L. Major를 인식하는 교차 반응성 천연 IgG는 수지상 세포에 의한 기생충 내재화를 촉진하고 보호 면역을 촉진합니다

추상적인

핵심 메시지

• 다양한 유전자 변형 마우스를 사용하여 이러한 항체가 IgM뿐만 아니라 IgG일 수 있음을 발견했습니다.

키워드

Leishmania major · 수지상 세포 · B 세포 · 천연 IgG

소개

Leishmania spp. 감염 풍토병 국가에서 큰 부담을 나타냅니다. 질병 발현은 자기 제한적 피부 리슈만편모충증에서 파종성, 재발성, 점막피부 및 내장 질환에 이르기까지 다양합니다. 치료되지 않은 내장 레슈마니아증은 숙주의 생명에 심각한 위협이 됩니다. 백신은 아직 존재하지 않습니다. 치유와 평생면역이 중요한 세포내 병원균에 대한 방어는 IFN 생성 Th1/Tc1 세포의 발달에 의존하는 반면, 기생충 지속성과 질병 진행은 Th2 세포 우세, 조절 T 세포 및/또는 Th17 반응과 관련이 있습니다. IFN 방출은 기생충을 제거하는 NO 생산으로 이어집니다.보호 면역감염된 수지상 세포(DC)에 의해 유발됩니다. 모래파리에 의해 Leishmania major를 피부에 접종한 후 promastigote 기생충 생명체는 피부 상주 대식세포(MΦ)와 호중구에 의해 섭취됩니다. MΦ 내에서 기생충은 편모가 없는 아마스티고트 생명체로 변형되어 복제됩니다. 나중에 방출된 아마스티고트는 DC와 같은 다른 숙주 세포에 의해 흡수됩니다. 감염된 DC는 기생충 항원을 처리하고 배수 림프절과 프라임 T 세포로 이동합니다. IL-12의 방출 및 감염된 DC의 다른 사이토카인은 기생충 관련 T 세포의 Th1/Tc1 교육을 지시합니다.

MΦ가 기생충 섭취를 위해 보체 수용체(CR)3를 이용하는 반면, DC에서는 Fc RI/III가기생물내면화. 흥미롭게도 초기에 CR3- 관련 기생충 섭취는 감염된 MΦ의 침묵을 유도하는 반면, 확립된 감염에서는 MΦ에 의한 Fc R매개 아마스티고트 흡수가 Th2/Treg 발달을 촉진하는 항염증 IL-10 생성을 유도합니다. 및 기생충 지속성. 대조적으로 DC에서 Fc R 매개 기생충 섭취는 세포 활성화, CD4 T 세포 프라이밍 및 항원 교차 제시를 유도합니다. 따라서 DC에 의한 항체 매개 기생충 흡수는 기생충에 대한 보호 개발에 중요합니다. 따라서 항-Leishmania IgG의 생산은 Leishmania 특이적 Th1/Tc1 세포의 효율적인 (교차-)프라이밍을 위한 전제 조건입니다. 즉, B 세포가 없는 상태에서 질병 발달은 더 큰 병변 부피, 더 높은 기생충 부하, 지연된 T 세포 프라이밍 및 감소된 IFNΓ 생성으로 더 심각했습니다. 이전에 우리는 Leishmania 관련 IgG가 병변에 DC가 축적될 때 혈청에 존재한다는 것을 보여주었습니다.

감염된 DC에 의한 B 세포 프라이밍이 없을 때 기생충 자체에 대한 초기 B 세포 반응이 어떻게 발생하는지는 여전히 열려있는 질문입니다. Leishmania spp.를 인식하는 소위 천연 항체. 조기에 용이하게 할 수 있습니다기생충 내재화DC에 의해. 또한 기생충막은 세포사멸체와 유사한 포스파티딜세린을 함유하고 있기 때문에교차 반응성항체가 역할을 할 수 있습니다. 현재 연구에서 우리는 비 면역 동물에 존재하는 Leishmania를 인식하는 자연 IgG 또는 과도한 세포 사멸 중에 생성 된 항 인지질 항체가 B 세포 및 T 세포 프라이밍을 촉진하기 위해 기생충 섭취 DC에 기여하는지 여부를 평가했습니다. 쥐 또는 인간 혈청의 항인지질 항체와 정상 마우스 혈청(NMS)의 "천연 IgG"가 Leishmania 기생충에 결합하여 촉진하기에 충분함을 발견했습니다.기생물내면화DC에 의해 생체 내에서 더 나은 질병 결과를 촉진합니다.

재료 및 방법

동물

6-8주 된 C57BL/6 마우스는 Janvier에서 구입했습니다. B 세포 결핍 μMT 마우스는 University Medical Center Mainz의 면역학 연구소 Hansjörg Schild에서 아낌없이 제공했습니다. IgGi 및 IgMi 마우스(둘 다 C57BL/6 배경)는 이전에 설명되었습니다. 모든 동물은 마인츠 요하네스 구텐베르크 대학의 중개 동물 연구 센터(Translational Animal Research Center, TARC)에서 특정 병원균이 없는(SPF) 조건 하에 수용되었습니다. 모든 실험은 Rheinland-Pfalz 지역의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인된 라이선스로 수행되었습니다.

약초 연구에 따르면, cistanche는 수세기 동안 중국 전통 의학에서 사용된 곰팡이의 한 유형인 것으로 나타났습니다. 그것은 아시아의 열대 및 아열대 지역에서 자라는 곰팡이의 말린 줄기와 줄기로 만들어집니다. 일반적으로 사용되는면역력을 향상, 피로를 완화하고 감기 및 기타 감염을 치료합니다.

연구 결과에 따르면담배신체가 바이러스 및 박테리아와 같은 외부 침입자와 싸울 수 있도록 도와주는 항체 생산을 증가시킬 수 있습니다. 신체가 유해한 침입자를 인식하고 물리치는 데 도움을 주는 역할을 하는 백혈구의 일종인 T 세포의 수와 활동을 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다.

또한 연구에 따르면 cistanche는 감기, 독감 및 기타 바이러스 감염의 심각성을 줄일 수 있습니다. 신체가 바이러스 또는 세균 감염으로부터 회복하는 데 걸리는 시간을 줄이는 것으로 밝혀졌습니다. cistanche는 또한 특정 바이러스로 인한 발열 기간을 줄이고 이차 감염 발생 위험을 줄일 수 있습니다.

뿐만 아니라,담배특정 질병과 관련된 염증을 줄일 수 있는 항염증 특성이 있는 것으로 알려져 있습니다. 연구에 따르면 dendrobium은 특정 항생제의 효과를 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

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전반적으로 연구에 따르면 cistanche는 다음에 대한 유용한 치료법이 될 수 있습니다.개선면역다양한 감염과 싸우고 있습니다. 신체의 자연 방어력을 향상시키고 질병의 심각성과 기간을 줄이며 2차 감염의 위험을 줄일 수도 있습니다.

기생충 및 감염 

L. 메이저 클론 VI(MHOM/IL/Friedlin)의 Amastigotes 또는 metacyclic promastigotes는 이전에 설명한 대로 준비되었습니다. Amastigotes는 이전에 설명한 대로 BALB/c 또는 B 세포 결핍 μMT 마우스의 감염된 귀에서 분리되었습니다. 분리된 기생충을 5% NMS, IMS 또는 항-PL로 37도에서 10분 동안 옵소닌화하고 시험관 내 또는 생체 내 감염 전에 세척했습니다.

혈청, IgG 농축 및 기생충 결합 분석

순진한 C57BL/6 마우스에서 정상 마우스 혈청(NMS)을 생성한 반면, 면역 혈청(IS)은 L. major의 2 × 10E5 metacyclic promastigotes에 감염된 치유된 마우스에서 채취했습니다. 6주. 항인지질 항체(PL) 혈청은 아폽토시스 흉선 세포로 반복 면역화하여 생성되었습니다. 혈청을 수확하기 전에, 유동 세포측정법을 통해 또는 α-당단백질-특이적 ELISA에서 아폽토시스 세포에 대한 특이적 IgG 결합을 평가함으로써 면역화 성공을 확인하였다. C57BL/6 마우스 그룹을 Freud's adjuvant(FA)의 존재 하에 재조합 2-당단백질(2G)로 면역화했습니다. 항- 2G를 포함하는 혈청은 4주 후에 수확되었습니다. Anti-Leishmania IgG 5–6-주 이상의 L. 주요 감염 BALB/c 마우스, PL- 또는 b2G-특이적 IgG는 단백질 G 컬럼(Pierce Chemical Co.)을 사용하여 풀링된 혈청으로부터 준비되었습니다. 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 혈청은 IgG 정제 전에 -20도에서 보관했습니다. 정제된 IgG는 사용 전 PBS에 4도(0.8 mg/mL)로 보관하였다.

정상적인 인간 혈청(NHS)은 건강한 대조군으로부터 얻은 것이고, 항-리슈마니아 항체를 함유하는 혈청은 Marocco의 피부 리슈마니아증(LM) 환자로부터 얻었다. 항인지질 증후군(PL) 환자의 혈청도 사용했습니다.

기생충(promastigotes 또는 amastigotes)은 마우스 Ig와 반응하는 isotype-specific 2차 항체인 anti-IgM(Serotec), anti-IgG1(A85-1) 및 anti-IgG2a/b( R2-40, 모두 BD Biosciences에서 제공). 염색 후, 기생충을 PBS/2% BSA로 세척하고, 고정하고, 유세포 분석기로 분석했습니다.

체외 자극

앞서 설명한 바와 같이 6일 동안 IL-4(10µg/mL) 및 GM-CSF(10µg/mL)가 보충된 RPMI/5% FCS 배지에서 골수 유래 DC를 생성했습니다. 미성숙 DC로서 6일째에 세포를 수확하였다. 2×10 5 DC를 감염된 BALB/c 또는 μMT 마우스의 옵소닌화된 아마스티고트와 공동 배양하거나 18시간 동안 옵소닌화된 메타사이클릭 프로마스티고트(MOI 1:5)와 배양했습니다. 그 후, 이전에 설명한대로 세포를 수확하고 시토 스핀을 생성했습니다. DifQuick 염색된 세포는 세포내 및 세포외 기생충의 존재에 대해 분석되었습니다. 샘플당 최소 200개의 세포가 계수되었습니다.

생체 내 감염

병변 부피는 매주 3차원으로 측정되었고 타원체로 보고되었습니다[(a/2×b/2×c/2)×4/3×π]. 병변 조직에 존재하는 기생충은 이전에 설명한 제한 희석 분석을 사용하여 열거되었습니다.

항원 특이적 사이토카인 생산 측정을 위해 감염된 C57BL/6 마우스의 배액 LN 세포를 회수하고 단일 세포 현탁액을 준비했습니다. 백만 개의 LN 세포/200μL 완전 RPMI 1640(Biochrome)을 25ug/mL SLA가 있는 96-웰 플레이트에 추가했습니다. 자극 48시간 후 상청액을 수확하고 IL-4 및 IL-10(BD)뿐만 아니라 IFNΓ(R&D Systems)에 특이적인 ELISA를 사용하여 분석했습니다.

옵소닌화된 기생충에 감염된 골수 인간 DC

자기 세포 분리 시스템 및 BDCA-1 인간 DC 분리 키트(Miltenyi, Germany)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 골수성 인간 CD1c + DC(hDC)를 말초 혈액으로부터 분리했습니다. 1.5 × 107 세포를 2.5mL RPMI 1640/2% 자가 혈장에 도말했습니다. 순도를 높이기 위해 세포를 따뜻한 PBS로 세척하고 최종적으로 재조합 인간 IL-4(150U/mL) 및 GM-CSF(400U/mL)가 보충된 X-VIVO 15/혈장(1%)으로 배양했습니다. . 미성숙 hDC는 6일째에 수확되었습니다. 2 × 10 5 hDC는 감염된 μMT 마우스의 옵소닌화된 아마스티고트와 공동 배양되거나 18시간 동안 옵소닌화된 메타사이클릭 프로마스티고트(MOI 1:5)와 함께 배양되었습니다. 그 후, 이전에 설명한대로 세포를 수확하고 시토 스핀을 생성했습니다. DifQuick 염색된 세포는 세포내 및 세포외 기생충의 존재에 대해 분석되었습니다. 샘플당 최소 200개의 세포가 계수되었습니다.

통계 분석

통계 분석은 StatView 소프트웨어와 unpaired Student's t-test를 사용하여 수행되었습니다.

결과

항인지질 항체 함유 혈청은 L. major에 결합합니다.

기생충은 "아폽토시스 모방"이라는 과정을 통해 숙주 세포에 들어갈 수 있고 L. 주요 생명체는 표면에 인지질을 발현하기 때문에 확립된 프로토콜을 사용하여 항인지질 항체(PL)를 포함하는 혈청을 생성했습니다. 이를 위해, C57BL/6 마우스 그룹을 프로이트 보조제(FA)의 존재 하에 아폽토시스 흉선 세포로 면역화한 상태에서 L. 메이저로 감염시켰다. 2-당단백질(2G)은 항인지질 증후군(APS)의 주요 항원이므로 항- 2G 항체를 포함하는 혈청을 얻기 위해 FA가 있는 상태에서 마우스를 2G로 면역화했습니다. 대조군으로는 감염되지 않은 C57BL/6 마우스의 정상 마우스 혈청(NMS)과 L. major 감염 마우스의 면역 혈청(IS)을 사용했습니다.

나이브 또는 면역화된 마우스의 다른 마우스 혈청에 L. major에 결합하는 항체가 포함되어 있는지 테스트하기 위해 먼저 L. major promastigote 동결-해동 용해물(용해성 Leishmania 항원, SLA)을 기질로 사용하여 ELISA로 기생충 항원에 대한 항체 결합을 평가했습니다. (그림 1A, 검은색 기둥). 표준으로 L. major 감염 마우스의 혈청에서 분리한 IgG를 사용했습니다. 흥미롭게도 IS 및 PL 혈청은 Leishmania lysate에 대한 비슷한 수준의 항체 결합을 포함했으며 이는 NMS 또는 보조제만으로 면역된 마우스의 혈청에서 관찰된 결합과 비교하여 3-4배 더 높았습니다. 또한 2G 항체를 포함하는 혈청도 SLA에 결합합니다. 2G(흰색 컬럼)에 특이적인 ELISA를 사용하여 혈청에서 높은 수준의 2G-IgG를 식별한 반면 다른 모든 혈청의 2G IgG 수준은 검출 한계 미만이었습니다.

무화과. 1 Detection of L. major cross-reactive antibodies in serum of mice containing antiphospholipid antibodies. Serum was obtained from groups of C57BL/6 mice that were left untreated (normal mouse serum, NMS) or which were infected for>2× 105 L. major(면역 혈청, IS)로 6주. 또 다른 그룹은 불완전 프로이트(FA) 보조제의 존재 하에 세포사멸 흉선세포(항인지질 Ab, a-PL) 또는 재조합 2-당단백질(a- 2G)로 반복적으로 면역화되었으며, FA는 다음과 같이 사용되었습니다. 제어. L. major 용해물을 기질 또는 2-당단백질로 사용하여 ELISA에서 혈청의 반응성을 테스트했습니다. ELISA는 anti-murine IgG를 사용하여 개발되었습니다. 데이터는 평균(±SEM, n이 1 이상)으로 표현됩니다. B L. major의 Metacyclic promastigotes는 고정상 배양(n{{10}})에서 얻었습니다. C Amastigotes는 B 세포 결핍 μMT 마우스(n=3)의 병변에서 준비되었습니다. B 및 C 기생충 제제는 다른 혈청(5%, 10분, 37도)으로 옵소닌화되었습니다. 항-마우스 2차 항체를 사용하여 FACS에 의해 항체 결합을 평가하였다. Ig의 결합은 옵소닌화되지 않은 기생충의 기준선 수준에 대해 계산되었습니다(*p 0.05 이하, **p 0.005 이하, ***p 0.002 이하).

다음으로, 우리는 IS, PL 또는 2G 혈청에서 풍부한 IgG의 다른 농도로 L. major의 감염 단계 metacyclic promastigotes를 배양했습니다. 우리는 100 ng/mL에서 최대값으로 IS- 및 2G-유래 IgG의 용량 의존적 결합을 관찰했습니다(그림 1B). L. major의 promastigotes에 대한 PL 유래 IgG의 결합은 검출되지 않았습니다.

또한 B 세포 결핍 μMT 마우스의 병변에서 분리한 L. major amastigotes를 다른 혈청과 10분 동안 배양했습니다. 그런 다음 기생충을 광범위하게 세척한 후 표면 결합 항체를 PE 접합 항-IgG1, 항IgG2a/b 또는 항-IgM으로 표지한 후 유세포 분석기로 검출했습니다(그림 1C). 예상대로 IS에는 Leishmania 관련 IgM, IgG1 및 IgG2a/b가 포함되어 있습니다. 우리는 또한 소위 "천연 Ab" 풀에서 Leishmania 특정 IgM을 발견했기 때문에 이전 작업을 확인합니다. 흥미롭게도 우리는 또한 PL 혈청에서 IgG와 IgM을 강력하게 발견했습니다.교차 반응L. major amastigotes의 표면. 항- 2G 함유 IgG 항체는 Leishmania에 결합하지 않았지만 2G 혈청에는 IgM이 포함되어 있었습니다.교차 반응아마스티고트 표면.

교차 반응성 항체는 DC에 의한 기생충 내재화를 중재합니다.

우리는 다음으로 L. major amastigotes의 표면에 결합할 수 있는 다른 IgG 항체가 기능적으로 활성인지 평가하려고 했습니다. 따라서 우리는 GMCSF 및 IL-4이 보충된 골수(BM) 세포 배양을 사용하여 DC를 생성했습니다. BM-DC를 6일째에 미성숙 세포로서 수확하고 2×105세포/mL로 플레이팅하였다. 야생형 BALB/c 또는 B 세포 결핍 μMT 마우스의 감염된 발바닥에서 파생된 기생충 amastigotes는 다른 혈청(5vol%)으로 옵소닌화되고 광범위하게 세척된 다음 5:1의 기생충/세포 비율로 DC에 추가되었습니다. 18시간 후, 세포를 수확하고, 세척하고, 시토스핀하였다.

기생물내면화100X에서 DifQuickstained 슬라이드에서 결정되었습니다(그림 2). 설명된 바와 같이, μMT 마우스로부터 분리된 기생충의 흡수는 상당히 손상되었습니다. NMS를 사용한 사전 배양은 기생충 섭취를 약간 강화한 반면, IS를 사용한 배양은 DC 감염률을 BALB/c 유래 아마스티고트에서 관찰된 수준으로 "정상화"했습니다. 참고로 PL을 사용한 기생충 옵소닌화는 또한 DC 감염률을 ~100%까지 상당히 명확하게 개선했습니다. b2G 함유 혈청을 사용한 아마스티고테스의 낮은 수준의 IgG 옵소닌화와 일치하여(그림 1C 비교), 이것은 또한 DC의 감염률을 향상시켰지만 그 정도는 낮았습니다.

그림 2교차 반응성 항체로 L. major의 옵소닌화는 DC에 의한 향상된 기생충 흡수를 유도합니다. 미성숙 C57BL/6 BMDC(2×105)는 BALB/c 또는 B 세포 결핍 μMT 마우스(1:3)의 아마스티고테스와 공동 배양되었습니다. 공동 배양 전에, amastigotes는 정상 마우스 혈청(NMS), 면역 혈청(IS), 세포사멸 흉선세포(aPL)로 반복 면역화하여 얻은 항인지질 항체를 함유하는 혈청 또는 항- 2 당단백질을 함유하는 혈청으로 옵소닌화되었습니다. 항체( 2G). 18시간 후, 감염률은 광학 현미경으로 시토스핀에서 결정되었습니다(n=3, *p 0보다 작거나 같음.05,**p 0.005보다 작거나 같음, 및 ***p 비옵소닌 대조군과 비교하여 0.002 이하)

교차 반응성 항인지질 항체는 피부 레슈마니아증에서 질병 결과를 개선합니다

후속 실험에서 우리는 기생충의 옵소닌화가교차 반응성항체는 생체 내에서 질병 결과를 변경합니다. 이를 위해, 기생충 배양물로부터 분리되고 농축된 메타사이클릭 프로마스티고트를 위에서 설명한 바와 같이 다른 혈청으로 옵소닌화했습니다. NMS로 옵소닌화된 기생충은 음성 대조군으로 사용되었습니다. 광범위한 기생충 세척 후, 5마리의 C57BL/6 마우스 그룹을 103 L. major로 피내 감염시켰다. 병변 발달을 ~4개월 동안 모니터링하였다. 이전 연구 결과와 일치하여, IS로 옵소닌화된 기생충은 초기 시점에서 감염된 피부 DC의 증가된 빈도와 일치하여 더 작은 귀 병변을 유도했습니다(그림 3). 놀랍게도, PL 또는 2G로 옵소닌화된 기생충은 감염 후 5주에서 8주 사이에 병변 부피가 50% 감소한 것으로 확인된 유사하게 개선된 질병 결과를 촉진했습니다.

교차 반응성 항인지질 항체는 피부 레슈마니아증에서 질병 결과를 개선합니다

후속 실험에서 우리는 기생충의 옵소닌화가교차 반응성항체는 생체 내에서 질병 결과를 변경합니다. 이를 위해, 기생충 배양물로부터 분리되고 농축된 메타사이클릭 프로마스티고트를 위에서 설명한 바와 같이 다른 혈청으로 옵소닌화했습니다. NMS로 옵소닌화된 기생충은 음성 대조군으로 사용되었습니다. 광범위한 기생충 세척 후, 5마리의 C57BL/6 마우스 그룹을 103 L. major로 피내 감염시켰다. 병변 발달을 ~4개월 동안 모니터링하였다. 이전 연구 결과와 일치하여, IS로 옵소닌화된 기생충은 초기 시점에서 감염된 피부 DC의 증가된 빈도와 일치하여 더 작은 귀 병변을 유도했습니다(그림 3). 놀랍게도, PL 또는 2G로 옵소닌화된 기생충은 감염 후 5주에서 8주 사이에 병변 부피가 50% 감소한 것으로 확인된 유사하게 개선된 질병 결과를 촉진했습니다.

다음으로 NMS, IS 또는 PL이 풍부한 100μg IgG와 함께 배양된 μMT amastigotes를 사용했습니다(그림 4). 다시, 우리는 IS 또는 PL의 IgG가 옵소닌화되지 않은 기생충과 비교하여 더 작은 병변을 가진 더 가벼운 질병을 초래한다는 것을 관찰했습니다(그림 4A). 일렬로, 감염 후 6주에 결정된 병변 조직의 기생충 부담은 기생충 결합 항체의 존재 하에서 시작된 감염에서 (상당히) 더 작은 기생충 부담을 드러냈습니다(그림 4B). SLA를 이용한 배액 림프절 세포의 항원 특이적인 재자극은 IFN의 변경되지 않은 수준을 나타냈지만, IL-4 및 IL-10의 낮은 수준은 IgG 옵소닌화된 기생충에 감염된 마우스에서 발견되었습니다(그림 4C). . 이것은 이전 연구에서 쥐의 기생충 제거가 병변 IFN에 의한 감염된 MΦ의 활성화에 의존한다는 것을 보여주었기 때문에 감소된 병변 크기와 일치합니다. . 이와 같이 감염된 MΦ에 대한 IL-10 효과는 기생충 지속성을 초래했습니다. 따라서 한편으로는 IFN과 IL-4 및 IL-10과 같은 Th2/Treg 관련 사이토카인 사이의 비율이 질병 결과와 가장 관련이 있는 것으로 보입니다.

그러나 흥미롭게도 이 설정에서 NMS의 IgG가 옵소닌화에 사용되었을 때 더 작은 병변 부피도 관찰되었습니다.교차 반응성순진한 생쥐의 혈청에서도 천연 항체.

리슈만 편모충 특이 항체와 교차 반응 항체 모두 유전적 IgG 부족을 대체할 수 있습니다.

Leishmania에 대한 반응에서 면역글로불린 아형의 특정 기여도를 더 잘 분석하기 위해 이전에 생성한 IgMi 및 IgG1i 마우스를 사용했습니다. IgMi 마우스는 모든 B 세포가 IgM을 발현하지만 클래스 스위치나 항체를 분비할 수 없는 마우스입니다. IgG1i 마우스에서 모든 B 세포는 B 세포 수용체로 IgG1을 사용하여 발달하지만 이 세포도 클래스 전환이 불가능하지만 IgG1 항체를 분비할 수 있습니다. 우리는 C57BL/6 유전적 배경에서 IgMi 및 IgG1i 마우스를 103 L. major로 감염시켰습니다. 우리는 혈청 내 IgG1의 존재가 야생형 동물과 유사하게 마우스가 기생충에 대한 완전한 반응을 일으키기에 충분하다는 것을 발견했습니다(그림 5A). 대조적으로, IgMi 마우스에서 볼 수 있는 분비된 항체의 부재는 마우스의 회복을 지연시키기에 충분했습니다(그림 5A).

다음으로 IgMi 마우스 또는 야생형 컨트롤을 NMS 또는 IS로 재구성한 다음 L. major promastigotes로 감염시켰습니다. 예상대로, 두 마우스 계통에서 IS 재구성은 생체 내에서 훨씬 더 작은 병변을 유도하여 DC에 의한 IgG 매개 가속 기생충 흡수가 개선된 항-리슈만편모충증을 촉진함을 확인했습니다.면역(그림 5B). 마지막으로, 우리는 옵소닌화된 기생충을 사용한 후 질병 결과를 평가했습니다. IgMi 마우스 감염 전에 NMS, IS 또는 PL 혈청이 풍부한 IgG로 기생충을 옵소닌화했습니다(그림 5C). 그림 5B에 표시된 실험과 일치하여 IS-opsonized 기생충은 향상된 기생충 방어를 촉진했습니다. 다시 말하지만, 항인지질 항체는 감염 전에 L. major promastigotes에 결합된 두 IgG 항체가 IgMi 마우스의 더 나은 질병 결과를 촉진한다는 점에서 IS의 Leishmania 특이적 IgG를 대체할 수 있었습니다. IS 및 PL 옵소닌화 기생충은 옵소닌화되지 않은 기생충에 비해 훨씬 작은 병변 부피와 조기 치유를 유도했습니다.

중요하게도, IgMi 마우스에 NMS를 투여하면 C57BL/6 마우스에서 관찰된 질병 결과에 대한 표현형이 "정상화"되었습니다(그림 5B). 이러한 결과는 위에 표시된 데이터와 일치하며 NMS에는교차 반응성시험관 내 및 생체 내에서 후속 기능적 결과와 함께 기생충에 결합할 수 있는 항체 IgG 이소형. 추가 확인은 감염을 더 잘 제어할 수 있는 NMS 코팅된 기생충에 감염된 IgMi 마우스에서 나옵니다(그림 5C).

무화과. 4항체 옵소닌화된 기생충은 B 세포 결핍 μMT에서 효율적인 면역을 유도합니다. 기생충은 정상 마우스 혈청(NMS), 면역 혈청(IS), 항인지질 항체(a-PL)를 포함하는 혈청 또는 — C57BL/6 마우스만 — 항- 2 당단백질 항체(2G)를 포함하는 혈청으로 옵소닌화되었습니다. 프로이트 보조제(FA)의 존재. 5 μMT 이상의 마우스 그룹을 L. major의 103개의 옵소닌화된 메타사이클릭 프로마스티고테스로 감염시켰습니다. 병변 발달을 매주 평가하였다. B 6주차에 감염된 μMT 마우스의 병변 기생충 부하는 희석 분석을 제한하여 결정했습니다. 개별 기생충 번호가 표시됩니다. 막대는 수단을 표현합니다. 수용성 Leishmania 항원(SLA)을 사용한 재자극에 의해 배액 μMT LN 세포의 C 사이토카인 프로필을 결정했습니다. 48-h 상층액으로의 IFNΓ, IL{{10}} 및 IL-10 방출은 ELISA(평균±SEM, n=15 마우스/그룹 3개의 실험, *p 0.05 이하, **p 0.005 이하, 및 ***p 0.002 이하, 비옵소닌 기생충에 감염된 마우스와 비교)

인간 혈청에는 기능적으로 활성인 기생충 교차 반응 항체가 포함되어 있습니다.

인간에 대한 우리 연구 결과의 관련성을 테스트하기 위해 B 세포 결핍 μMT 마우스에서 분리된 promastigotes 또는 amastigotes는 정상 인간 혈청(NHS), L. 주요 감염 환자(LM)의 혈청 또는 APS 환자(APS)의 혈청으로 옵소닌화되었습니다. ). 기생충의 표면 결합 IgG는 유세포 분석을 사용하여 결정되었습니다. 흥미롭게도 LM 혈청은 promastigotes의 표면에 약하게 결합하지만 amastigotes에는 강하게 결합합니다. 흥미롭게도 APS 혈청에는 유사한 수준의 IgG가 포함되어 있습니다.교차 반응성기생충 표면(그림 6A).

다음으로 단백질 A 컬럼을 사용하여 LM 혈청으로부터 IgG를 농축했습니다(그림 6B). 환자의 다양한 (면역) 장애 치료에 사용되는 이 농도와 여러 농도의 정맥내 면역글로불린(IVIG)은 다음으로 유세포 분석 전에 기생충 옵소닌화에 사용되었습니다. Leishmania IgG는 L. major의 promastigotes 및 amastigotes에 상당히 결합되어 있습니다. 흥미롭게도 상업적으로 이용 가능한 IVIG에는 다음과 같은 IgG가 포함되어 있습니다.교차 반응promastigote 뿐만 아니라 amastigote 기생충 준비와 둘 다.

마지막으로, Buffy coat의 CD1c와 1차 골수성 인간 DC를 LM 혈청 또는 APS 환자 또는 IVIG의 혈청과 함께 배양한 L. major의 μMT amastigotes와 함께 배양했습니다(MOI 3; 그림 7). 인간 세포를 사용하여 뮤린 데이터를 확인하면 IgG(교차 반응성또는 Leishmania 특정) Leishmania 표면에 향상을 촉진 하기에 충분기생물내면화DC에 의해. APS 혈청은 감염된 DC의 비율을 거의 100% 증가시킨 반면, LM 혈청 및 IVIG는 옵소닌 처리되지 않은 기생충에 비해 기생충 섭취를 30% 증가시켰습니다. 흥미롭게도 NMS 혈청에는 기생충 반응성 IgG 촉진도 포함되어 있습니다.기생물내면화.

무화과. 5 다른 혈청으로 재구성되거나 다른 정제된 IgG opsonized L. major로 감염된 C57BL/6, IgMi 및 IgG 마우스는 개선된 질병 결과를 나타냅니다. 5마리 이상의 C57BL/6, C57BL/6 IgMi 또는 IgGi 마우스 그룹에 L. major의 생리학적 저용량 접종물(103 metacyclic promastigotes)을 감염시켰습니다. B 감염 1주 전에 C57BL/6 및 B6 IgMi 마우스를 100 µL의 정상 마우스 혈청(NMS) 또는 면역 혈청(IS)으로 두 번 재구성했습니다. C IgMi 마우스를 감염시키기 전에 단백질 A 컬럼[정상 마우스 혈청(NMS), 면역 혈청(IS) 또는 항인지질 항체(a-PL) 함유 혈청]에 결합하여 혈청이 풍부한 IgG로 기생충을 옵소닌화했습니다. A–C 병변 발달은 매주 평가되었습니다(평균±SEM, n=10 마우스/그룹 독립적인 2 실험, *p 0.05 이하, **p 0.005 이하, *** p C57BL/6[A], C57BL/6 또는 IgMi[B]와 비교하여 0.002 이하, 또는 없음[C])

무화과. 6인간 혈청의 항인지질 항체는 L. 주요 표면 분자와 교차 반응합니다. μMT 마우스에서 분리된 L. major의 병변 아마스티고트 또는 고정상 배양에서 얻은 메타사이클릭 프롬스티고트는 다양한 유형의 인간 혈청(5%) 또는 정제된 IgG로 옵소닌화되었습니다. 정상 인간 혈청(NHS)은 건강한 대조군 대상체로부터 얻었다. 입증된 피부 리슈만편모충증 환자(LM, Marocco, n=4) 및 항인지질 증후군 환자(PL, n=3)의 혈청도 사용되었습니다. 단백질 A 컬럼(n=3)을 사용하여 LM 혈청으로부터 B IgG를 농축했습니다. 다양한 농도의 정맥내 면역글로불린(IVIG, n=2)이 사용되었습니다(μg/mL). A 및 B 기생충은 유동 세포측정법을 사용하여 전체 인간 Ig의 표면 결합에 대해 분석되었습니다. Ig의 결합은 옵소닌 처리되지 않은 기생충의 기준 수준과 관련하여 계산되었습니다(평균±SEM, *p 0 이하.05, **p {{10 이하 }}.005 및 ***p 0.002 이하)

논의

피부 리슈만편모충증의 치유에는 효율적인 T 세포 프라이밍 및 IFN 방출이 필요하며, 둘 다 순진한 T 세포에 항원을 제시하기 위해 감염된 DC에 의존합니다. MΦ에 의한 CR3- 의존적 식균 작용과는 달리, 우리는기생물내면화DC에 의한 반응은 서로 대체할 수 있는 Fc RI 및 Fc RIII를 통해 발생합니다. 이와 같이, Fc -, Fc RI/ Fc RIII 결핍 마우스 및 B 세포 결핍 μMT 마우스(모두 C57BL/6 배경)는 손상된 DC-로 인해 야생형 마우스와 비교할 때 더 큰 병변과 치유 지연을 발생시켰습니다. 의존적 T 세포 프라이밍. 우리의 현재 연구는 이러한 이전 관찰을 확인하지만, IgMi 및 IgG 마우스를 사용한 우리의 데이터는 또한 B 세포의 단순한 존재가 아니라 실제로 분비된 항체가 기생충에 효과적인 반응을 일으키는 데 중요하다는 것을 시사합니다. 이와 같이, B 세포 결핍 마우스와 유사하게, IgG를 생산할 수 없는 B 세포를 가진 IgMi 마우스는 IgGi 마우스 또는 야생형 마우스에 비해 더 큰 병변 크기를 나타냈다.

NMS와 IS opsonized amastigotes는 비슷한 정도로 취해졌고 NMS opsonized promastigotes는 DC에 의해 식균되지 않았기 때문에(IgM이 표면에 효율적으로 결합됨) 이전에 IgM이 기생충 섭취에 필요하지 않다고 결론을 내렸습니다. 본 연구에서 우리는 B 세포가 전혀 없거나 분비된 항체만 있는 마우스에서 정상적인 마우스 혈청을 사용하여 이러한 결과를 확인할 수 있었습니다. 또한, 우리는 IgG1- 함유 혈청이 인간 및 마우스 DC 모두에 아마스티고테스의 진입을 향상시킬 수 있음을 보여줄 수 있었습니다.

감염된 DC가 없을 때 초기 B 세포 반응이 어떻게 발생하는지는 아직 해결되지 않았습니다. 한 가지 가능성은 "천연" IgG 풀에서교차 반응성항체는 기생충을 인식하고 나중에 발생하는(감염 후 4주에서 6주 사이에 상승) Leishmania 특정 항체의 대체물 역할을 할 수 있습니다. 항원 특이적 항체 외에도 출생 후 생쥐와 인간 모두에서 B-1 세포에 의해 소위 천연 항체가 생성됩니다. 일부는 자기 항원을 인식하는 능력이 있습니다. 오랫동안 외부 항원에 대한 특이성이 부족하다고 여겨졌습니다. 나중에 데이터는 다양한 미생물 항원을 인식하고 병원체 제거에 기여하는 천연 IgM에 대한 증거를 제공했습니다. 그러나 최근 여러 연구에서 천연 IgG가타고난 면역또한. 병원체 관련 렉틴(예: MBL)과 상호 작용하고 병원체를 제거하기 위한 면역 복합체를 형성하는 것으로 나타났습니다. 병원체 결합 천연 IgG는 또한 고전적인 보체 경로를 활성화하기 위해 C1q와 같은 다른 PRR과 상호 작용할 것으로 예상됩니다. 천연 IgG는 특히 병원체 관련 렉틴과 협력하여 기회성 Pseudomonas aeruginosa 및 Staphylococcus aureus 감염에 대한 효과적인 항균 작용을 유도하는 것으로 나타났습니다.

아폽토시스성 세포 사멸 동안, 아폽토시스체에 대한 포스파티딜세린(PS) 노출이 관찰된다. 항체를 통한 죽어가는 세포 또는 죽은 세포의 표면에서 PS를 숙주가 인식하는 것은 이들의 클리어런스에서 중요한 단계입니다. "아폽토시스 모방(apoptotic mimicry)"이라 불리는 과정에서, 리슈만편모충 기생충은 또한 아폽토시스 세포에 의해 보이는 것과 유사한 식세포에 대한 "먹어라" 신호 역할을 하는 자신의 표면에 PS를 노출시키는 것으로 알려져 있습니다. 더욱이, 일부 감염 단계 무도회는 (카스파제의 개입 없이) 죽고 PS 자체를 노출시킵니다. 세포내 아마스티고트 생명체를 의무화하지만, 모두 표면에 PS를 노출하여 숙주 세포에 효율적으로 들어갈 수 있도록 합니다. 우리는 이제 인공적으로 유도된 PL 항체가 Leishmania 기생충을 인식할 수 있는지 여부와 관련 숙주 세포로의 기생충 진입을 촉진하기 위해 기능적으로 활성인지 여부를 평가했습니다. 쥐와 인간의 항인지질 항체가 Leishmania 생명체에 결합하는 것을 관찰했습니다. 다양한 접근 방식을 사용하여교차 반응성L. major의 표면 인지질에 우선적으로 결합하는 것으로 보이는 PL 혈청의 항체. 흥미롭게도, ELISA에서 이 기생충 생명체의 가용성 기생충 항원을 사용하여 입증된 바와 같이 promastigote 기생충도 이러한 인지질을 발현하더라도 표면 인지질은 아마스티고트에 더 강하게 노출되는 것으로 보입니다. 또한, 우리는 이 IgG 옵소닌화가 DC에 의한 기생충 흡수를 촉진하기에 충분하다는 것을 보여주었습니다. 중요한 것은 생체 내에서 PL 옵소닌화된 기생충이 더 작은 병변 부피와 더 빠른 병변 해결로 개선된 질병 결과를 유도했다는 것입니다. 따라서 우리 그룹의 사전 관찰과 일치하여(교차 반응)기생충에 대한 IgG, Th1/Tc1 세포의 우선적 유도는 Th2 및 Treg 세포의 수 감소와 관련하여 유도되어 더 나은 질병 결과를 가져왔습니다.

그림 7인간 혈액의 일차 골수성 DC는교차 반응성그들의 표면에 결합된 항인지질 IgG. CD1a + 골수 인간 DC는 MACS 비드를 사용하여 버피 코트에서 분리하고 2×105 세포/mL로 플레이팅했습니다. μMT 마우스에서 분리된 Amastigotes는 DC(1:3)와 동시 배양하기 전에 5% 혈청 또는 10 μg/mL IVIG와 함께 배양되었습니다. 18시간 후, 광학 현미경으로 시토스핀에서 감염률을 측정했습니다(n=3, *p는 0.05 이하, ***p는 옵소닌 처리되지 않은 대조군과 비교하여 0.002 이하).

흥미롭게도 우리는 NMS로 옵소닌화된 기생충이 옵소닌화된 기생충에 비해 더 나은 질병 결과를 촉진한다는 것을 발견했습니다. 이는 Leishmania를 인식할 수 있는 NMS에서 천연 IgG의 존재를 나타냅니다. 이것은 NMS로 대체된 IgMi(모든 IgG를 생산할 수 있는 B 세포가 없음)에서 가장 잘 볼 수 있습니다. 여기에서 IgMi 마우스의 분명히 더 큰 병변 크기는 야생형 C57BL/6 마우스의 병변 크기로 감소했습니다(그림 5). 그러나 자연적인 Leishmania의 존재는교차 반응성IgG는 NMS 옵소닌화 기생충에 감염된 야생형 마우스에서도 옵소닌화되지 않은 기생충과 비교하여 관찰되었습니다. 뮤린 및 인간 혈청에서 이들 천연 IgG의 특이성은 현재까지 불분명하다. 이들은 또한 promastigotes에 비해 알려진 높은 PS 노출로 amastigotes에 우선적으로 결합하기 때문에 기생충 표면에서 PS를 인식하는 항체라고 추측하고 싶습니다.

우리는 건강한 인간 대조군 피험자의 혈청(리슈만편모충증이 여행 질병으로만 보고되고 이전 감염 이력이 없는 지역 출신)도 L. 주요 아마스티고테스에 결합할 수 있고 DC에 의한 향상된 기생충 섭취를 촉진할 수 있는 IgG를 포함하고 있음을 발견했습니다. 우리 연구에 사용된 IVIG는 독일 내에서 제조되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다(레슈만편모충증에 대한 비특이성). 흥미롭게도, Leishmania 음성 개인의 IVIG에서 풍부한 인간 IgG는 promastigotes와 (아마도 더 높은 PS 노출로 인해) L. major amastigotes에 결합할 수 있는 IgG를 포함했습니다. 인라인으로, 높은 수준의 항 인지질 항체를 가진 APS 환자의 혈청에는 promastigotes보다 적은 amastigotes에 우선적으로 결합하는 IgG가 포함되어 있습니다. APS 혈청의 IgG와 IVIG의 IgG는 리슈만편모충증 환자의 면역 혈청 유래 IgG에 필적하는 수준(또는 PL 함유 APS 혈청의 경우 더 우수함)으로 1차 인간 DC에 의한 향상된 기생충 흡수를 촉진했습니다.

요약하면, 우리의 데이터는 Leishmania에 노출된 적이 없는 개인으로부터 채취한 일반 마우스와 인간 혈청에도 이 기생충에 결합할 수 있는 IgG 항체가 포함되어 있어 DC에 의한 삼켜짐을 촉진하고 주인. 인식된 Leishmania 항원이 완전히 명확하지 않더라도 일부 반응성은 promastigote 표면에 비해 아마스티고테에 더 풍부한 인지질에 대한 것일 수 있습니다. 우리의 연구 결과는 이 기생충에 대한 더 나은 치료법을 설계하는 길을 열어줄 수 있으며 Leishmania에 감염된 지역을 여행하는 개인을 위한 첫 번째 예방 조치가 될 수도 있습니다.

감사의 말

저자는 유익한 토론과 환자 샘플 제공에 대해 Mark C. Udey와 Philipp von Landenberg에게 진심으로 감사드립니다.

저자 기여 

FD, SLK 및 ST는 이 원고에 설명된 실험을 수행했습니다. ST, AW 및 EvS는 프로젝트 자금을 확보하고 작업을 감독했습니다. AW와 EvS가 원고를 작성했습니다.

펀딩

Projekt DEAL에 의해 활성화되고 조직된 오픈 액세스 펀딩. 이 연구는 DFG(EvS 및 AW에 대한 SFB 490 및 EvS, AW 및 ST에 대한 SFB 1292) 및 EvS에 대한 CMMC(Center for Molecular Medicine) 쾰른의 자금으로 지원되었습니다.

데이터 및 자료의 가용성 

적용되지 않습니다.

선언

윤리 승인 및 참여 동의

생쥐에 대한 모든 실험은 Rhineland Pfalz주의 지침에 따라 수행되었습니다.

게시 동의

모든 저자는 게시에 동의합니다.

경쟁 관심

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

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