HPLC를 통한 Cistanche Herba의 물 추출물 내 Echinacoside 측정

쉬산산1 ,우캉규2 ,투 싱밍2 （1. 광저우 중의약대학 제3임상대학, 광저우 510405 광동, 중국; 2. 광저우중의약대학 제3부속병원,광저우 510378 광동,중국） 

추상적인: 목적 결정을 위해 HPLC 방법이 확립되었습니다.에키나코사이드C의 물 추출물에서istanche deserticola. 행동 양식Echinacoside는 HPLC에 의해 결정되었습니다. 분리는 Inertsil ODSSP C에서 수행되었습니다.18 아세토니트릴로 구성된 이동상 컬럼（A）및 0.4% 인산 용액（B）,기울기 용출에 의해. 검출 파장은 333nm로 설정되었습니다.,컬럼 온도는 30도였습니다. 유속은 1.0mL·분이었다.-1 주입 부피는 10 μL였습니다.결과농도 범위 44.939 7-539.276 4 ug ·mL 내에서 에키나코사이드의 선형 관계- 1 좋았다（r = 0.999 8）. 회수율은 94.59%-105.31%였습니다.（RSD= 2.93퍼센트,n = 9）. Cistanche herba 물 추출물의 echinacoside 함량은 15.527이었다.,7.347,12.267mg·g-1 . 

결론: 반복성이 좋은 확립된 HPLC 방법은 정확합니다.,간단하고 실현 가능합니다. 의 물 추출물에서 에키나코사이드 측정에 적합합니다.Cistanche deserticola 엄마. 

키워드:HPLC;의 물 추출물Cistanche Deserticola;에키나코사이드;내용의 결정

Cistanche Deserticola임상 실습에서 중국 전통 의학에서 일반적으로 사용되는 강장제이며 "사막 인삼". 중국 약전 2015년판에 포함된 Cistanche deserticola는 Orobaceae 식물 Cistanche deserticola YC Ma 또는 Cistanche tubulosa (Schenk) Wright의 건조하고 비늘 모양의 다육질 줄기입니다. 성질은 따뜻하고 맛은 달고 짠맛이 있으며 신장과 대장 경락에 속한다. 신장양을 보양하고 진혈을 보하며 장을 촉촉하게 하고 변비를 해소하는 효능이 있다. [2]. 

사막 인삼

"신농본초경"은 "중을 보양하고, 오장을 보양하며, 음기를 튼튼하게 하고 정수를 보양한다"고 말합니다.Cistanche deserticola는 주로 페닐에타노이드 배당체, 이리도이드 및 배당체, 리그난 및 배당체, 다당류, 에스테르 및 알칼로이드를 포함합니다[3].페닐에탄올 배당체의 주요 활성 구성 요소입니다.Cistanche Deserticola, 그 중 echinacea와 poolside는 Chinese Pharmacopoeia에서 Cistanche deserticola의 식별 및 함량 결정을 위한 지표 구성 요소입니다.. 

Phenylethanol glycoside는 Cistanche deserticola의 주요 활성 성분입니다.

약리학적 연구[4]는 Cistanche Deserticola장보습, 변비해소, 간보호, 골다공증 저항, 항산화, 항노화, 항피로 등 다양한 약리작용이 있다.. 의 수성 추출물Cistanche Deserticola쥐의 조골 세포의 뼈 형태 형성 단백질 2 유전자와 난소 절제 마우스의 혈청에서 타르타르산 저항성 산성 포스파타제 및 오스테오칼신을 촉진할 수 있습니다., 뿐만 아니라 Smad1 및 Smad5 유전자 및 골수에서 형질전환 성장 인자 등의 발현이 있다.항골다공증 효과 [5-6]. 에키노사이드 체외에서 조골세포의 증식을 촉진하고 골수 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화를 촉진할 수 있습니다.[7-9]. 

Cistanche deserticola의 주요 화학 성분인 Echinoside

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최근 몇 년 동안 Cistanche deserticola 및 그 복합제제[10-12]의 알코올 추출물에서 echinacoside 및 poolside의 함량 측정에 관한 많은 보고가 있었지만, Cistanche deserticola 물 추출물의 지표 성분. 이 연구에서는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 Cistanche deserticola 물 추출물의 에키나코사이드 함량을 측정했습니다.

1. 재료

1.1 장치

LC-20AT 고성능 액체 크로마토그래피, SPD-20검출기, SIL-20자동 샘플러, CTO-10ASvp 컬럼 온도 상자, LCsolution 액체 크로마토그래피 워크스테이션, Shimadzu Corporation 일본; MES125P-OCE-DU 전자 분석 저울, Sartorius, 독일; SHZ-D(III) 순환수 다목적 진공 펌프, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd;

1.2RC2BSO25 회전 증발기 냉각 순환 시스템, RV10DS96 회전 증발기, IKA, 독일; DK-S26 Electric Thermostatic Water Bath, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; UPR 시리즈 초순수 기계, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 의약 재료 및 시약

고기 용 의약 재료, 광저우 링난 전통 중국 의학 조각 유한 공사에서 구입, 배치 번호: 18010011806001, 181001. 제3 계열의 수석 중국 약초학자 Tu Xingming이 확인한 표범과 식물 Cistanche deserticola의 건조하고 비늘 모양의 다육질 줄기 광저우중의약대학교 병원은 광저우중의약대학교 제3부속병원 약품검사실에 보관되어 있습니다. 에키노사이드 참조 물질, 함량 89.7%, 중국 식품 의약품 통제 연구소, 배치 번호: 111670-201706; 아세토니트릴은 크로마토그래피적으로 순수합니다(Merck, Germany). 메탄올과 인산은 분석적으로 순수합니다(Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.). 물은 초순수입니다.

2. 방법 및 결과

2.1 Cistanche deserticola로부터 물 추출물의 제조

가져가시탕슈 가루, 10배의 증류수를 넣고 열을 가하고 환류하여 1시간씩 2회 추출한다. 여액을 여과하고 합한 다음 회전 증발기를 사용하여 여액을 조약 함량 0.100 g · mL-1로 농축합니다. 대기를 위해 4도에서 보관하십시오. 2.2 크로마토그래피 조건 및 시스템 적합성 크로마토그래피 컬럼: InertsilODS SPC18 컬럼(150mm × 4.6mm,5 μm), 이동상: 아세토니트릴(A) - 0.4% 인산 용액(B), 기울기 용출: 0~ 5분, 17퍼센트 A, 5~25분, 20퍼센트 A, 25~30분, 17퍼센트 A, 검출 파장: 333nm, 컬럼 온도: 30도, 유속: 1.0mL · min-1, 주입량: 10 이러한 크로마토그래피 조건에서 echinacea 피크와 인접 성분 간의 분리능은 1.5 이상이며 echinacea 피크에 대한 이론적인 컬럼 수는 4000 이상이어야 합니다.크로마토그램은 그림 1에 나와 있습니다.

그림 1 에키나코사이드(A)와 Cistanche herba 물 추출물(B)의 HPLC 크로마토그램

2.3 용액의 준비

2.3.1 참조 솔루션

적당량의 무게를 잰다.에키나세틴대조물질을 정밀히 달아 10mL 메스플라스크에 넣고 메탄올을 넣어 녹이고 대조액 1ml당 에키나세틴 898.794μG로 하고 4도에서 대기보관한다.

Cistanche deserticola의 에키노사이드

2.3.2 테스트 솔루션

Cistanche Deserticola 수성 추출물 2.0mL를 정확하게 측정하고, 수욕에서 증발시키고, 메탄올에 녹이고, 10mL 메스 플라스크에 일정 부피가 되게 하고, 잘 흔들어 준다. 0.22μM 미세다공성 막 여과, 즉.

2.4 선형 관계 조사

{{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, 및 3.00 2.3.1의 기준액을 5 mL 메스플라스크에 넣고 메탄올을 넣어 일정량이 되도록 잘 흔들어 44.9397, 89.8794, 179.7588, 359.5176, 449.3970의 농도구배를 얻는다. , 및 539.2764 μ G · mL-1의 기준 용액, 0.22 μ M 미세다공성 막 여과. 2.2의 크로마토그래피 조건에 따라 결정을 수행하고 피크 면적을 기록합니다. 기준 물질의 질량 농도를 가로 좌표(X, μ G · mL-1)로 ​​사용하여 피크 면적을 세로 좌표(Y)로 하고 선형 회귀 방정식을 얻습니다: Y=13185. 0X-32273.0, r=0.9998. 결과는 echinacea가 44.9397에서 539.2764 μ 범위인 것으로 나타났습니다. g · mL-1의 농도 범위 내에서 선형 관계가 양호합니다.

2.5 정밀 테스트

539.2764 μG·mL-1 표준액을 취하여 2.2의 크로마토그래피 조건에 따라 시료를 연속 6회 주입하여 피크면적을 기록한다. 결과 echinacea 피크 면적의 RSD는 1.81%로 기기의 정밀도가 우수함을 나타냅니다.

2.6 안정성 시험

2.0mL를 정확하게 측정Cistanche Deserticola수성 추출물, 수조에서 증발 건조, 메탄올에 용해, 10 mL 메스 플라스크에 일정 부피로 가져옴, 잘 흔들어 0.22 μ 미세다공성 막으로 여과, 주입 2.2의 크로마토그래피 조건에 따라 0, 2, 4, 8, 12 및 24시간에 측정을 위해 샘플을 채취하고 피크 면적을 기록합니다. 결과 에키나시아 피크 면적의 RSD는 1.16%로 24시간 이내 안정성이 우수한 것으로 나타났다.

2.7 반복성 테스트

2.0 mL 수용성 6인분을 정확하게 측정Cistanche deserticola 추출물, 2.3.2에 기술된 방법에 따라 시험 용액의 6 부분을 병렬로 준비하고 2.2에 기술된 크로마토그래피 조건에 따라 결정을 위해 샘플을 주입하고 피크 면적을 기록합니다. 결과 에키네시아 질량 농도의 RSD는 1.28%로 이 방법의 반복성이 우수함을 나타냅니다.

Cistanche deserticola 실험

2.8 샘플 추가 회수 테스트

1의 9개 부분을 정확하게 측정합니다.0mLCistanche Deserticola수성추출물, {{0}}.8, 1.0 및 1.2 mL의 대조액(101.552 mg·mL - 1)을 넣고 수욕에서 증발시켜 녹인다. 메탄올, mL 부피 플라스크의 부피로 가져옵니다. 잘 흔들어 0.22 μ m 미세다공성 여과막으로 여과하여 고농도, 중농도, 저농도 시험용액을 준비한다. 각 농도의 3개 부분을 병렬로 준비하고 2.2의 크로마토그래피 조건에 따라 측정하고 피크 면적을 기록하고 샘플 중독 회복을 계산합니다. 결과는 표 1에 나와 있습니다.

2.9 샘플 내용물의 결정

2.0mL의 3인분을 정확하게 측정합니다.Cistanche deserticola의 물 추출물, 수조에서 증발 건조, 메탄올에 용해, 10mL 메스 플라스크에 일정 부피가 되게 하고 잘 흔들어 줍니다. 피크 면적을 기록하고 에키네시아 함량을 계산합니다. 결과는 표 2에 나와 있습니다.

표 1 에키나코사이드의 회복 시험 결과

표 2 천일초 물추출물 중 에키나코사이드 함량 측정 결과

3.논의

3.1 시험품의 조제방법

의 수성 추출물Cistanche Deserticola페닐 에탄올 배당체 및 다당류와 같은 다양한 화학 성분을 함유하여 테스트할 성분에 특정 간섭을 일으킵니다.. 이 연구는 50% 메탄올과 메탄올의 두 가지 다른 농도의 용매를 조사했습니다. 그 결과, 50% 메탄올을 용매로 사용하는 시험 제품의 크로마토그램에서 에키네시아와 인접 성분 사이의 피크 분리 효과가 좋지 않았으며; 메탄올을 용매로 사용하면 echinacea glycoside 피크의 분해능이 좋고 다른 불순물 피크의 간섭이 없습니다. 따라서 시험용액의 용매로 메탄올을 선택하였다. 메탄올을 용매로 사용하여 Cistanche deserticola의 물 추출물을 수조에서 증발 건조시켰다. 메탄올 용해, 정량 진탕, 메탄올 초음파(10분) 용해의 두 가지 처리 방법을 사용하였다. 결과는 두 방법 사이에 큰 차이가 없다는 것을 보여주었다. 이 방법은 메탄올 용해 및 정량 진탕의 간단한 조작으로 인해 시험 용액을 준비하기 위해 선택되었습니다.

중국 허브 시탕슈

3.2 이동상 선택

이 연구에서는 Chinese Pharmacopoeia(Volume I)(2015)에서 Cistanche deserticola의 함량 측정에 사용된 이동상(메탄올-0.1% 포름산)을 참조했습니다. 그 결과 echinacea glycoside의 피크가 넓어지고 leading edge 현상이 나타났는데, 이는 이동상의 약한 용출 능력과 관련이 있을 수 있습니다. 관련 문헌[12-13]을 참조하면 이동상으로 acetonitrile-0.5% acetic acid를 사용하였으나 echinacea의 피크 모양이 불량하고 tailing 현상이 있었다. 이동상의 pH 값을 고려하여 최종적으로 acetonitrile-0.4% 인산을 이동상으로 사용하였다. 그 결과, 에키네시아 피크의 이론 단수는 4000 이상이었고, 에키네시아와 인접 성분 피크 사이의 분해능은 1.5 이상이었다. 피크 모양은 불순물 피크의 간섭 없이 대칭이었고 기준선은 안정적이었습니다. 따라서 본 연구에서는 아세토니트릴 - 0.4% 인산을 에키나시아 함량 측정을 위한 크로마토그래피 이동상으로 사용했습니다. 본 연구에서는,HPLC 방법을 사용하여 Cistanche deserticola 수성 추출물에서 Echinacea를 결정했습니다.

Cistanche 추출물 분말

이 방법은 간단하고 정확하며 재현 가능합니다. 그것은 cistanche deserticola 수성 추출물의 echinacea 측정에 적합하며 cistanche deserticola 수성 추출물의 품질 관리 방법으로 사용할 수 있습니다.이 연구는 Cistanche deserticola의 물 추출물에서 echinacea의 함량만을 결정했습니다.미래에,에키네시아 함량에 대한 다양한 요인의 영향을 탐구하기 위해 Cistanche Deserticola 복합 달인에서 에키네시아 함량을 결정하여 Cistanche Deserticola를 포함하는 달인의 품질 관리에 대한 참조를 제공할 계획입니다.

참조:

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[2] 중화인민공화국 국가 약전 위원회 약전(1부) [M] Beijing: China Medical Science and Technology Press, 2015:135-136

[3] Chen Fei, Chen Zhuo, Xing Xuefei 등 Cistanche deserticola의 연구 진행 [J] 약물 평가 연구, 2013, 36 (6): 469-475

[4] Cistanche deserticola에 대한 약리학적 연구의 Fang Jian Advances [J] Guangming Traditional Chinese Medicine, 2017, 32 (14): 2140 - 2142

[5] Xing Xiaoxu, Liu Zhongjie, Han Bo 쥐 조골 세포에서 뼈 형태 형성 단백질 2 유전자 발현에 대한 cistanche deserticola 수성 추출물의 효과 [J] 중국 동물축산 및 수의학, 2013, 40(1): 17-21

[6] LIANG H, YU F, TONG Z, 외. 골다공증 질환에서 혈청 BGP 및 TRAP 및 골수 Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA 및 TIEG1 mRNA 발현 수준에 영향을 미치는 Cistanches herba 수성 추출물[J]. Molecular Biology Reports, 2013, 40(2):757-763.

[7] Fang Hailin, Li Junkao, Yao Senming 등 ERK/BMP-2 신호 경로를 활성화하여 쥐 골아세포 증식을 촉진하는 Echinoside에 대한 관찰 [J] Grassroots Medical Forum, 2015, 19 (4): {{5 }}

[8] 에키나사이드에 의해 유도된 골수 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화와 그 기전에 관한 Tian Yuan 연구 [D] Shenyang: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2015

[9] Wei Dawei, Ge Ziyu, Liu Yihan 등 Echinoside에 의해 유도된 골수 간엽 줄기 세포의 조골 세포로의 분화에 관한 연구 [J] Pharmacology and Clinic of Traditional Chinese Medicine, 2017, 33 (2): 48-52

[10] Tian Yubiao, Yang Guang'an, Huang Weijie 등 HPLC에 의한 Cistanche deserticola Micropowder의 Echinoside 및 Piloside 결정 [J] Anhui Agricultural University, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Yang Sude, Hu Junhua, Li Jiachun 등 HPLC를 통한 총 Cistanche 배당체 캡슐의 Echinoside, Piloside 및 Isopiloside 동시 측정 [J] World Science and Technology - Modernization of Traditional Chinese Medicine, 2015, 17 (3) : 609-613

[12] Xu Xiaoxue Cistanche deserticola 및 그 유효 성분의 항골다공증 효과에 대한 약력학 및 대사학 연구 [D] Yinchuan: Ningxia Medical University, 2017

[13] Yan Yao, Meng Xinyuan, Xu Huanhuan 등 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 Qirong Runchang 구강 액체의 Echinoside 및 Piloside 측정 [J] Journal of Xinjiang Medical University, 2018, 41 (7): 886-888892