덴드리머-테사글리타자르 접합체는 소교세포의 표현형 변화를 유도하고 아밀로이드 식세포작용을 향상시킵니다† 파트 3
Jul 15, 2024
D-Tesa는 병원성 단백질 제거를 담당하는 효소의 발현을 증가시켰습니다.
인슐린 분해 효소(Ide)와 매트릭스 메탈로프로테아제 9(MMP9)는 세포외 아밀로이드와 시누클레인을 분해하는 소교세포에서 분비되는 효소입니다.71,72 D-Tesa 치료는 Ide 3의 발현을 상당히 증가시켰습니다.1-배(p < 0.001) LPS만 처리한 대조군과 비교하여 MMP9 발현이 증가하는 경향이 있습니다(1.8-foldincrease, p= 0.057)(그림 6A 및 B).
최근 몇 년 동안 인슐린 분해 효소와 기억 사이에 밀접한 연관성이 있다는 연구 결과가 점점 더 많아지고 있습니다. 이번 발견은 우리에게 기억의 형성과 유지 메커니즘을 더 깊이 탐구할 수 있는 귀중한 단서를 제공합니다.
인슐린 분해 효소는 중요한 효소로, 주요 기능은 인슐린을 분해하여 혈당 균형을 유지하는 것입니다. 그러나 최근 연구에 따르면 인슐린 분해효소는 대사 역할을 할 뿐만 아니라 뇌 신경세포의 성장과 복구에 직접적인 영향을 미치며 기억력을 유지하는 데 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌습니다.
많은 연구에서 인슐린 분해 효소의 수치가 높을수록 기억력이 좋아지는 것으로 나타났습니다. 인슐린 분해효소가 신경세포의 성장과 회복을 촉진해 뇌의 학습능력과 기억력을 향상시킬 수 있기 때문이다. 또한, 인슐린 분해 효소는 뉴런 사이의 연결을 촉진하여 기억의 연관성과 유지를 향상시킬 수 있습니다.
기억에서 인슐린 분해 효소의 중요한 역할은 임상 의학 분야에서 널리 사용되어 왔습니다. 연구진은 인슐린 분해 효소를 흡입하면 기억력이 향상될 수 있을 뿐만 아니라 인지 능력과 우울증 증상도 개선될 수 있다는 사실을 발견했습니다.
간단히 말해서, 인슐린 분해 효소와 기억의 연관성은 매우 중요한 분야로, 기억의 생물학적 메커니즘을 연구하는 데 귀중한 단서를 제공합니다. 향후 연구에서는 인슐린 분해 효소의 기능과 역할을 더 자세히 탐구하고, 기억의 형성과 저장 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움을 주며, 인간 두뇌의 학습 및 기억 능력을 향상시키기 위한 더 나은 기반을 제공할 것입니다. 기억력 향상이 필요하다는 것을 알 수 있는데, 시스탄체는 기억력과 학습에 매우 중요한 아세틸콜린과 성장인자의 수치를 높이는 등 신경전달물질의 균형도 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 또한 Cistanche는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌가 충분한 영양과 에너지를 얻을 수 있도록 하여 뇌 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.
무료 Tesa는 Ide 2-배(p= 0.011)의 표현을 크게 증가시켰고, MMP92-배(p= 0.35)를 크게 증가시키지 않았습니다(그림 6A). 그리고 B). 신경퇴행성 질환의 M2 미세아교세포는 효소분해 또는 식세포작용을 통해 α-아밀로이드, α-시누클레인 및 기타 병원성 단백질을 제거할 수 있으며, D-Tesa는 이러한 과정에 관여하는 단백질(예: Ide 및 MMP9)을 상향 조절합니다.71-73
Ideexpression은 AD 및 PD 병리학에서 하향 조절되며 PPAR 작용제에 의해 상향 조절되는 것으로 알려져 있으며 이는 우리의 결과와 일치합니다.
71,72 기능적으로 Ide 수준의 2-배 증가만이 생체 내 아밀로이드 축적 및 신경 세포 사멸을 감소시키는 것으로 나타났습니다.74,75 따라서 D-Tesa에 의해 관찰된 Ide의 3-배 증가와 2-freeTesa의 Ide 증가는 생체 내에서 치료 효과가 있을 수 있습니다.
D-Tesa는 α-아밀로이드의 식균작용을 증가시킵니다.
CD36은 식세포작용과 α-아밀로이드 분해를 촉진하는 소교세포 청소 수용체입니다.73 AD에서의 CD36의 하향조절은 α-아밀로이드 제거를 감소시키지만 PPAR 활성화에 의해 상향조절됩니다.
D-Tesa와 무료 Tesa 모두 LPS만 노출된 세포와 비교했을 때 CD36 발현 수준이 크게 증가했습니다(p < 0.0001 대 D-Tesa 및 무료 Tesa의 경우 p < 0.005) , 각각), 그러나 D-Tesa는 무료 Tesa보다 훨씬 효과적이었습니다(각각 D-Tesa 및 무료 Tesa의 경우 6-배 증가 대 2.8-배 증가, p < 0.0005)(그림 6C) ).
우리의 결과는 pioglitazone(또 다른 PPAR 작용제)에 대한 이전 연구와 일치하며, 이는 α-아밀로이드의 소교세포 식균 작용 증가가 PPAR 및 CD{1}} 의존 메커니즘을 통해 발생한다는 것을 보여줍니다.73
D-Tesa 치료로 인한 CD36의 상향 조절이 이들 세포의 식세포 능력 증가와 상관관계가 있는지 조사하기 위해 우리는 α-아밀로이드의 기능적 식세포작용 분석을 수행했습니다. 73
간단히 말하면, 이전 in vitro 분석에서와 같이 세포를 처리한 후, 형광 표지된 α-아밀로이드1-42를 세포에 2시간 동안 적용하고, 세포를 세척한 다음, 유세포 분석을 수행하여 α-아밀로이드의 세포 흡수 정도를 조사했습니다. D-Tesa는 α-아밀로이드를 식균한 세포의 비율과 세포당 내재화된 α-아밀로이드의 평균 양을 모두 증가시켰습니다(그림 7A 및 B).
대조적으로, 유리 테사(Tesa)는 α-아밀로이드의 식세포작용이 개선되지 않았습니다. Tesa에 비해 D-Tesa의 우수한 효과는 덴드리머 접합에 의해 활성화된 향상된 세포 내재화에 기인한 것 같습니다.
이는 형광 표지된 G4-PAMAM-OH로 처리된 BV2 세포의 95% 이상이 30분 이내에 덴드리머를 내부화했으며 최소 24시간 동안 계속해서 덴드리머를 내부화했음을 입증한 이전 연구와 일치합니다.76
마찬가지로, 소분자 미노사이클린을 형광 표지된 G4-PAMAM-OH에 접합하면 BV2 세포의 99%가 3시간 이내에 형광 표지된 덴드리머-약물 접합체를 내부화했음을 보여주었습니다.26 또한 접합체가 질산화물 수준을 우수한 수준으로 감소시키는 것으로 나타났습니다. BV2 세포를 LPS로 처리한 후 자유 약물로 전환한 결과는 우리의 결과와 일치합니다.
D-Tesaphagocytosed 1.9-배 더 많은 -아밀로이드를 처리한 세포는 LPS를 처리한 대조 세포보다 (p < 0.001) 2.5-배 증가한 것과 비슷합니다. - Yamanaka et al.73에 의해 보고된 피오글리타존으로 처리된 쥐의 일차 미세아교세포에 의한 아밀로이드 식균작용 이전 연구에서 아밀로이드 식균작용의 정도가 약간 더 높았던 것은 그들이 우리처럼 LPS로 세포를 공동 치료하지 않았기 때문일 수도 있고 일차 미세아교세포가 PPAR을 발현하기 때문일 수도 있습니다. 이 연구에 사용된 BV2 세포보다 더 높은 수준입니다.77
따라서 BV2 세포는 일차 미세아교세포보다 낮은 수준에서 PPAR을 발현하는 것으로 알려져 있기 때문에 우리 연구의 체외 실험에서 추정된 것보다 낮은 D-Tesa 용량은 생체 내 연구와 인간에게 효과적일 수 있습니다.77
소교세포는 많은 신경퇴행성 질환에 연루되어 있으며, BBB는 소교세포의 표현형을 염증성, 신경독성 M1 표현형에서 항염증성, 신경보호성 M2 표현형으로 변형할 수 있는 많은 약물이 뇌에서 치료 수준에 도달하는 것을 막았습니다.5,6, 14,15
예를 들어, 두 가지 PPAR 작용제인 피오글리타존과 로시글리타존은 소교세포의 표현형을 변경하는 능력으로 인해 각각 알츠하이머병에 대한 제3상 임상 시험을 통해 조사되었지만 BBB를 통한 수송 불량으로 인해 실패할 가능성이 높습니다.13,14 따라서 변경에 대한 임상적 관심이 있습니다. 신경퇴행성 질환에서 소교세포의 표현형.
이러한 접근법은 반응을 유도하기에 충분한 수준으로 소교세포에 약물을 전달해야 합니다. 이를 위해 G4-OH-PAMAM 덴드리머는 전신 주사 후 많은 동물 모델에서 소교세포에 약물을 전달하는 것으로 나타났으며, 그 결과 현재 ccTLD(NCT03500627) 및 중증 코로나19 치료에 대한 임상 시험에서 평가되고 있습니다. -19 관련 염증(NCT04458298).18–28
소교세포 표현형 변경의 유익한 효과와 소교세포에 약물을 전달하는 능력을 결합하기 위해 우리는 테사글리타자르(PPAR/이중 작용제)를 G4-OH-PAMAMdendrimer에 접합했습니다(그림 1-3). 우리는 D-Tesa가 M1 소교세포의 표현형을 M2 표현형으로 변경하여(그림 4 및 5) 유해 활성 산소종의 분비를 감소시킬 수 있음을 입증했습니다.
또한, 우리는 D-Tesa로 처리된 미세아교세포가 -synuclein 및 -amyloid와 같은 병리학적 단백질을 분해하는 효소의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 기능적 분석에서 -amyloid의 식균 작용을 상향 조절한다는 것을 입증했습니다(그림 6 및 7).
D-Tesa가 BBB를 우회하고 소교세포에 축적되는 능력을 입증하는 데이터는 제시하지 못했지만, 유사한 약물 로딩, 크기 및 제타 전위를 가진 G4-OH-PAMAM 약물 결합체는 BBB를 통과할 수 있다는 것을 이전에 보여주었습니다. 정맥 투여 후 BBB가 손상되고 미세아교세포가 축적됩니다.26,36,52
이러한 결과는 다중 신경 질환 치료를 위한 D-Tesa의 추가 개발을 뒷받침합니다. 본 논문에서는 알츠하이머병 및 파킨슨병에 초점을 맞추고 있지만 D-Tesa는 다중 신경 질환에 대한 임상적 번역 가능성을 가지고 있습니다. 다발성 신경변성 질환의 병리학에서 소교세포의 유사한 역할로 인해 PPAR 작용제 피오글리타존도 조사되었으며 현재 파킨슨병,78 ALS,79 부신척수신경병증(NCT03864523), 다발성 경화증(NCT03109288) 및 혈종에 대한 제2상 임상 시험에서 조사되고 있습니다. 뇌내출혈의 해소(NCT00827892).
BBB를 통한 피오글리타존의 전달 불량으로 인해 이러한 임상 시험이 실패할 경우 D-Tesa는 이러한 전달 장애를 극복하고 이러한 질병을 앓고 있는 환자를 치료할 수 있습니다.
다른 그룹에서는 대식세포에 대한 PPAR 작용제의 전달을 개선하기 위해 나노입자를 활용했지만 이러한 작용제를 소교세포에 전달하려는 시도는 하지 않았습니다. Osinski 등은 Tesa가 탑재된 리포솜이 남성 렙틴 결핍 비만 모델의 내장 백색 지방에 있는 대식세포에 의해 대부분 흡수된다는 것을 입증했습니다.80
그들은 또한 Tesa가 탑재된 리포솜이 M1 마커 Mcp-1의 발현을 변경하지 않았지만 M2 마커 Arg1의 발현을 증가시킨 반면, 유리 Tesa로 처리하면 M1 대식세포의 총 수와 Mcp{{6 }}, Arg1의 발현을 증가시키지 않았습니다.
Nakashiroet al. 죽상동맥경화증의 맥락에서 피오글리타존(PPAR 작용제)을 대식세포에 전달하기 위해 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 나노입자를 사용했습니다.81
생체 내에서 그들은 PLGA-피오글리타존이 혈액 내 면역 세포 수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다. LPS와 인터페론-으로 처리된 1차 골수 유래 대식세포에서는 PLGA-피오글리타존이 IL-4 및 IL-10(M2 마커)을 증가시키고 IL-6 또는 TNF 수준을 감소시키지 않음을 발견했습니다.
그들의 연구 결과는 우리의 연구 결과와 유사합니다. M2 마커는 나노입자-PPAR 작용제 처리에 의해 증가된 반면, IL{2}} 및 TNF- 수준은 감소하지 않았습니다. Di Mascoloet al. 로시글리타존(또 다른 PPAR 작용제)을 전달하기 위해 PLGA-폴리비닐알코올 나노입자를 사용했습니다.82
시험관 내에서 그들은 나노입자-약물 복합체가 골수 유래 대식세포에서 iNOS, TNF- 및 IL{2}} 발현을 감소시키는 것을 입증했습니다. 그들은 LPS로 자극하기 전에 나노입자 약물로 세포를 전처리한 반면, 우리는 D-Tesa로 치료하기 전에 LPS로 세포를 전처리했습니다. 이는 우리가 또한 관찰했지만 TNF- 및 IL{6}}의 감소를 관찰하지 못한 이유일 수 있습니다. iNOS 발현이 감소합니다.
결론
현재 많은 신경퇴행성 질환에 대한 병리학적 변화 치료법은 없으며 인구가 계속해서 노령화됨에 따라 이러한 질병의 유병률과 치료 비용이 계속 증가할 것이므로 솔루션 개발의 시급한 필요성이 강조되고 있습니다. 최근 전염증성 M1 미세아교세포는 여러 신경퇴행성 질환의 병리학에서 매우 중요합니다.
결과적으로, 소교세포에서 'M1에서 M2' 표현형 변화를 유도할 수 있는 혈액뇌관문을 가로질러 약물을 전달할 수 있다는 것은 여러 질병, 특히 알츠하이머병과 파킨슨병에 대한 치료 가능성을 가지고 있습니다.
D-Tesa는 전신투여 후 소교세포에 'M1 to M2' 유도약물을 전달해 소교세포의 신경독성 물질 분비를 감소시키는 동시에 뇌 내 병원성 단백질의 분해와 식세포작용을 증가시키는 항염증 상태를 유도하도록 설계됐다. 우리는 매우 효율적인 클릭 화학 접근법을 사용하여 D-Tesa를 성공적으로 합성했습니다.
약물은 리소좀 조건에서 세포내에서 절단될 수 있는 에스테르결합을 통해 덴드리머에 부착되며, 테사의 약 60%가 리소좀 조건에서 처음 48시간 내에 방출됩니다.
D-Tesa는 M1에서 M2a/M2b/M2c로의 표현형 전환을 유도하는 데 있어서 시험관 내에서 Tesa보다 우수한 것으로 나타났으며, 이로 인해 산화질소 분비가 감소하고 α-시누클레인 및 α-아밀로이드 분해 효소의 발현이 증가하며 α아밀로이드의 식세포작용이 증가했습니다.
따라서 D-Tesa는 덴드리머의 유익한 전달 특성과 Tesa의 M1에서 M2로의 전환 특성을 결합합니다. 소교세포의 공통적인 역할과 M1에서 M2로의 표현형 전환을 유도하는 공통치료적 이점으로 인해 D-Tesa는 질병 진행의 올바른 단계에 투여될 때 많은 신경 장애를 치료할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
저자 기여
LD, AS, KL, RS, SK, RMK가 실험을 개념화했습니다. LD, AS 및 RS는 덴드리머-약물 접합체의 합성 및 특성화를 수행했습니다. LD, KL, JJ가 세포 실험을 수행했습니다. LD 및 K. L. 은 통계를 수행했습니다. LD와 AS가 원고를 썼고, 모든 저자가 원고를 편집했습니다.
이해 상충
RMK와 SK는 신경 질환의 소교세포에 대한 표적 전달을 위해 수산기 말단 덴드리머를 사용하는 공동 발명자일 뿐만 아니라 본 논문에 설명된 덴드리머 기술과 관련된 특허도 보유하고 있습니다.
그들은 플랫폼의 임상 개발을 선도하는 회사인 Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc. 및 RiniSight Inc.의 공동 창립자입니다. SK와 RMK는 AshvatthaTherapeutics Inc.의 이사회 구성원입니다. RS는 현재 AshvatthaTherapeutics에 고용되어 있으며 회사 주식을 소유하고 있습니다. 작품R. S.는 Ashvattha에 합류하기 전에 이 논문을 위해 수행했습니다. 이해 상충은 존스홉킨스 대학교에서 관리합니다.
감사의 말
시험관 내 실험에 대한 유용한 토론을 해주신 Elizabeth Smith Khoury에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 JohnsHopkins 및 NICHD(보조금 번호 HD076901)(RMK)의 Patz 우수 교수 기금의 지원을 받았습니다. Sony 유세포 분석기에 액세스할 수 있도록 비전 연구, 현미경 및 코어 모듈을 위한 Wilmer Core Grant(승인 번호 EY001865)에 감사드립니다.
Creative Common Attribution 3에 따라 라이센스가 부여된 이미지 컬렉션(http://smart.servier.com/)을 사용해 주신 Servier Medical Arts에 감사드립니다.0 일반 라이센스는 그래픽 요약을 만들기 위해 수정되었습니다.
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For more information:1950477648nn@gmail.com
