인간 신장 관류 중 사이토카인 흡수는 지연된 이식편 기능과 관련된 염증성 유전자 서명을 감소시킵니다
Mar 26, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
존 R. 퍼디난드1,2|사라 A. 호스굿2,3|톰 무어2,3|애슐리 페로1|크리스토퍼 J. 워드1|토마스 카스트로-도피코1|마이클 L. 니콜슨2,3|Menna R. Clatworth1,2
1 Molecular Immunity Unit, University of Cambridge 의과대학 분자생물학 연구소, Cambridge, UK
2 영국 케임브리지 장기 기증 국립보건연구원 혈액 및 이식 연구부
3 영국 캠브리지 캠브리지 대학교 외과
이식은 대부분의 말기 환자에게 최적의 치료법입니다.신장질병그러나 장기 부족이 주요 과제입니다. 정상 체온 기계 관류(NMP)는 변연 기관을 재조정하는 데 사용되었습니다. 그러나 NMP가 기관에 도움이 될 수 있는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 동일한 기증자로부터 얻은 한 쌍의 인간 신장을 사용하여 NMP와 저온 저장의 효과를 전 세계적으로 비교했습니다.신장전사체. 우리는 저온 저장이 염증 경로 유전자와 산화적 인산화(OXPHOS)와 같은 에너지 생성 과정에 필요한 유전자 발현을 전반적으로 감소시킨다는 것을 발견했습니다. 대조적으로, NMP 동안 OXPHOS 유전자의 현저한 상향 조절이 있었지만 다수의 면역 및 염증 경로 유전자도 증가했습니다. 이후 이식된 NMP를 받는 신장의 생검을 사용하여, 우리는 지연된 이식 기능(DGF)이 연장된 장기에서 더 높은 염증성 유전자 발현이 발생한다는 것을 발견했습니다. 따라서 우리는 헴 흡착제(HA)를 사용하여 전염증성 사이토카인을 제거했습니다. 이 약화된 염증성 유전자 발현은 OXPHOS 경로 유전자를 증가시켰고 DGF 관련 유전자 서명의 발현을 감소시키는 데 잠재적으로 임상적으로 중요한 효과를 가졌습니다. 함께, 우리의 데이터는 관류액에서 전염증 매개체의 흡착이 장기 생존력을 향상시킬 수 있는 잠재적인 개입을 나타냄을 시사합니다.
키워드:임상 연구/실습, 지연 이식 기능(DGF), 기증자 및 기증: 사망,신장(동종 이식) 기능 / 기능 장애,신장질병: 면역/염증, 신장
1. 소개
신장이식은 대부분의 환자에게 최적의 치료법입니다.마지막 단계신장질병, 삶의 질과 양 모두에 대한 이점이 있습니다.1 장기 부족은 주요 과제이며, 사망한 순환기 사망(DCD) 기증자 및 확장 기준 기증자(ECD) 사용을 포함하여 이용 가능한 신장 수를 늘리기 위해 여러 전략이 사용되었습니다. ), 둘 다 뇌간 사망(DBD) 기증자에 비해 이식 기능 지연(DGF)의 더 높은 비율과 관련이 있습니다.2,3 DCD 신장에서 순환 중단 과정에서 온난한 허혈에 노출되면 DGF에 상당한 기여를 합니다. . DGF는 허혈성 세뇨관 세포 손상 또는 사멸로 인해 발생하며, 이는 NLRP3 인플라마솜 어셈블리를 통해 선천성 면역 활성화를 자극하여 인터루킨(IL)1 및 IL18을 생성할 수 있습니다.4-6 실제로 소변에 염증성 사이토카인이 존재한다는 사실이 밝혀졌습니다. 의 바이오마커로 사용심각한신장부상및 DGF.7-9
정상 체온 기계 관류(NMP)를 사용하면 보체 및 호중구를 비롯한 순환 면역 구성 요소가 없는 상태에서 이식된 장기에 따뜻한 산소가 함유된 적혈구를 관류할 수 있습니다.{0}} 이 과정은 변연 기관15을 평가하고 " 국가 장기 할당 서비스를 통한 제안에 따라 처음에 거부된 신장 이식을 용이하게 하기 위해 "장기를 재조정"합니다.16 NMP를 사용한 우리의 이전 경험은 DCD 신장에서 DGF를 예방하는 효능을 평가하기 위한 무작위 대조 시험의 근거를 제공했지만17 NMP가 이식 신장에 도움이 될 수 있는 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 또한, 추가 조작 여부에 대한 문제신장예를 들어 관류액에서 전염증성 사이토카인과 케모카인을 제거함으로써 NMP 동안 NMP는 이식 전에 장기를 최적화하는 데 추가적인 이점을 제공할 수 있지만, 돼지 NMP에 대한 우리의 연구는 유망한 결과를 보여주었습니다.18
여기에서 우리는 인간의 전사체 분석을 사용하여 이 두 가지 질문을 해결하기 위해 편향되지 않은 접근 방식을 취했습니다.신장유전자 발현의 전체적인 변화를 평가하기 위해 NMP의 시작과 끝에서 생검. 우리는 단일 기증자의 인간 신장 쌍을 사용하여 동일한 유전적 배경을 가진 장기에 대한 다양한 개입의 효과를 비교할 수 있었고 이식 결과 예측에 대한 이러한 변화의 영향을 평가할 수 있었습니다.
Cistanche 추출물의 이점: 급성 예방신장부상
2. 결과
2.1. 한 쌍의 신장은 유전적으로 유사하며 중재 평가에 유용한 모델입니다.
우리는 각각 5쌍의 신장을 포함하여 총 10쌍/20 인간 신장을 만드는 두 개의 독립적인 연구에서 장기 보존 및 NMP와 관련된 전사 변화를 조사했습니다. 이 중 2개는 DBD에서, 8개는 DCD 기증자에서 왔습니다(표 S1, S2 및 그림 S1). 이 연구에서 우리는 중재 전후(저온 저장 또는 NMP) 대뇌 피질 생검을 수행하고 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)을 사용하여 전사 환경을 조사했습니다. 한 쌍의 신장과 한 쌍의 생검 사용신장생물학적 변이를 제어하고 분석에서 이 교란자를 회귀시킬 수 있었습니다(그림 S2A). 우리는 확인했습니다신장쌍은 공통 전사 환경(그림 S2B)으로 시작하고 각각에 다른 개입을 적용합니다.신장한 쌍으로 생물학적 변이와 무관한 개입의 효과를 연구할 수 있습니다.
그림 1 저온 저장에 노출된 신장은 NMP를 겪는 신장과 비교하여 제한된 유전자 발현 변화를 보여줍니다. 이식에 사용하기 위해 거부된 한 쌍의 신장을 얻었다. 하나신장정적 저온 저장에서 유지되었고 다른 하나는 정상 온도 기계 관류(NMP)를 거쳤습니다. 시작 시와 2시간 후에 외부 피질에서 생검을 수행했습니다. B, 시작과 비교하여 표시된 그룹에 대한 2시간에서의 유전자 발현의 변화를 나타내는 화산 플롯. 빨간색 점은 조정된 P-값으로 차등적으로 발현된 유전자를 나타냅니다.<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">
그림 2 지연된 이식 기능의 길이와 NMP 후 전사체의 상관관계. 유전자 발현은 무작위 임상 시험의 일부로 NMP 이후에 채취한 생검에서 DGF의 길이와 상관관계가 있었습니다. 결과와 가장 큰 상관관계가 있는 1000개 유전자의 발현 수준이 플롯되었습니다. B, GSEA는 특징 데이터 세트에 대한 A의 상관 관계에 대해 수행되었습니다. 중요한 경로만(FDR q 값<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">
2.2. NMP는 냉장 보관에 비해 OXPHOS 및 염증 경로 유전자의 증가를 초래합니다.
NMP가 신장에 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 메커니즘을 조사하기 위해 처음에는 5가지신장쌍(n {{0}} DCD 기증자와 n=1명의 뇌간 사망 [DBD] 기증자, 그림 S1, 표 S1) 및 시간 0(0시간) 피질 생검을 수행했습니다. . 이 시점에서 신장은 앞에서 설명한 대로 정적 저온 저장 또는 NMP로 무작위화되었습니다(그림 1A). 2시간 후, 양쪽 신장에서 두 번째 생검을 실시하고 RNA-Seq를 수행했습니다. 0- 시간과 2-시간 생검 사이의 유전자 발현을 비교할 때 정적 냉장 보관에 보관된 신장은 여러 테스트를 위해 수정했을 때 개별 유전자의 발현에 통계적으로 유의한 변화가 없음을 발견했습니다(그림 1B , 왼쪽 패널). 대조적으로, NMP의 2시간 동안 956개의 유전자가 상향 조절되었고 353개의 유전자가 하향 조절되었습니다(그림 1B, 오른쪽 패널). 다음으로 우리는 개별 유전자가 아닌 수십 또는 수백 개의 유전자를 비교하여 공통 경로 내에서 유전자 그룹의 발현 변화를 평가하여 생물학적 개체 간 변이가 분석에 미치는 영향을 더욱 줄였습니다. 이것은 기능적으로 중요한 경로의 변화를 드러냈고, 여기서 해당 경로 내의 각 개별 유전자의 발현은 통계적 유의성에 도달하기에 충분한 크기로 변경되지 않았습니다. 이 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은 저온 저장이 여러 대사 경로에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다(그림 1C, 왼쪽 패널). 특히, ATP 생성에 필요한 핵심 경로인 산화적 인산화(OXPHOS)와 관련된 유전자의 현저한 감소가 있었습니다.19 대조적으로, OXPHOS는 NMP 동안 상당히 상향조절되는 경로 중 하나였으며(그림 1C, 오른쪽 패널) 잠재적인 이점이 있습니다. 세포 생존과 세포 항상성의 회복을 위해. 또한 NMP 동안 면역 또는 염증 과정과 관련된 여러 경로가 유도되었으며 "NFkB를 통한 TNF 신호 전달"이 가장 크게 증가했습니다. 이에 따라 TNF, IL1B 및 호중구 모집 케모카인 CXCL8(IL8) 및 CXCL2는 2-시간 NMP 생검에서 가장 상향 조절된 유전자 중 하나였습니다(그림 1D). 상위 50개 상향 조절된 유전자의 문자열 분석은 4개의 주요 노드로 클러스터링된 생화학적으로 관련된 유전자의 상향 조절을 밝혀냈습니다. IL8 및 호중구 모집 케모카인, Inflammasome 관련 유전자, NFkB 신호 전달 및 전사 조절(그림 1E). 참고로, DBD 및 DCD 신장은 기준선에서 전사적으로 유사했으며(그림 S2C), NMP 동안 변화하는 유전자 경로는 DBD 및 DCD 신장에서 유사했습니다(그림 S2D). 함께, 우리의 분석은 NMP 동안 에너지 생성을 촉진하는 유전자의 발현이 증가하여 기관에 잠재적으로 유익한 효과가 있지만 동시에 해로울 수 있는 전염증성 유전자의 유도가 있음을 보여줍니다.
Cistanche tubulosa 추출물: 신장 기능 개선
2.3. 장기간 지연된 이식 기능과 관련된 NMP 신장의 염증 경로 유전자
저온 저장 및 NMP 동안 발생하는 전사 변화를 임상 결과와 연결하기 위해 현재 NMP의 효능을 평가하는 무작위 임상 시험의 일부로 NMP를 받은 33개의 DCD 신장에서 채취한 생검에 대해 RNA-Seq를 수행했습니다. 후속적으로 이식된 연구의 NMP 부문에 무작위로 배정된 신장의 하위 집합(표 S3, 그림 S1). DGF는 DCD 신장에서 더 흔하며 전통적으로 이식 후 첫 주에 투석이 필요한 것으로 정의됩니다. 그러나 이식 직후에 일부 환자는 고칼륨혈증에 대한 단일 투석을 받으며 이것이 반드시 심각한 급성 세뇨관 괴사의 존재를 반영하는 것은 아닙니다. 따라서 우리는 이식 수술과 마지막 투석 세션(즉, DGF의 기간) 사이의 시간과 유전자 발현을 상관시키는 모델을 사용했습니다. 이것은 이식 후 처음 24시간 이후에 투석을 필요로 하는 이식에서 더 현저한 전사 변화를 보여주었을 뿐만 아니라(그림 2A) "NFkB를 통한 TNFA 신호 전달" 및 "염증 반응" 경로를 포함한 염증 경로 유전자의 발현 사이에 상당한 양의 상관 관계를 보여주었습니다. DGF의 길이, 이식 후 더 연장된 DGF를 경험한 신장에서 이러한 경로의 더 큰 농축과 함께(그림 2B). 반대로, DGF의 길이는 "OXPHOS" 경로 유전자의 발현 크기와 음의 상관관계가 있습니다(그림 2B). 종합하면, 이들 데이터는 NMP 다음으로 염증 경로 유전자의 발현이 더 낮고 "OXPHOS" 경로 유전자의 발현이 더 높은 신장이 이식 후 연장된 DGF에 덜 민감하다는 것을 나타낸다. 이것은 NMP 동안 발생하는 분자 변화가 유익한(OXPHOS 경로 유전자의 유도) 효과와 해로운(염증 경로 유전자의 유도) 효과를 모두 가질 수 있다는 결론을 뒷받침합니다.
2.4. NMP 동안의 소변 배출과 신장 혈류는 OXPHOS 및 염증 경로 유전자와의 다른 연관성을 보여줍니다
NMP 동안 생성된 소변의 양은 장기 사용 결정을 안내하는 데 사용되는 외과적 품질 평가 점수에 포함된 여러 매개변수 중 하나이지만,15 NMP 동안의 높은 소변 생산량이 신장 및 에서 활성화된 기본 분자 경로에 대한 좋은 예후를 나타내는지 여부 소변량이 많은 신장은 불분명합니다. NMP를 시행하는 총 10개의 신장(NMP 전용 신장, 표 S1 및 S2, 그림 S1)에서 우리는 2-시간의 관류 기간 동안 0에서 340ml의 소변 배출 범위를 관찰했습니다. (그림 3A 왼쪽 패널). 참고로, 두 개의 독립적인 실험에서 5개의 신장에서 NMP 동안 변화하는 경로를 비교할 때 유사한 경로가 유도되었음을 발견했습니다(그림 S3A). 이는 실험 설계의 재현성과 개별 유전자가 아닌 경로 비교의 유용성을 확인시켜줍니다. 관류 후 2-시간 생검에서 11개 유전자의 발현은 이 기간 동안 생성된 소변량과 유의한 상관관계가 있었습니다. 여기에는 열 충격 단백질(HSP), HSPA1A, HSPA1B 및 HSPH1이 포함되었으며, 이는 증가된 소변 생산량과 양의 상관관계가 있습니다(그림 3A 오른쪽 패널). 유전자 세트 농축 분석은 소변 출력이 "NFkB를 통한 TNF 신호 전달" 경로 유전자와도 양의 상관 관계가 있고 관류 후 생검에서 OXPHOS 유전자와 음의 상관 관계가 있음을 보여주었습니다(그림 3B, S3C). 유사하게, 관류 전 생검에서 OXPHOS는 이러한 신장의 소변 생산량과 음의 상관 관계가 있는 반면 "NFkB를 통한 TNF 신호 전달" 및 "동종 이식 거부"를 포함한 면역 활성화와 관련된 경로는 소변 생산량과 양의 상관 관계가 있어 NMP가 이러한 과정에 거의 영향을 미치지 않음을 시사합니다 , 또는 분석된 다른 경로에서 높은 소변 배출 신장(그림 3B, S3C-D). DGF가 연장된 임상 샘플에서 염증 경로 유전자의 유도가 관찰되었기 때문에(그림 2B), 이러한 데이터는 높은 소변 생산량이 더 생존 가능하고 "건강한" 신장에서 발생한다는 교리에 도전하고 실제로 이러한 신장이 더 많은 염증 잠재력은 에너지를 생성할 수 없으며 이는 NMP 동안 실질적으로 변경되지 않습니다.
관류 중 신장 혈류는 후속 이식 기능을 반영할 수 있는 매개변수로 평가되었습니다.15 연구된 10개의 신장에서 2시간의 관류 시 신장 혈류는 14.1에서 168.8 ml/분으로 다양했습니다(그림 3C 왼쪽 패널). 2-시간 후 관류 생검에서 HSPA1L을 포함하여 8개의 유전자가 신장 혈류 증가와 유의하게 양의 상관관계가 있었지만(그림 3C 오른쪽 패널), 이 유전자 목록과 소변 배출과 관련된 항목 간에 직접적인 중복은 없었습니다(그림 3A ). 유전자 세트 농축 분석은 0-시간 생검에서 높은 신장 혈류가 OXPHOS 유전자와 양의 상관관계가 있음을 보여주었지만, 가장 높은 소변 생산량과 대조적으로 관류는 상당한 영향을 미쳤으며 결과적으로 "OXPHOS"와 음의 상관관계가 나타났습니다. 2시간까지 경로 유전자를 제거합니다(그림 3D, 그림 S4A-B). 신장 혈류는 0- 및 2-시간 생검(그림 3D, 그림 S4B)에서 소변 배출(그림 3B, 그림 S3C)과 대조적으로 여러 면역 및 염증 유전자 경로와 음의 상관관계가 있습니다. 이 데이터는 함께 신장 혈류량과 소변 배출량이 더 생존 가능한 신장의 동등한 지표가 아닐 수 있지만 전자가 더 충실하게 식별할 수 있음을 시사합니다.신장DGF가 연장될 가능성이 적습니다.
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2.5. 관류 회로에 헴 흡착제를 추가하면 관류 매개변수에 영향을 미치지 않지만 NLRP3 및 IL1B를 포함한 염증성 유전자 발현을 상당히 감소시킵니다.
의 분석신장perfusate는 저체온 및 NMP가 진행되는 동안 pro-inflammatory cytokine과 chemokine의 농도가 상당히 증가하는 것으로 나타났습니다.20,21 이러한 생리 활성 분자는 신장으로 재순환되어 추가 염증을 유발할 가능성이 있습니다. 이식에 대한 우리의 분석을 감안할 때신장샘플은 NMP 신장에서 TNF 의존성 유전자의 유도가 DGF와 연관되어 있음을 나타내었고(그림 2B), 우리는 관류 회로에서 사이토카인과 케모카인을 제거하면 신장에 대한 잠재적인 유익한 효과와 함께 염증성 유전자 유도를 약화시킬 수 있다고 가정했습니다. 이러한 접근 방식은 전신 염증 반응 증후군 환자22,23에서 일부 효능을 보여주었으며 NMP를 받는 돼지 신장의 신장 혈류 증가와 관련이 있었습니다.18 인간 신장에서 이를 테스트하기 위해 우리는 추가로 5쌍의 신장을 취하여 다음을 수행했습니다. 0, 2 및 4시간에 생검을 수행하여 4시간 동안 NMP를 수행합니다(그림 S1). 각 경우에 분자량이 10-50kDa인 분자를 제거하는 세포질 헴 흡착제(HA)가 각 쌍(NMP + HA) 내 한 신장의 관류 회로에 추가되었습니다(그림 4A). 예상대로 HA의 추가는 관류액에서 다양한 사이토카인 농도를 낮추었지만(그림 4B)신장 혈류, 소변 배출 또는 구성, 산소 소비 및 산-염기 항상성에는 영향을 미치지 않았습니다(그림 4C, 표 S4, S5). 따라서 4시간 이상의 NMP에서 HA는 현재 임상적으로 품질 평가 점수를 생성하는 데 사용되는 관류 매개변수에 영향을 미치지 않았지만 유전자 발현에는 상당한 영향을 미쳤습니다. NMP 후, TNF 및 IL6을 포함하여 1794 및 4026 유전자가 각각 2시간 및 4시간에 상향 조절되었습니다(그림 4D, E). 그러나 HA가 존재할 때 이 숫자의 절반(n=898 및 n=2606)만 증가했습니다(그림 4D, 그림 S5A 및 B). 하향 조절된 유전자의 수도 HA를 첨가하여 감소했습니다(그림 4D). NMP 4시간 후, HA를 첨가하면 46개의 유전자가 유의하게 상향조절되었고 181개는 하향조절되었습니다(그림 4F). 이 감쇠된 전사 반응에는 IL1B, NLRP3 및 CASP1(그림 4G, 그림 S4B)과 같은 NLRP3 인플라마솜 활성화 관련 유전자와 이전에 동물 모델에서 신장 손상과 관련된 일부 호중구 모집 케모카인(그림 S5C)이 포함되었습니다.24,25 이것은 용해성 매개체가신장재순환하고 기관 내에서 염증 유전자의 새로운 발현을 유도하지만 이것은 관류 회로에서 제거함으로써 완화될 수 있습니다.
그림 4 정상 온도 기계 관류 회로에 헴 흡착기를 추가하면 관류액 및 전사체의 사이토카인 수준에 상당한 영향을 미치지만 장비에 기록된 물리적 매개변수에는 영향을 미치지 않습니다. 한 쌍의 인간 신장은 동일한 기증자로부터 채취되었으며, 한 쌍은 표준 NMP(normothermic machine perfusion) 프로토콜을 4시간 동안, 다른 한 쌍은신장회로에 헴 흡착기를 추가하여 NMP를 수행했습니다. 관류 전(0시간), 2시간 후 및 종료 시(4시간) RNA-Seq에 대한 샘플을 채취했습니다. B, NMP 4시간 후 관류액에서 주요 사이토카인의 농도. 선은 신장 쌍을 나타냅니다. 사이토카인 측정은 총 관류액 단백질 함량으로 정규화되었습니다. 명시된 P-값은 HA를 추가하여 사이토카인을 감소시키기 위한 짝을 이루는 t-검정 테스트에서 나온 것입니다. C, 관류의 시간 경과에 따른 소변 생성 및 신장 혈류(RBF). 녹색선은 NMP 단독을 나타내고 헴 흡착제가 추가된 주황색을 나타냅니다. D, 2-hr 또는 4-hr 샘플을 pre({11}}hr) 샘플과 비교할 때 유의하게 다르게 발현되는 유전자 수를 보여주는 벤 다이어그램. 빨간색 다이어그램은 상향 조절된 유전자이고 파란색 다이어그램은 하향 조절됩니다. 교차점은 동일한 방향으로 두 시점에서 차등적으로 발현되는 유전자이다. E, 조직 전사체로부터 관류에 걸쳐 표시된 유전자에 대한 log2 정규화된 발현 값, 표준 오차 막대가 표시됩니다. F, 4시간에 NMP 단독과 NMP + HA의 쌍대 비교를 위한 화산 플롯. 빨간색은 조정된 P 값으로 차등적으로 발현된 유전자를 나타냅니다.<0.05. g,="" as="" for="">
신장 질환 치료 cistanche 추출물
2.6. 지연된 이식 기능 관련 유전자 서명의 감소와 관련된 HA
유전자 세트 농축 분석은 NMP 단독과 비교하여 NMP 플러스 HA 신장에서 "NFkB를 통한 TNF 신호전달" 경로의 상당한 감소를 보여주었습니다(그림 5A-B). 특히, HA의 존재는 내부에서 염증성 유전자 발현을 감소시켰을 뿐만 아니라신장또한 증가된 OXPHOS 및 지방산 대사 경로는 둘 다 에너지 생성에 기여합니다(그림 5A-B). 따라서 HA와 함께 발생하는 유전자 발현 경로의 변화는 "NFkB를 통한 TNFA 신호 전달" 경로 유전자를 감소시키고 "OXPHOS" 경로 유전자를 증가시키기 때문에 그 효과가 임상적으로 유익하다는 결론을 뒷받침할 것입니다. DGF의 기간(그림 2B).
NMP의 전사 변화와 임상 결과 사이의 관계를 추가로 탐구하기 위해 우리는 DGF로 신장에 존재하는 유전자 서명을 선별하고자 했습니다. 우리는 33개의 임상 시험 샘플에서 DGF의 길이와 상관관계가 있는 상위 100개의 양성(UP) 및 음성(DOWN) 조절된 유전자(로그 배수 변화로 순위 지정)를 식별했습니다(그림 5C, 데이터 S1). 우리는 소변 생산량이 더 높은 샘플에서 DGF의 길이 증가와 관련된 유전자 서명의 상당한 농축을 발견했으며(그림 5D), 이는 NMP 동안 높은 소변 생산량이 더 연장된 DGF의 위험에 있는 신장을 식별한다는 것을 시사합니다. DGF 시그니처와 더 높은 신장 혈류와 관련된 유전자 사이에는 통계적으로 유의한 상관관계가 없었습니다(그림 5E). 다음으로 NMP 회로에 HA를 추가하는 것이 DGF "UP" 및 "DOWN" 유전자 특징의 발현에 영향을 미치는지 여부와 방법을 평가했습니다. 놀랍게도, 이는 HA의 첨가에 의해 DGF의 길이 증가와 관련된 유전자 시그니처의 발현이 유의하게 감소되었고, HA의 첨가에 의해 DGF의 감소된 길이와 관련된 시그니처의 발현이 유의하게 증가함을 보여주었다(도 5F).
전반적으로, 우리가 확인한 전사 변화는 NMP가 신장의 에너지 생성에 미치는 영향 측면에서 저온 저장보다 잠재적인 이점이 있음을 시사합니다. 그러나 관류 중에 일부 생리 활성 분자가 신장에서 관류 회로로 방출되어 신장에 다시 들어갈 때 염증을 유발하는 증폭 루프를 생성합니다. 이러한 분자를 제거하면 이 루프가 중단되고 염증을 줄이고 에너지 생성을 증가시켜 NMP의 유익한 효과를 더욱 강화하고 DGF에 대한 감수성을 줄이는 데 유용할 수 있습니다(그림 6).
그림 5 햄 흡착제의 추가는 DGF 관련 유전자 서명을 감소시킵니다. 유전자 세트의 특징 경로에 대한 NMP 4시간 후 전사체에 HA를 첨가한 효과에 대한 GSEA 분석. 중요한 경로만 표시됩니다. 빨간색 점은 양수 농축을 나타내고 파란색 음수는 점의 크기가 FDR q 값과 반비례하고 위치는 정규화된 농축 점수(NES)를 나타냅니다. B, A와의 비교를 위해 Hallmark 데이터베이스의 주요 경로에 대한 GSEA의 농축 플롯. 선은 실행 농축 점수를 나타내고 바이올린 플롯은 각 분석에 사용된 순위가 매겨진 유전자 목록 전체에 걸쳐 유전자 세트의 구성원 유전자 분포를 나타냅니다. C, 상위 4개의 가장 큰 양(UP) 및 음(DOWN) 상관관계가 DGF의 길이와 DGF에 대한 유전자 발현 시그니처의 일부로 사용된 히트맵. 보충 데이터에 제공된 전체 DGF 서명. DF, DGF 관련 유전자 서명을 GSEA와 함께 사용하여 2-hr 소변 출력과 2-hr transcriptome(D), 2-hr RBF의 상관 관계에서 서명의 발현을 조사했습니다. 2-hr transcriptome(E) 및 4시간에 transcriptome에 대한 HA 첨가 효과(F). A에 대한 플롯
그림 6 그래픽 요약. A, 냉장 보관하는 동안 전사가 전체적으로 감소합니다. NMP 동안 산화적 인산화(OXPHOS) 및 TNF, IL8 및 NFkB와 같은 염증 경로 유전자를 비롯한 여러 경로에서 유전자의 발현이 상향 조절됩니다. B 왼쪽 패널, NMP 동안 염증 매개체(노란색 원)가신장관류 용액으로. 그들은 신장에서 전염증성 유전자 전사를 재순환하고 자극하며 에너지 경로 생산 유전자의 감소와 연관되어 ATP를 감소시킵니다. 오른쪽 패널, 헴 흡착기(HA)의 존재는 이 염증 증폭 루프를 깨뜨립니다.
신장 기능을 개선하는 시탕슈 허브
3. 토론
우리의 데이터는 저온 저장이 유전자 발현의 실질적인 변화를 제한하는 데 효과적임을 보여줍니다. 이것은 설치류 모델과 일치하는 것으로, 냉장 보관에서 최대 18시간 동안 보관된 신장이 IL1, TNF 및 IL6을 포함한 전염증성 사이토카인의 발현에 거의 변화가 없는 것으로 나타났습니다. 소수의 후보 유전자를 측정하여 특정 경로에서 발견되는 유전자 그룹의 발현을 분석할 수 있었습니다. 이는 냉장 보관된 신장에서 OXPHOS 및 해당 과정 유전자의 발현이 크게 감소하여 ATP를 생성하는 이러한 신장의 능력을 잠재적으로 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 냉장 보관된 인간 신장에서 ATP 감소를 보여주는 이전 연구와 일치합니다.27 A number 잠재적으로 유익할 수 있는 NFkB 및 반응성 산소 종 경로를 통한 TNF 활성화를 포함하여 저온 저장 동안 전염증성 경로도 하향 조절되었습니다. 그러나 냉장 보관은 이러한 경로를 일시적으로 유지하고 수용자의 재관류 후에 NMP에서 관찰되는 염증성 유전자 발현의 유사한 변화가 발생할 수 있습니다.
NMP는 OXPHOS 및 해당 경로 유전자에 대한 저온 저장에 반대 효과를 나타내어 발현을 증가시켰으며 ATP를 생성하고 항상성을 회복하는 세포 능력을 증가시킬 가능성이 있습니다. 참고로, 인간 신장의 저체온 산소 관류는 저온 저장에 비해 ATP 수준을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 변화는 OXPHOS 경로 유전자의 발현 증가와 DGF 연장 사이의 음의 상관관계를 관찰한 결과 기관에 유익할 가능성이 있습니다.
Hameed et al28의 최근 논문은 NMP를 받는 3개의 신장에서 NMP의 전사체 분석을 수행했습니다. 불행히도 작성자는 데이터를 공개적으로 사용할 수 없도록 했기 때문에 데이터 세트와 심층적인 비교가 불가능합니다. 그러나 그들의 원고는 IL1B, CXCL2 및 TNF를 포함하여 NMP 동안 면역 반응 관련 유전자의 유도를 나타내었으며 이는 우리의 발견과 일치합니다.
임상 시험의 맥락에서 NMP를 겪고 있는 신장에 대한 분석에서, 우리는 유전자 발현 시그니처를 DGF 발생률보다는 DGF의 길이와 연관시켰습니다(이식 후 첫 주 내에 투석이 필요한 것으로 정의됨). 특히, DGF 기간이 1일 이하인 신장은 DGF가 없는 신장과 전사적으로 매우 유사했으며, 이는 진정한 DGF보다는 수술 전후 관련 고칼륨혈증으로 인한 투석 요구 사항을 반영하는 것 같습니다. 우리는 더 긴 DGF가 NFkB 경로 유전자를 통한 TNFA 신호의 더 높은 발현 및 OXPHOS와 관련된 유전자의 더 낮은 발현과 관련이 있음을 발견했습니다. 이러한 데이터는 OXPHOS가 증가하고 면역 신호가 감소된 신장이 기증자의 신장으로서 더 나은 잠재력을 나타낼 수 있음을 시사하지만 이 결론은 더 큰 전향적 연구에서 검증이 필요합니다.
우리는 또한 NMP 동안 소변 배출 및 신장 혈액과 상관 관계가 있는 분자 과정을 평가했습니다. 이러한 매개변수는 이전에 여러 다른 측정과 함께 관류된 신장의 품질 평가 점수를 생성하는 데 사용되었습니다. 높은 요량과 신장 혈류량은 이식편이 더 실행 가능하다는 것을 반영하는 것으로 간주되었습니다.15 우리의 데이터에 따르면 높은 요량량과 높은 신장 혈류량과 상관관계가 있는 경로가 다르며 실제로 이러한 매개변수는 염증 경로와 정반대의 연관성을 보여줍니다. . 높은 소변 배출량은 면역 경로 유전자의 높은 발현과 관련이 있는 반면 높은 신장 혈류는 이러한 경로와 음의 상관 관계가 있습니다. 우리는 또한 우리가 생성한 DGF 유전자 시그니처가 NMP 동안 높은 소변 생산량을 가진 신장에서 풍부하다는 것을 발견했으며, 이는 이 매개변수가 현재의 교리와 달리 더 긴 DGF의 위험이 있는 신장을 식별할 수 있음을 시사합니다. 한 가지 가능한 설명은 매우 높은 소변 배출량은 소변을 농축하는 능력이 부족한 세뇨관 손상이 더 많은 신장을 반영한다는 것입니다. 따라서 소변량과 관련하여 "골디락스 효과"가 있을 수 있습니다. 여기서 소변량이 적거나 적은 신장은 여액 생성에 상당한 이상이 있는 신장이고, 소변량이 매우 많은 신장은 소변 농도를 배제하는 상당한 세뇨관 손상이 있습니다. 이 가설은 이후에 이식된 더 많은 수의 신장에서 테스트해야 합니다.
NMP 4시간 동안 신장에서 염증 유전자가 유도되었습니다. 그러나 현재 임상 실습은 1시간의 NMP만 포함하며 이 효과는 더 짧은 관류 시간 동안에는 분명하지 않을 수 있습니다. 그러나 더 긴 관류는 산소화 및 에너지 생성의 복원 측면에서 이점을 가질 수 있으며 우리 실험에서 면역 유전자 유도의 부정적인 영향은 관류 회로에 세포질 HA를 도입함으로써 실질적으로 무효화될 수 있습니다. 이러한 데이터는 NMP 과정 동안 신장에 의해 생성된 염증 매개체가 관류 회로에 들어가고 멸균 염증을 악화시킬 수 있고 이들의 제거가 NMP 동안 관찰되는 염증 경로 유전자의 유도를 개선한다는 것을 나타냅니다. 중요하게, 우리는 HA의 추가가 임상적으로 더 나쁜 결과와 관련된 유전자의 발현에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 우리의 DGF 유전자 서명은 효능을 평가하는 임상 시험의 일환으로 NMP를 겪는 샘플에서 파생되었으며, 이를 통해 쌍체 신장 연구에서 관찰한 변화를 이식 중인 신장의 임상 종점과 강력하게 연결할 수 있습니다. 그러나 임상 시험의 맥락에서 적용은 신장 이식 전 적용의 유용성을 결정적으로 입증하기 위해 필요할 것입니다. HA는 비특이적이며 장기에 해로운 분자 외에도 도움이 되는 분자를 제거할 수 있습니다. 우리는 신장 전사체에 대한 HA의 순 효과가 유익한 것으로 나타났지만 입증되고 유해한 매개체를 구체적으로 제거하기 위한 개선이 훨씬 더 효과적일 수 있음을 발견했습니다.
우리가 사용한 신장 쌍은 동일한 개인의 것이므로 유전적으로 동일하고 기증자의 생애 동안 유사한 환경을 경험했습니다. 우리는 그들의 시간 0 transcriptome이 매우 유사함을 확인했습니다(그림 S2 A, B). 그러나 이러한 생검은 신장의 작은 부분을 샘플링하고 신장 쌍은 낭종 또는 소혈관 질환과 같은 병리학에 의해 비대칭적으로 영향을 받을 수 있습니다. 추가 경고는 여기에 제시된 중재 실험에 사용된 모든 신장이 이식을 위해 거부되었으며 일부는 품질 스펙트럼의 하단에서 이식된 장기를 나타냅니다. 그럼에도 불구하고 우리는 5개의 신장 그룹에서 유전자 경로를 비교할 때 매우 재현 가능한 결과를 관찰했습니다. 우리는 또한 DCD와 DBD의 신장이 관류에 대해 유사한 반응을 보였다는 것을 입증할 수 있었습니다. 이를 선별된 NMP 이후 DGF 시그니처와 결합하여 잠재적인 임상 이점을 예측할 수 있었습니다. 이 실험적 접근은 임상 시험을 위한 후보 중재의 합리적인 선택을 가능하게 하는 잠재적 치료 효능에 대한 미래의 중재를 스크리닝하기 위한 전임상 도구로 사용될 수 있습니다.
요약하면, 우리의 연구는 NMP를 겪고 있는 인간 신장의 첫 번째 전역 전사 프로파일을 제공하여 저온 저장과 비교하여 NMP에서 활성화되는 다양한 분자 경로를 해결하고 NMP 동안 신장에서 생성되거나 방출되는 생리 활성 분자의 유해한 효과가 HA를 추가하면 되돌릴 수 있습니다. 또한, 이 개입은 연장된 DGF와 관련된 유전자의 발현을 감소시켜 이러한 개입을 미래의 임상 시험에 적용하기 위한 강력한 기계론적 근거를 제공합니다. 우리의 데이터는 또한 간 및 폐 이식을 포함하여 신장 너머의 관류 전략에 대한 의미를 가지며, 이는 NMP가 점점 더 많이 사용되는 이러한 맥락에서 관류액에서 생리 활성 분자의 제거를 조사해야 함을 시사합니다. 마지막으로, 우리의 연구는 쌍으로 된 전역 전사 프로파일링의 유용성을 강조합니다.신장관류 기관에 대한 새로운 개입을 평가하기 위해; 전사 변화는 단백질 풍부도의 변화에 선행합니다(전통적으로신장부상) 및 수만 개의 유전자 전사체를 쉽게 측정할 수 있습니다. 따라서 RNA 측정은 향후 연구에 적용할 수 있는 이식을 위해 회수된 인간 장기의 세포 기능을 조기에 민감하게 판독할 수 있는 가능성이 있습니다.
감사의 말
저자는 모든 장기 기증자와 그 가족에게 감사합니다. Clatworthy Lab은 MRC 분자 생물학 연구소에서 제공하는 핵심 시설에 감사드립니다. 이 작업은 엔지니어링 및 물리 과학 연구의 Tier{2}} 자금을 사용하여 Dell EMC와 Intel에서 제공한 Cambridge Research Computing Service에서 운영하는 CSD3(Cambridge Service for Data-Driven Discovery)에서 제공하는 리소스를 사용하여 수행되었습니다. 위원회(자본금 EP/P020259/1) 및 과학 기술 시설 위원회(www. Dirac. ac. 영국)의 DiRAC 자금 지원.
폭로
저자는 American Journal of Transplantation에 설명된 대로 공개할 이해 상충이 없습니다.
저자 기여
JRF, SH, MLN 및 MRC는 연구를 설계하고 데이터를 해석했습니다. JRF, SH, TM, CJW, AF 및 TCD가 실험을 수행했습니다. JRF, SH, MRC는 그림과 표를 만들었습니다. MRC가 주요 원고를 작성했습니다. JRF와 SH는 방법과 그림 범례를 만들고 JRF, SH, MLN은 원고를 편집했습니다.
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