 하여 miRNA를 흡수하고 면역 체계 기능 장애를 일으킬 수 있습니다. 또한 miRNA를 암호화하고 숙주 세포에 들어가 숙주의 면역 체계에 의해 인식됩니다[72].
벤잘아세토페논(chalcones)은 면역 반응을 조작하는 것으로 보고되고[11], RNA는 면역 유전자 합성과 관련되기 때문에 게놈 RNA 상호작용 숙주를 조작하는 데 있어 이들의 가능한 역할은 추가 조사가 필요합니다.
5. 결론
현재 연구는 SARS-CoV-2에 대한 면역 부스터 및 항바이러스 스펙트럼으로서 다중 벤잘아세토페논을 조사했습니다. 이 연구에서는 abyssinone VI(c1), isobutrin(c16), obochalcolactone(c17), 4-hydroxycordoin(c30),3'-(3-methyl-2-butenyl과 같은 납 항바이러스제를 보고했습니다. )-4'-O- -D-glucopyranosyl-4,2'-dihydrox ychalcone(c35), xanthohumol(c38) 및 4-mallotophilippen D(c42) -19 3CLpro, PLpro 및 스파이크 단백질을 타겟팅합니다. 또한 농축 분석을 통해 다양한 규제를 확인했습니다.
HIF-1, p53, NF-kB, Toll 유사 수용체, TNF, FoxO, 에스트로겐, Wnt 및 IL-17과 같은 경로. 또한 NOD 유사 수용체와 사이토카인-사이토카인 수용체가 촉발되어 면역 체계를 조절하고 사이토카인 폭풍을 조작하는 것과 직접 관련이 있습니다. 유사하게, 면역 체계가 주로 손상되는 바이러스 및 세균 감염 및 내분비 조절 완화에 대한 다중 경로의 촉발이 있었습니다. 이러한 결과는 COVID-19에 대한 벤잘아세토페논 유도체의 치료 옵션을 제안합니다. 현재 연구 결과에 국한하여 이 연구에서 제시된 연구 결과는 습식 실험실 실험 프로토콜로 추가 검증이 필요한 프로세서 시뮬레이션을 기반으로 한다는 점을 지적합니다.
참조
[1] AR Fehr, S. Perlman, Coronaviruses: 복제 및 병인에 대한 개요, Methods Mol. 비올. 1282 (2015) 1–23, https://doi.org/10.1007/978- 1-4939-2438-7_1.
[2] Y. Dong, X. Mo, Y. Hu, X. Qi, F. Jiang, Z. Jiang, S. Tong, Epidemiology of COVID-19 in children in China, Pediatrics 145(2020), e20200702, https://doi.org/10.1542/peds.2020-0702.
[3] CJ Andersen, KE Murphy, ML Fernandez, 비만 및 대사 증후군이 면역에 미치는 영향, Adv. 뉴트리 7(2016) 66–75, https://doi.org/10.3945/an.115.010207.
[4] SG Deeks, BD Walker, AIDS 바이러스 감염에 대한 면역 반응: 좋음, 나쁨 또는 둘 다, J. Clin. 투자하다. 113 (2004) 808–810, https://doi.org/10.1172/JCI21318.
[5] M. Gendrot, E. Javelle, A. Clerc, H. Savini, B. Pradines, 코로나 예방제로서의 Chloroquine-19, Int. J. Antimicrob. 에이전트 55(2020), 105980, https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2020.105980.
[6] V. Mody, J. Ho, S. Wills, A. Mawri, L. Lawson, MCCJC Ebert, GM Fortin, S. Rayalam, S. Taval, 3-키모트립신 유사 프로테아제(3CLPro)의 동정 잠재적 항-SARS-CoV-2 제제로서의 억제제, Commun Biol 4 (2021) 93, https://doi.org/10.1038/s42003-020-01577-x.
[7] D. Shin, R. Mukherjee, D. Grewe, D. Bojkova, K. Baek, A. Bhattacharya, L. Schulz, M. Widera, AR Mehdipour, G. Tascher, PP Geurink, A. Wilhelm, GJ van der Heden van Noort, H. Ovaa, S. Müller, KP Knobeloch, K. Rajalingam, BA Schulman, J. Cinatl, G. Hummer, S. Ciesek, I. Dikic, Papain-like protease는 SARS-CoV를 조절합니다{{ 3}} 바이러스 확산 및 선천적 면역, Nature 587 (2020) 657–662, https://doi.org/10.1038/s41586-020-2601-5.
[8] Y. Huang, C. Yang, XF Xu, W. Xu, SW Liu, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 구조 및 기능적 특성: COVID-19에 대한 잠재적인 항바이러스 약물 개발, Acta 파마콜. 죄. 41(2020) 1141–1149, https://doi.org/10.1038/s41401-020- 0485-4.
[9] F. Yazdanpanah, MR Hamblin, N. Rezaei, The면역 체계및 COVID-19: 친구 또는 적, Life Sci. 256(2020), 117900, https://doi.org/10.1016/j. lfs.2020.117900.
[10] Z. Rozmer, P. Perj'esi, 자연 발생 chalcones 및 생물학적 활동, Phytochemistry Rev. 15 (2016) 87–120, https://doi.org/10.1007/s11101-014- 9387-8.
[11] JS Lee, SN Bukhari, NM Fauzi, 면역 체계의 선수에 대한 칼콘 유도체의 효과, Drug Des DevelTher 9 (2015) 4761–4778, https://doi.org/ 10.2147/DDDT.S{{7 }}.
[12] D. Zhou, D. Xie, F. He, B. Song, D. Hu, 항바이러스 특성 및 퓨린 및 벤젠술폰아미드 부분을 포함하는 새로운 칼콘 유도체의 상호작용, Bioorg. 중간 화학. Lett 28 (2018) 2091–2097, https://doi.org/10.1016/j. bmcl.2018.04.042.
[13] X. Tang, S. Su, M. Chen, J. He, R. Xia, T. Guo, Y. Chen, C. Zhang, J. Wang, W. Xue, 1을 포함하는 Novel chalcone 유도체, 2,4-트리아진 모이어티: 설계, 합성, 항균 및 항바이러스 활성, RSC Adv. 9 (2019) 6011–6020, https://doi. org/10.1039/C9RA00618D.
[14] Y. Fu, D. Liu, H. Zeng, X. Ren, B. Song, D. Hu, X. Gan, New chalcone 유도체: 합성, 항바이러스 활성 및 작용 메커니즘, RSC Adv. 10 (2020) 24483–24490, https://doi.org/10.1039/D0RA03684F.
[15] A. Lagunin, S. Ivanov, A. Rudik, D. Filimonov, V. Poroikov, DIGEP-Pred: 구조식에 기반한 약물 유도 유전자 발현 프로필의 in silico 예측을 위한 웹 서비스, Bioinformatics 29 (2013) 2062–2063, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt322.
[16] CA Lipinski, 납 및 약물 유사 화합물: 5법칙 혁명, Drug Discov. 투데이테크놀러지. 1 (2004) 337–341, https://doi.org/10.1016/j. ddtec.2004.11.007.
