포도나무 종자 추출물의 건강에 유익한 특성과 Rattus Norvegicus의 혈액, 간 및 신장에서 선택된 생화학적 표지자에 미치는 영향
Mar 10, 2022
추상적인:카드뮴(Cd)은 먹이 사슬을 포함하여 환경의 모든 영역에서 발생하는 중금속입니다. 체내에서는 세포에 해로운 자유 라디칼을 생성하여 산화 스트레스를 유발합니다. 포도씨 추출물(GSE)에는 자유 라디칼의 부작용을 중화시키는 데 도움이 되는 다양한 생물학적 활성 성분이 포함되어 있습니다. 이 연구에서는 페놀이 풍부한 반저항성 포도나무 품종인 Season에서 준비한 GSE가 카드뮴의 영향에 노출된 갈색 쥐의 생화학적 표지자에 미치는 영향을 모니터링했습니다. GSE는 혈장 항산화 활성을 증가시켰고,신장간, Cd 함량은 GSE 병용 투여에 의해 유의하게 낮아졌다. 따라서, 카드뮴에 의한 크레아티닌 함량 및 알라닌 아미노전이효소 활성의 증가 및 카탈라제 및 수퍼옥사이드 디스뮤타제 활성의 감소는 GSE 병용 투여에 의해 느려졌다. 이 작업의 결과는 포도씨 추출물이 중금속이 유기체로 흡수되는 것을 방지하는 효과를 제공한다는 것을 보여줍니다.
1. 소개
카드뮴(Cd)은 환경의 모든 영역에서 발생하는 중금속입니다. 그것은 지구의 지각의 일부이며 물에 포함되어 있으며 식물에 축적되고 유기체에 존재합니다. 먹이 사슬 외에도(식물의 경우 대부분의 곡물, 뿌리 작물 및 채소가 공급원인 반면 동물의 장기 중에는 주로 간과신장발생원), 인간에게 중요한 카드뮴 발생원은 담배 연기, 다양한 연소 유형, 야금 산업 및 일부 전기 설비에서 배출되는 것입니다[1,2]. 체내에서 카드뮴은 주로 혈액 내 메탈로티오네인, 알부민 및 기타 혈장 단백질에 결합합니다. 카드뮴은 세포에 유해한 자유 라디칼을 생성하여 산화 스트레스를 유발하는 위험한 독성 금속입니다. 자유 라디칼은 단백질, 지질, 효소 및 DNA를 손상시킬 수 있으므로 세포에 들어가기 전에 항산화제에 의해 중화되어야 합니다[3].
중화되지 않으면 Cd는 적혈구의 붕괴를 일으키고[4] 유기체, 특히 간 및신장- 그리고 필수 원소인 아연과 유사하여 효소 반응에 쉽게 들어가 생화학적 과정에 참여한다[5]. 그것은 유기체에서 매우 천천히 그리고 어렵게만 배출됩니다[6]. 항산화제가 산화 스트레스와 중금속 손상에 대한 보호 효과가 있다는 것은 잘 알려져 있으며, 이 실험은 이를 바탕으로 이루어졌다. 포도씨 추출물(GSE)은 자유 라디칼의 부작용을 중화하는 데 도움이 되는 매트릭스[7]에 광범위한 생물학적 활성 성분을 함유하고 있습니다. GSE는 세포 산화 손상을 조절하고, 장기 손상을 줄이며, 산화제와 항산화제 간의 균형을 개선하고, 염증 매개체의 방출을 감소시켜 손상으로부터 세포를 보호합니다. 또한 항염증, 항세포자멸사 및 증식 촉진 효과가 있습니다[8]. 심각한 질병에 대한 대체 치료법으로 연구 중인 농축 플라반올 또는 프로시아니딘의 함량이 특히 중요합니다[9,10]. 그러나 포도씨 페놀류의 함량과 구성, 그리고 종자 추출물의 항산화 활성은 포도나무 품종, 대목, 기후 조건 또는 재배 기술[11-13]에 의해 영향을 받을 수 있으며, 따라서 다음과 같은 항산화 특성에 영향을 받을 수 있습니다. 콘크리트 추출물의 보호 효과는 쉽게 예측할 수 없습니다. 이 연구의 목적은 반내성 포도나무 품종 Cerason에서 준비한 GSE가 혈액, 혈장, 간,신장카드뮴의 영향에 노출된 갈색 쥐.
키워드:포도씨 추출물; 항산화제; 카드뮴; 등나무 노르베기쿠스; 생화학적 마커; 보호 효과; 신장, 신장
CISTANCHE는 신장/신장 기능을 향상시킵니다.
2. 결과 및 논의
2.1. 포도씨 추출물의 항산화 활성 및 식물화학적 조성
반내성 품종 Cerason에서 제조된 포도씨 추출물은 항산화 활성, 총 폴리페놀 함량 및 선택된 개별 항산화제에 대해 테스트되었습니다. 항산화 활성은 서로 다른 원리(DPPH• , ABTS• plus , FRAP, FR)에 기반한 4가지 방법을 사용하여 분광광도계로 측정했으며 총 폴리페놀 화합물은 Folin-Ciocalteu 방법으로 측정했습니다. 사용된 방법에 따라 항산화 활성 범위는 7~31mg/g 갈산 당량(GAE)이었고 총 폴리페놀 함량은 9.3mg/g GAE였습니다(표 1). 실험의 이 부분의 결과는 포도씨의 높은 항산화 잠재력을 지적했습니다.
2.2. 쥐에서 포도씨 추출물 효과의 생체 내 측정
2.2.1. 혈액, 간 및 신장의 카드뮴 함량 측정카드뮴은 사료에서 가장 흔한 독성 금속입니다. 경구 투여 후 장에서 흡수되어 간으로 운반되고 메탈로티오네인(MT)의 티올 그룹에 접합됩니다. 이 외에도 Cd는 알부민 또는 혈액의 다른 단백질과 결합할 수도 있습니다[14]. 그 후 Cd는 체내에 축적되어 소변과 대변을 통해 체내에서 천천히 배설되며 생물학적 반감기는 약 20년입니다. 가장 많은 양(약 3분의 1)의 카드뮴이 발견됩니다.신장피질. 혈액에서 대부분의 카드뮴(약 90%)은 적혈구에 존재합니다. 광범위한 장기에 독성이 있으며 주요 표적은 다음과 같습니다.신장, 뼈 및 폐 [15-17]. GSE는 적혈구와 세포의 카드뮴 농도를 낮추는 것으로 보고되었습니다.신장,간에서 그 함량이 증가하는 것으로 보고되었습니다[14]. 이 연구에서 혈액 카드뮴 함량에 대한 결과는 그림 1A에 나와 있습니다. 실험 초기에 동물의 혈액에서 3.2 µg/kg의 카드뮴이 발견되었습니다. 실험 중 14일 후 GSE와 카드뮴을 첨가한 그룹의 평균 카드뮴 값은 다른 그룹에 비해 유의하게 높았다(10.8 µg/kg, p{7}}.023). 28일 후에는 데이터의 변동성이 너무 높아서 통계적 유의성을 관찰할 수 없었습니다.
실험 초기에 실험 동물의 간(그림 1B)에서 카드뮴이 검출되지 않았습니다. 따라서, 실험 동안 대조군 및 GSE 그룹의 동물의 간에서는 카드뮴이 검출되지 않았다. 한편, 실험 14일 후, 카드뮴을 첨가한 그룹의 평균 카드뮴 값은 5.8 mg/kg이었고, 카드뮴과 GSE를 첨가한 그룹의 평균값은 5.2 mg/kg이었다. 이 두 값은 모두 대조군과 유의하게 달랐습니다(카드뮴 단독군과 카드뮴 및 GSE 사용군의 경우 각각 p=0.002 및 p=0.018). 28일 후, 카드뮴을 첨가한 그룹의 평균값은 6.7 mg/kg으로 증가했으며, 이는 카드뮴 및 GSE를 첨가한 그룹의 카드뮴 수준과 유의하게 차이가 났으며, 이는 4.8 mg/kg으로 약간 감소했습니다. (p=0.008).
실험 초기에는 카드뮴이 검출되지 않았습니다.신장실험 동물의 (그림 1C). 따라서 카드뮴은 검출되지 않았다.신장실험 동안 대조군과 GSE 그룹의 동물. 한편, 14일 후 카드뮴을 첨가한 그룹의 평균 카드뮴 값은 9.5 mg/kg이었고, 카드뮴과 GSE를 첨가한 그룹의 평균값은 6.5 mg/kg이었다. 이 두 값은 모두 대조군과 크게 달랐습니다(두 그룹 모두 p < 0.001).="" 28일="" 후,="" 카드뮴을="" 첨가한="" 그룹의="" 평균값은="" 16.6mg/kg으로="" 증가했으며,="" 이는="" 카드뮴="" 및="" gse를="" 첨가한="" 그룹의="" 카드뮴="" 수준과="" 유의하게="" 차이가="" 났으며="" 이는="" 10.4mg/kg으로="" 약간만="" 증가했습니다.="" kg(p="0.009).">신장간에서 Cd 함량은 GSE 투여에 의해 유의하게 낮아졌습니다. GSE는 Cd를 킬레이트화하여 Cd 축적을 감소시킬 수 있는 페놀 화합물을 함유하고 있습니다. 이러한 킬레이트의 형성은 아마도 단백질이 Cd에 결합하는 능력을 감소시키는 결과를 가져왔고, 따라서 체내에서 보다 효과적으로 제거될 수 있었습니다[18].
2.2.2. 크레아티닌 및 요소 함량 측정
카드뮴 축적과 관련하여신장,신장Cd 유발 독성의 가장 중요한 표적 기관 중 하나입니다. 따라서신장마커 크레아티닌과 요소는 혈장에서 측정되었습니다. 크레아티닌의 측정은 사구체 여과의 좋은 지표이며 주로 사구체 여과 과정을 모니터링하는 데 사용됩니다.신장병. 크레아티닌 농도와 사구체 여과 사이의 관계는 쌍곡선입니다. 사구체 여과가 감소함에 따라 크레아티닌 분비도 감소합니다[19]. 중금속 카드뮴 섭취가 증가하면신장 손상, 따라서 크레아티닌 분비 효율이 감소합니다. 그 결과 혈중 크레아티닌 수치가 높아지면신장장애[20].
우리 연구에서 크레아티닌 수치는 이전에 발표된 결과에 따라 Cd에 의해 증가되었습니다[21]. 실험 시작 시 실험 동물의 평균 크레아티닌 함량 값(그림 2A)은 3.{3}} mg/L였습니다. 카드뮴을 투여한 그룹에서는 모니터링 값이 5.1mg/L(14일 후, p= 0.{12}}15) 및 6.2mg/L(28일 후, p < 0.001).="" gse와="" 카드뮴을="" 병용="" 투여한="" 그룹에서="" 이="" 마커의="" 증가는="" 대조군과="" 비교할="" 때="" 더="" 낮았고(14일="" 후="" 4.2mg/l="" 및="" 28일="" 후="" 5.5mg/l)="" 28일="" 후에만="" 통계적으로="" 유의했습니다.="" p="">< 0.001).="" 따라서,="" 크레아티닌="" 농도의="" 증가는="" gse="" 병용="" 투여에="" 의해="" 느려졌으며,="" 이는="" 카드뮴으로="" 인한="" 독성="" 효과의="" 감소를="" 시사합니다.="" gse만="" 받은="" 그룹에서는="" 정상="" 값이="">
요소는 아미노산과 단백질의 양적으로 가장 중요한 분해 산물입니다. 그것은 아미노산 대사 동안 탈아미노화 반응에 의해 방출된 암모니아로부터 간에서 형성됩니다. 주로 다음과 같은 방법으로 유기체에서 배설됩니다.신장사구체 여과 및 세뇨관 재흡수 [22]. 의 경우신장 질환, 요소 생성 속도가 제거 속도를 초과하여 혈액 요소 수준이 증가합니다. 또한, 카드뮴은 아미노산이 단백질로 결합하는 것을 억제하여 요독증을 유발합니다[21]. 반면에 간 기능이 저하되면 요소 합성이 감소하여 혈장 내 농도도 감소합니다[20]. 따라서 혈중 요소 농도는 식이 단백질 함량에 따라 달라지며,신장배설, 간의 대사 기능.
우리 연구에서 요소 수준은 이전에 발표된 결과에 따라 Cd에 의해 증가되었습니다[21]. 실험 시작 시 실험 동물의 평균 요소 함량 값(그림 2B)은 2{18}}7 mg/L였습니다. 카드뮴을 투여한 그룹에서 모니터링 값이 329mg/L(14일 후) 및 425mg/L(28일 후)로 유의하게 증가했습니다. GSE를 카드뮴과 함께 투여한 그룹에서 이 마커의 증가는 14일 후 325mg/L, 28일 후 381mg/L로 약간 낮았습니다. GSE와 함께 카드뮴과 카드뮴만 투여한 두 그룹은 실험 14일(각각 p{13}}.001 및 p=0.002) 및 28일 후(p<0.001) 대조군과="" 유의하게="" 달랐습니다.="" 모두).="" gse만="" 받은="" 그룹에서는="" 정상="" 값을="">
2.2.3. 혈장 항산화 활성 측정
카드뮴은 주로 산화 스트레스와 관련된 다양한 효과를 유발합니다. Cd는 산화환원 활성이 아니므로 반응성 산소종을 직접 생성하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, Cd 노출 후 생성은 많은 연구에서 보고되었으며 Cuypers et al. [23]. Cd 노출 동안 산화환원 장애를 유발하는 메커니즘에는 Cd와 티올기에 대한 친화력으로 인한 환원된 글루타티온의 고갈, 산화환원 활성 유리 Fe의 농도 증가, 미토콘드리아 기능 장애 및 NADPH 산화효소는 슈퍼옥사이드 라디칼의 형성을 촉매합니다[23]. 산화 스트레스 동안 페놀과 같은 항산화 화합물은 안정적인 라디칼 형태로의 전환을 통해 새로운 반응성 종의 생성을 중단할 수 있습니다. 따라서 페놀이 풍부한 식물 추출물은 Cd 또는 Cd 함유 화합물에 대한 보호 효과를 제공할 수 있습니다[24].
이 연구에서 실험 시작 시 실험 동물의 평균 혈장 항산화 활성 값(그림 3)은 0.71 mg/L였습니다. 대조군에 비해 모든 실험군에서 약간의 증가가 관찰되었다. 그러나 유의한 차이는 28일 후 GSE 처리군과 대조군 사이(p=0.012)로 혈장 항산화 활성에 대한 GSE의 긍정적인 영향을 확인시켜주었다. 이전에 보고된 결과가 모호합니다. 때로는 GSE로 인한 혈장 항산화 잠재력의 증가가 발견되고[25] 때로는 그렇지 않습니다[14].
2.2.4. ALT 및 AST 활동의 결정
산화 스트레스는 증가된 지질 과산화로 인한 막 구조의 기능적 완전성의 손실과 관련이 있습니다. 차례로, 세포질 막의 증가된 투과성은 간 표지 효소(ALT 및 AST)가 혈액으로 누출되게 합니다[14]. 실제로 ALT와 AST는 중독으로 인한 제한된 간 손상에서도 진단적으로 유의미하며 카드뮴에 의한 혈청 증가가 이미 보고된 바 있으며[14], 본 연구를 통해 이를 확인하였다. 실험 시작 시 실험 동물의 평균 ALT 활성 값(그림 4A)은 0.84 µkat/L였습니다. 카드뮴을 투여한 그룹에서는 모니터링 값이 14일 후 평균 1.52 µkat/L(p < 0.001),="" 28일="" 후="" 1.87="" µkat/l(p="" {{="" 13}}.004).="" gse와="" 카드뮴을="" 병용="" 투여한="" 그룹에서="" 이="" 마커의="" 증가는="" 카드뮴만="" 투여한="" 그룹보다="" 유의하게="" 더="" 느렸습니다(14일="" 후="" 1.23μkat/l,="" 28일="" 후="" 1.92μkat/l).="" 실험="" 14일="" 후="" 이="" 그룹은="" 대조군(p="0.009)" 및="" 카드뮴="" 그룹(p="0.026)" 모두와="" 차이가="" 있었지만="" 28일="" 후에는="" 유의한="" 차이가="" 있었습니다.="" 대조군에서만(p="0.003)." gse만="" 투여한="" 그룹에서도="" 14일="" 후에="" 값이="" 1.17="" µkat/l로="" 증가했습니다.="" 이="" 값은="" 대조군(p="0.024)과" 크게="" 다르며="" gse와="" 카드뮴을="" 모두="" 받은="" 그룹의="" 값과="" 비슷했습니다.="" 28일="" 후="" gse="" 전용="" 그룹의="" 값은="" 대조군과="">
실험 시작 시 실험 동물의 평균 AST 함량 값(그림 4B)은 2.07 µkat/L였습니다. 카드뮴을 투여한 그룹에서 관찰된 값의 통계적으로 유의한 증가는 실험 28일 후에만 기록되었습니다(3.52 µkat/L, p=0.001). 놀랍게도, GSE와 카드뮴을 병용 투여한 그룹에서 이 마커의 증가는 14일 및 28일 후 대조군보다 더 빠르고 유의하게 달랐습니다(각각 2.67 및 2.84 µkat/L, p {{15 }}.043), 값은 28일 후 카드뮴 단독 그룹보다 약간 낮았습니다. GSE 전용 변형은 정상 값을 가졌습니다.
우리 실험에서 GSE 투여는 ALT 활성의 증가를 늦출 수 있었습니다. 이 효과는 이전에 보고된 결과에 해당하며 [14] 페놀 화합물에서 자유 라디칼을 함유한 과산화지질로 수소 이동을 통해 과산화지질을 소거함으로써 발생할 수 있습니다. 반면 장기적으로 이 효과는 낮았다. 카드뮴에 의한 AST 활성의 증가는 GSE 투여에 의해 오히려 가속화되었다. 그러나 장기적으로 AST 활성이 약간 감소했습니다. 따라서 GSE는 세포막에 대한 Cd의 독성 효과를 부분적으로 보상할 수 있습니다.
2.2.5. 간에서 SOD 및 CAT 활동 측정
카드뮴은 산화 반응에 직접 참여하는 것 외에도 SOD 및 CAT와 같은 항산화 효소, 슈퍼옥사이드 라디칼 및 과산화수소를 각각 해독할 수 있는 효소의 활성을 억제합니다[14]. SOD는 슈퍼옥사이드 라디칼을 효과적으로 소멸시키고 독성이 덜한 과산화수소로 전환시키는 효소이며, 이는 카탈라아제 또는 퍼옥시다아제에 의해 더 분해될 수 있습니다[26]. CAT는 산소에 노출되는 거의 모든 생물체에서 발견되는 효소입니다. 과산화수소를 물과 산소로 분해하는 촉매 역할을 합니다. 효소 중 가장 높은 전환수를 가지고[28], 항산화 효소로서 인체의 균형을 유지하게 하는 보호기전의 하나이다[29]. 효소 활성의 Cd에 의한 감소의 메커니즘은 아마도 효소의 활성 부위에 대한 Cd의 직접적인 결합일 것입니다[30].
SOD 및 CAT 활동의 감소도 이 연구에서 관찰되었습니다. 실험 초기에 실험 동물의 간에서 평균 SOD 효소 활성(도 5A)은 18.4U/mg 단백질이었다. 실험 14일 후, SOD 활성은 GSE(21.1U/mg)를 받은 그룹이 두 카드뮴을 받은 그룹보다 유의하게 더 높았습니다(p < 0.001="" 및="" p="" {{="" 9}}.009="" 카드뮴="" 단독="" 투여군="" 및="" 카드뮴="" 포함="" gse군),="" 그러나="" 카드뮴="" 단독="" 투여군에서만="" 대조군보다="" sod="" 활성이="" 유의하게="" 낮았다(16.7="" u/mg)(p="0" .005).="" 실험="" 28일="" 후,="" 두="" 카드뮴="" 투여군은="" 대조군과="" 유의하게="" 차이가="" 있었습니다(16.4="" u/mg,="" p{20}}.002="" 및="" 17.6="" u/mg,="" 카드뮴의="" 경우="" p="0.023)." gse만="" 및="" 카드뮴은="" 각각)="" 및="" gse만="" 처리한="" 그룹(카드뮴만="" 및="" 카드뮴은="" gse에="" 대해="" 각각="" p="">< 0.001="" 및="" p="">
실험 초기에 간에서 평균 CAT 효소 활성(그림 5B)은 32.7U/mg 단백질이었습니다. 실험 14일 후, CAT 활성은 GSE(33.5U/mg)를 받은 그룹에서 두 카드뮴을 받은 그룹보다 유의하게 더 높았습니다(p=0.002 및 p=0.031 cadmium-only 및 cadmium with GSE group), 그러나 cadmium만을 투여받은 그룹에서만 대조군보다 CAT 활성이 유의하게 낮았습니다(23.8 U/mg)(p=0.005). 그러나 28일 후에 카드뮴과 함께 GSE를 투여받은 그룹의 CAT 활성은 27.1 U/mg로 더 감소하고 카드뮴 단독 그룹의 값(25.8 U/mg)에 도달했으며 대조군과 유의하게 달랐습니다(p { {21}}.033). GSE만 처리한 그룹은 두 카드뮴 그룹과 유의한 차이가 있었습니다(카드뮴 단독 및 GSE 포함 카드뮴의 경우 각각 p=0.026 및 p=0.012). 흥미롭게도, 카드뮴으로 인한 감소는 GSE 공동 투여에 의해 느려졌습니다. CAT의 경우 GSE의 이러한 효과는 이전에 관찰되었습니다[14]. GSE에 함유된 페놀 화합물의 킬레이트화 효과는 효소의 활성 부위에 결합하는 카드뮴의 능력을 감소시킬 가능성이 있습니다.
2.2.6. MT 콘텐츠의 결정
카드뮴은 직접적인 대사 전환의 대상이 아니지만 모든 조직에서 주로 메탈로티오네인(MT)에 결합됩니다. MT는 분자량이 6-10 kDa인 세포 내 저분자량 시스테인이 풍부한 단백질 그룹에 속합니다. 유기체에서 MT의 주요 역할에는 아연 항상성 유지, 중금속 해독, 산화 스트레스로부터 보호가 포함됩니다. MT 발현은 자외선, 중금속, 스트레스 호르몬, 자유 산소 라디칼, 염증 매개체, 감염, 외상 및 종양 발생과 같은 많은 외인성 및 내인성 요인에 의해 유도될 수 있습니다[31,32]. MT는 대부분 간에서 합성되고신장그리고 혈액으로 방출됩니다. MT가 배설을 낮추어 조직에서 카드뮴 축적을 담당하지만, MT는 급성 및 만성 Cd 유발 독성으로부터 보호합니다[33]. 우리 연구에서 MT 함량은 혈액, 간 및신장.
실험 시작 시 실험 동물의 혈액 내 평균 MT 함량 값(도 6A)은 23.9 nmol/g이었다. 14일 후에는 변화가 최소화되었고 28일 후에는 복제 간의 큰 변동성이 관찰되어 통계적 결론이 나지 않았습니다(p=0.948). 에 대한 평균 MT 콘텐츠 값신장실험초기 실험동물의 (그림 6B)는 21.46 nmol/g이었다. 값은 실험 동안 어떤 실험군에서도 크게 변하지 않았습니다(p=0.938). 실험 시작 시 실험 동물의 간에서 평균 MT 함량 값(도 6C)은 17.15 nmol/g이었다. 14일 후 MT 함량은 모든 실험군에서 약간 증가했으며 대조군과의 차이는 Cd 단독군과 GSE 단독군에서 유의했습니다(p=0.008 및 p=0 .046). 28일 후, GSE 그룹의 MT 함량은 대조군의 값으로 돌아온 반면, Cd 그룹의 MT 함량은 계속 증가하여 대조군 및 GSE 그룹과 차이가 있었습니다(p=0.046 및 p=0.035). 카드뮴과 함께 GSE를 받은 그룹에서 MT 함량은 Cd 단독 그룹과 비교할 때 대조군과 크게 다르지 않았습니다(이 그룹의 간에서 발견되는 더 낮은 카드뮴 함량과 일치함). 실험 28일).
전체적으로 Cd로 인한 MT 함량의 통계적으로 유의한 변화는 간에서만 관찰되었습니다. 이전에 카드뮴을 투여한 실험 동물의 혈액에서 MT 증가가 보고되었습니다[34]. 이 경우 결과는 MT를 통한 Cd의 해독이 오히려 간에서 일어날 수 있음을 시사합니다.
3. 재료 및 방법
3.1. 실험 설계Wistar 속의 갈색 쥐(생후 8주, 235 ± 3g)를 6명의 개체로 구성된 4개의 그룹으로 나누었습니다. A) 일반 식단을 따르는 쥐의 대조군(n=6) B) 식단에 GSE가 추가된 쥐 그룹(200 mg GSE/day)(n=6) C) 카드뮴(2 mg Cd/day, 구체적으로 물에 용해된 CdCl2)을 투여한 그룹(n=6); 및 D) GSE(200mg GSE/일)가 첨가된 카드뮴(2mg Cd/일)을 함유하는 식이를 제공한 그룹(n=6). 추출물은 Cerason 포도나무 품종의 씨앗에서 채취했습니다. 준비 및 특성화는 섹션 3.2에 설명되어 있습니다. (그레이프바인 씨 추출물). 추출물은 실험용 갈색 쥐에게 투여하기 전에 200mg의 용량으로 매일 무게를 측정했습니다(각 쥐에게 200mg GSE; 0.85g/L 체질량 kg). GSE는 물과 함께 투여되었습니다. 쥐에게 습한 사료 혼합물과 무해한(유아) 물을 임의로 제공했습니다. 일주일에 한 번, 동물들은 침구를 바꿨습니다. 실험 14일 및 28일 후, 각 그룹의 3마리 동물을 안락사시키고 심장 천자를 통해 혈액을 수집하였다. 채취 전 복강 내 약물에 Fraxiparin(0.01mL/kg)을 할당한 후 흡입 마취 하에 diethyl ether를 투여하였다. 그런 다음 혈액 샘플을 헤파린으로 코팅된 마이크로 테스트 튜브(또는 EDTA가 있는 튜브 - MT 및 카드뮴 분석용, 후속 원심 분리 없이)에 수집한 다음 부드러운 원심 분리(800g/10분) 및 혈액 수집을 수행했습니다. 추가 분석을 위한 플라즈마. 간과 오른쪽신장추가 분석을 위해 추출되었습니다. 연구는 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)에 따라 수행되었으며 프로토콜은 브르노에 있는 멘델 대학의 실험 동물의 복지를 보장하기 위한 전문가 위원회(프로젝트 IGA-ZF/2016-AP011용)의 승인을 받았습니다.
3.2. 그레이프바인 씨 추출물
포도나무 종자(Cerason 품종—Merlot × Seibel 13 666)를 분류, 세척, 건조 및 분쇄했습니다. 분류는 씨앗이 껍질에서 분리되는 분리 기계의 표시를 통해 이루어졌습니다. 이러한 방식으로 분리된 종자는 이어서 헹구고, 빈 종자를 제거하고, 나머지 종자를 세척하였다. 세척하고 세척한 종자를 건조기에서 50℃에서 12시간 동안 건조시켰다. 그 다음 IKA MF 10 Basic 실험실 분쇄기(IKA Werke, Staufen im Breisgau, Germany)를 사용하여 종자를 분쇄했습니다. 분쇄된 종자는 120시간 동안 75% 에탄올에서 추출되었습니다(22℃, 50RPM에서 진탕, IKA KS 260 Basic, 제조사: IKA Werke, Staufen im Breisgau, Germany). 에탄올(m/m). 그 후, 추출물을 25mL 시험관(Eppendorf, Hamburg, Germany)에 넣고 4℃ 및 RCF 25,{13}}×g에서 원심분리(Hettich MIKRO 220 Centrifuge; Hettich, Westphalia, Germany)했습니다. 원심분리된 샘플을 시험관에서 취하여 에탄올이 증발되는 진공 증발기 증류 플라스크(IKA RV 10 digital VC; IKA Werke, Staufen im Breisgau, Germany)로 옮겼습니다. 증발은 90℃의 진공에서 이루어졌고 추출물은 페트리 접시로 옮겨져 53℃의 진공에서 동결건조되었다(Heto PowerDry PL 3000 lyophilizer; Trigon-plus, Cestlice, Czech Republic). 준비된 추출물을 실험동물에게 투여하였다.
CISTANCHE는 신장/신장 감염을 개선할 것입니다
3.3. 항산화 활성 및 총 폴리페놀 함량 측정
결과의 객관성을 보장하기 위해 근본적으로 다른 네 가지 방법을 사용하여 항산화 활성을 측정했습니다. 샘플은 BS{0}} 자동 분광 광도계(Mindray, Shenzen, China)에서 분석되었습니다. 모든 샘플을 3회 반복하여 분석했으며, 결과 값은 이러한 측정의 평균에 해당합니다. 이러한 분석은 Sochor et al.에 따라 수행되었습니다. [35].
3.3.1. ABTS 방법을 사용한 항산화 활성 측정
ABTS 분석에 의한 항산화 활성 측정을 위한 용액은 두 가지 용액을 혼합하여 제조했습니다. 및 용액 2: 증류수 5mL당 m{8}}.67mg을 칭량하여 제조한 4.95mM 과황산칼륨 용액. 생성된 용액을 증류수로 1:10 희석하고 12시간 동안 어둡고 차가운 곳에 두었다. 그런 다음 시약 R1(7mM ABTS 및 4.95mM 과황산칼륨) 150μL를 플라스틱 큐벳에 피펫팅한 후 샘플 3μL를 첨가하고 분광광도계(λ{20}} nm)에서 12시간 동안 측정했습니다. 분 검량선에 따라 흡광도는 갈산의 등가 함량으로 변환되었습니다. 갈산을 표준물질(10–200 mg·L1)로 사용하여 검량선에서 항산화 활성을 계산하고 그 결과를 갈산 당량으로 표시하였다.
3.3.2. DPPH 방법을 사용한 항산화 활성 측정
먼저, m{0}}.35 mg의 라디칼 DPPH를 칭량하였다. 이 양을 250mL 부피 플라스크로 옮기고 메탄올로 보충했습니다. 그런 다음, 시약 R1(0.095mM DPPH) 150μL를 플라스틱 큐벳에 피펫팅한 후 측정할 샘플 15μL를 추가했습니다. DPPH 테스트는 안정적인 자유 라디칼 2,{9}}디페닐{10}}피크릴히드라질이 수소 공여체와 반응하는 능력을 기반으로 합니다. DPPH는 자외선-가시광선 분광법(UV-VIS) 스펙트럼에서 강한 흡수를 나타냅니다. 흡광도는 λ=505 nm에서 12분 동안 측정되었습니다. 검량선에 따라 흡광도는 등가 갈산 함량으로 변환되었습니다.
3.3.3. 제2철 환원 항산화력법을 이용한 항산화 활성 측정
제2철 환원 항산화력(FRAP) 방법을 사용하여 항산화 활성을 측정하기 위해 세 가지 용액을 사용했습니다. (1) TPTZ 용액: 10mM TPTZ(m{2}}.02 mg) 40mM HCl; (2) FeCl3용액: 25mL의 증류수에 용해된 20mM FeCl3(m{10}}.13mg); 및 (3) 아세테이트 완충액: 0.02M 아세테이트 완충액 pH 3.6(250mL의 증류수에 용해된 m{18}} mg 아세트산나트륨, 아세트산으로 pH 조정됨). 세 가지 용액을 1:1:10(TPTZ: FeCl3: 아세테이트 완충액)의 비율로 혼합했습니다. 그런 다음 150μL의 시약을 플라스틱 큐벳에 넣고 3μL의 샘플을 추가했습니다. 흡광도는 λ=605 nm에서 12분 동안 측정되었습니다. 갈산을 표준물질(10–200 mg·L1)로 사용하여 보정 곡선에서 항산화 활성을 계산했습니다. 결과는 갈산 당량으로 표시되었습니다.
3.3.4. 클로로필린 자유 라디칼 방법을 사용한 항산화 활성 측정
총 2{2}}0µL의 시약 R1(0.1M HCl, 엽록소 추출물, 반응 완충액, 촉매)을 플라스틱 큐벳에 피펫으로 넣은 다음 샘플 8µL를 추가했습니다. 이 방법은 클로로필린(엽록소의 나트륨-구리염)의 능력을 이용하여 흡수 최대값을 안정적으로 변경하면서 전자를 받아들이고 기증합니다. 이 공정은 알칼리성 환경과 촉매의 첨가에 의해 조절됩니다. 흡광도는 λ=450 nm에서 12분 동안 측정되었습니다. 마지막 측정 값이 계산에 사용되었습니다. 결과는 갈산 당량으로 표시되었습니다.
3.3.5. 총 폴리페놀 농도 측정
Folin-Ciocalteu 방법은 총 폴리페놀 화합물을 결정하는 데 사용되었습니다. 모든 샘플을 3중으로 분석하고 결과 값을 이러한 측정의 평균으로 얻었습니다. 40 μL 샘플을 피펫으로 큐벳(3 mL)에 넣고 1960 μL의 증류수로 희석했습니다. 그 후, 50 μL의 Folin-Ciocalteu 시약을 큐벳에 추가했습니다. 혼합물을 완전히 흔든 후 3분 후 20% Na2CO3 10수화물 용액 300μL를 첨가했습니다. 반응 혼합물을 흔들고 22℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 흡광도(SPECORD 210; Carl-Zeiss, Jena, Germany)는 블랭크에 대해 λ=750 nm에서 측정되었습니다. 결과는 갈산 당량으로 표시되었습니다.
3.4. HPLC에 의한 항산화제의 측정
질량 분석기로 고성능 액체 크로마토그래피를 사용한 개별 항산화 성분 측정 플라보노이드 및 프로안토시아닌 추정에 사용된 샘플 분석은 Agilent Technologies 12{{1{13}}}}0(Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, USA) 크로마토그래피 시스템에서 수행되었습니다. 다음 기기: 이동상 저장소, 탈기 장치, 바이너리 펌프, 자동 시료 주입기가 있는 시료 저장소, Agilent 646{21}} Triple Quadrupole LC/MS가 있는 질량 검출기(Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, USA). 시료 분리는 치수가 50 × 2.1 mm이고 입자 크기가 2.7 µm인 Zorbax SB C18 크로마토그래피 컬럼에서 수행되었습니다. 분석 시간은 항상 6분이었다. 캐리어 가스의 동료 속도는 0.6mL·min1이었다. 이동상의 유기 성분은 메탄올 구배 등급(용매 B)이었고 수성 성분은 0.05M의 포름산암모늄(용매 A)을 함유했습니다. 이동상의 구배는 다음과 같았다: 시간 0분: 용매 A 50% 및 용매 B 50%; 시간 2.5분: 용매 A 100% 및 용매 B 0%; 시간 5분: 용매 A의 50% 및 용매 B의 50%. 컬럼 온도 조절 장치의 온도를 45℃로 조정했습니다.
CISTANCHE는 신장/신장 통증을 개선합니다
3.5. 선택된 생화학적 마커의 결정
혈액, 혈장, 간 및신장카드뮴의 부정적인 영향에 대한 GSE의 보호 효과를 결정하기 위해 동물의 1마리를 모니터링했습니다. (1) 혈장 분석: 총 혈장 항산화 활성, 크레아티닌, 요소, ALT, AST. (2) 혈액 분석: MT. (3) 간 분석: SOD, CAT, MT. (4)신장분석: MT.
3.5.1. 총 혈장 항산화 활성 측정,크레아티닌, 요소, ALT 및 AST A BS{{0}} 자동 생화학 분석기(Mindray, Shenzen, China)를 사용하여 혈장, 크레아티닌, 요소, ALT 및 AST의 총 항산화 활성을 분석했습니다. 혈장의 총 항산화 활성 측정 혈장의 항산화 활성을 결정하기 위해 자유 라디칼 방법이 사용되었습니다[35]. 이 방법은 클로로필린(엽록소의 나트륨-구리염)이 전자를 받아들이고 기증하면서 흡수 최대값을 안정적으로 변경하는 능력을 사용합니다. 이 공정은 알칼리성 환경과 촉매의 첨가에 의해 조절됩니다. 시약 R1(0.1M HCl, 클로로필린 추출물, 반응 완충액 및 촉매) 총 200μL를 플라스틱 큐벳에 피펫팅한 후 샘플 8μL를 추가했습니다. 흡광도는 λ=450 nm에서 12분간 측정하였으며, 마지막 측정값을 계산에 사용하였다. 갈산을 표준물질로 하여 검량선으로부터 항산화 활성을 계산하고 그 결과를 갈산 당량으로 나타내었다.
크레아티닌 함량 측정이 방법의 원리는 크레아티닌과 알칼리성 피크레이트의 색상 복합체의 광도 측정이며, 형성 속도는 샘플의 크레아티닌 농도에 비례합니다. Greiner의 진단 키트(Greiner GmbH, Pleidelsheim, Germany)를 사용하여 크레아티닌을 측정했습니다. 총 180 µL의 시약 R1(0.16mM 수산화나트륨)을 피펫으로 큐벳에 넣은 다음 10µL의 샘플과 30µL의 시약 R2(4mM 피크르산)를 추가했습니다. 흡광도는 λ=505 nm에서 6분 동안 측정되었습니다. 시료와 함께 시약 R1 단독의 흡광도 값 및 시약 R2와 6분 배양 후 흡광도 값을 계산에 사용했습니다.
알라닌 아미노전이효소의 측정Greiner의 진단 키트(Greiner GmbH, Pleidelsheim, Germany)를 사용하여 ALT를 결정했습니다. 먼저, 시약 R1(100mM Tris 완충액 pH 7.5, 500mM L-알라닌, 1200U/L 젖산 탈수소효소) 15{13}}μL와 혈장 샘플 15μL를 자동으로 큐벳에 피펫팅했습니다. 이어서, 시약 R2(15mM 2-옥소글루타레이트, 0.18mM NADH) 30μL를 자동으로 피펫팅하고 혼합물을 5분 동안 배양했습니다. 흡광도는 λ=340 nm에서 측정되었습니다. 시료와 함께 시약 R1 단독의 흡광도 값과 시료와 함께 5분 배양 후 흡광도 값을 계산에 사용했습니다. 결과는 검량선에 따라 효소 활성(μkat/L)으로 변환되었습니다.
아스파르테이트 아미노전이효소의 측정Greiner의 진단 키트(Greiner GmbH, Pleidelsheim, Germany)를 사용하여 AST를 결정했습니다. 먼저, 시약 R1(80mM Tris 버퍼 pH 7.8, 240mM L-aspartate, 1200U/L malate dehydrogenase) 15{15}}µL와 실험 동물의 혈장 샘플 15µL가 자동으로 큐벳에 피펫으로 주입되었습니다. 그 후, 37℃에서 270초 동안 혼합 및 배양을 수행하였다. 다음으로, 30μL의 R2 시약(15mM 2-oxoglutarate, 0.18mM NADH)을 자동으로 피펫팅하고 혼합물을 5분 동안 배양했습니다. 흡광도는 λ=340 nm에서 측정되었습니다. 시료와 함께 시약 R1 단독의 흡광도 값과 시료와 함께 5분 배양 후 흡광도 값을 계산에 사용했습니다. 결과는 검량선에 따라 효소 활성(μkat/L)으로 변환되었습니다.
요소의 결정요소를 결정하기 위해 다음 절차가 사용되었습니다. 200μL의 시약 R1(Tris 완충액 pH 7.8, ADP, 요소분해효소 및 GLDH) 및 200μL의 시약 R2(2-oxoglutarate, NADH)를 자동으로 큐벳에 피펫팅했습니다. 이어서 4 μL의 샘플을 첨가한 후 혼합물을 혼합하고 37℃에서 30초 동안 인큐베이션하였다. 이어서, λ=340 nm에서의 흡광도를 측정하고 60초 후에 다시 흡광도를 측정하였다. 30초 후와 60초 후의 흡광도 값을 계산에 사용했습니다. 값을 서로 뺀 결과는 검량선에 따라 요소 함량으로 변환되었습니다.
뷰렛 방법을 사용한 총 단백질 측정뷰렛 방법에 의한 총 단백질의 측정은 다른 간행물[9]에 자세히 설명되어 있습니다. 총 180μL의 뷰렛 시약(15mM 소듐 포타슘 타르트레이트, 100mM NaI, 5mM KI 및 5mM CuSO4)을 큐벳에 피펫팅한 후 샘플 45μL를 피펫팅했습니다. 37℃에서 10분간 배양한 후 파장 λ{9}} nm에서 흡광도를 측정하였다. 여기서 원리는 알칼리 환경에서 펩타이드 결합과 Cu(II)의 반응으로 청자색을 형성하는 것입니다. 시약 단독의 흡광도 값과 샘플과 함께 10분간 배양한 후의 흡광도 값을 계산에 사용했습니다.
3.5.2. SOD(Superoxide Dismutase) 및 CAT(Catalase) 측정 SOD 활성 측정, 상용 키트(19160 SOD, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)를 사용하여 SOD 활성(SOD, EC 1.15.1.1)을 측정했습니다. 측정은 BS 400 자동 분석기(Mindray, Shenzen, China)의 플라스틱 큐벳에서 수행되었습니다. 먼저, 200 μL의 시약 R1(20x 완충액 희석 WST 용액)을 큐벳에 피펫으로 옮기고 시약을 37℃에서 108초(1분, 48초) 동안 배양했습니다. 그런 다음, 샘플 20μL를 피펫팅하고 378초(6분, 18초)에 시약 R2(167x 완충액 희석 효소 용액) 20μL를 첨가하여 반응을 시작했습니다. 혼합물을 72초(1분, 12초) 동안 배양한 다음 λ=450 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 반응 속도를 180초(3분) 동안 측정하고 흡광도를 9초마다 읽습니다. 기기는 보정 방정식에 따라 측정된 샘플의 분당 흡광도(∆A)의 평균 증가와 SOD 활성을 계산했습니다. 결과는 U/mL로 표시되었고 이후에 단백질 mg으로 변환되었습니다.
3.5.3. 메탈로티오네인 함량 측정혈액, 간 및 간에서 메탈로티오네인 농도 측정신장차동 펄스 전압 전류법(DPV)과 함께 AdTS(adsorptive transfer stripping technique)를 사용하여 갈색 쥐의 실험을 수행했습니다. 분석을 위해 분석된 상층액 200 µL를 취하여 측정용기에서 1 800 µL의 Brdiˇcka 시약과 혼합한 후 전기화학적 측정 자체를 수행하였다. 분석은 이전에 설명된 프로토콜에 따라 수행되었습니다[37]. 고전적인 3 전극 연결이 사용되었습니다. 작업 전극은 0.4 mm2의 드롭 면적을 갖는 매달린 수은 드롭 전극(HMDE)이었고, 기준 전극은 Ag/AgCl/3 M KCl이고 보조 전극은 백금 전극이었습니다. 기본 전해질(1mmol·L1[CO(NH3)6]Cl3 및 1mol·L1의 암모늄 완충액; NH3(aq) + NH4Cl, pH 9.6)은 각 측정 샘플에 대해 변경되었습니다. DPV 매개변수는 다음과 같습니다. 초기 전위 0.7 V, 최종 전위 1.75 V, 버블링 5초, 증착 시간 240초, 변조 시간 0.0 5초, 간격 시간 0.25초, 전위 단계 0.00105V, 스캔 속도 0.0042V/s, 변조 진폭 0.02505V. MT 측정은 VA Stand 693 측정 장치에 연결된 695 Autosampler로 구성된 측정 장치에서 수행되었으며 제어된 693 VA TraceAnalyser 제어 장치(모든 Metrohm, Herisau, Switzerland)에 의해. 전체 측정 시스템은 Julabo F25(Julabo, Seelbach, Germany)를 사용하여 4°C로 냉각되었습니다. 얻은 전압전류도를 VA Database 2.2 프로그램(Metrohm, Herisau, Switzerland)으로 내보내고 분석된 샘플을 순도 99.999%의 활성 아르곤 버블링에 의해 탈산소화했습니다.
3.5.4. 샘플의 혈액, 간 및 신장 분해에서 카드뮴 함량 측정 Ethos One 마이크로파 추출기(Milestone, Sorisole, Italy)는 간 분해 및신장혈액 샘플 분해에는 Multiwave 3{6}}00 Microwave Extractor(Anton Paar Graz, Austria)가 사용되었습니다. 광물화는 65% 질산(초순수 HNO3)(Merck KGaA, Darmstadt, Germany) 및 30% 과산화수소(H2O2 초순수)(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)를 사용하여 습식 방식으로 진행되었습니다. 총 0.4g 간 또는신장샘플을 일련의 테플론 용기에 넣고 65% HNO3 5mL, 3{13}}% H2O2 3mL, Milli Q H2O 2mL를 샘플에 추가했습니다. 용기를 닫고 제조업체의 지침에 따라 기기를 시작했습니다. 마이크로파 분해는 210℃에서 40분 동안 지속되었다. 이어서, 샘플을 45분 동안 냉각시키고 PE 용기에 4℃에서 보관하였다. 총 0.01g의 혈액 샘플을 일련의 유리 용기에 칭량하고 300μL의 65% HNO3와 200μL의 30% H2O2를 샘플에 추가했습니다. 용기를 닫고 제조업체의 지침에 따라 기기를 시작했습니다. 마이크로파 분해는 140℃의 온도에서 40분 동안 지속되었다. 그 후, 샘플을 45분 동안 냉각하고 AAS에 의해 결정될 때까지 4℃에서 보관하였다.
원자 흡수 분광법에 의한 카드뮴 측정카드뮴은 Agilent 280/240 Series AA Systems 장치(Agilent Technologies)에서 측정되었습니다. 간과신장샘플은 아세틸렌-공기 화염(Fa AAS)에서 분석되었고 혈액 샘플은 228.8 nm의 파장에서 전열 원자화(ETA AAS)에 의해 분석되었습니다. ETA AAS 분석의 경우 0–20 µg·L 농도의 교정 시리즈가 카드뮴 표준 용액(Analytika Praha, Prag, 체코), 농도 1.{8}} ± 0.002 g·L1. 그 다음에는 교정 시리즈 용액의 측정과 교정 곡선의 구성이 뒤따랐으며, 그 후에 혈액, 간, 및신장샘플을 측정했습니다.
3.6. 통계 분석모든 측정은 삼중으로 수행되었습니다. 이상값은 Grubbs 테스트로 식별되고 제외되었습니다(총 2개의 이상값이 발견됨). 통계 분석 전에 데이터를 로그 변환으로 변환하고 Tukey HSD 사후 테스트를 사용하여 일원 분산 분석(각 시점 개별적으로)으로 분석했습니다. 통계적 유의성에 대한 임계값은 p < 0.05로="">
4. 결론
최근에는 다양한 질병으로부터 몸을 보호할 수 있는 물질인 식물 2차 대사산물 중에서 신약을 찾는 약학 및 경제 동향이 있습니다. 포도나무 씨앗이 매트릭스에 포함되어 있는 중요한 생물학적 활성 성분 덕분에 의료 목적으로 사용될 수 있습니다(이미 사용 중입니다). 포도씨 추출물은 독성 중금속 카드뮴으로 인한 산화 스트레스 관련 손상으로부터 조직을 보호하는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 보호는 아마도 사용된 포도씨의 페놀 성분에 의해 영향을 받을 것입니다. 이 연구에서는 페놀 함량이 다소 높은 반내성 품종 Cerason에서 제조된 포도씨 추출물이 카드뮴 유발 변형에 대한 보호 효과를 테스트했습니다. 연구된 GSE는 단독으로 투여했을 때 혈장 항산화 활성을 증가시킬 수 있었고 간에서 카드뮴 함량을 낮추고신장공동 투여 시 쥐의 수. 따라서 간 표지효소인 ALT의 증가와신장카드뮴으로 인한 마커 크레아티닌은 GSE에 의해 느려졌습니다. 또한, 카드뮴으로 인한 항산화 효소 SOD 및 CAT의 활성 감소는 GSE 병용 투여에 의해 느려졌습니다. 이러한 결과는 GSE가 중금속의 영향에 대한 강력한 보호제임을 보여줍니다.
