디젤 배기가스 노출은 Zebrafish 뇌의 신경 퇴행과 관련된 네트워크의 표현을 변화시킵니다 3부
Mar 04, 2024
단백질체학 비교 결과, ACTG2(액틴,감마 2), CAT(카탈라제), GSR(글루타티온-디설파이드리덕타제), GST(글루타티온 S-트랜스퍼라제), HMOX1(헴 옥시게나제 1), PRDX1(페록시레독신)의 상향 조절(과다발현)이 밝혀졌습니다. 1) 유비퀴틴 결합 효소 ubcM2, RAP1A(RAP1A, RASoncogene 계열 구성원), UBE2E3(유비퀴틴 결합 효소 E2 E3) 및 ACTA1(액틴, 알파 1)의 하향조절도 있습니다.
프로테오믹스(Proteomics)는 유기체 내 단백질의 종류, 구조, 양, 기능을 연구하는 대규모 과학기술이다. 최근 몇 년 동안 단백질체학이 기억과 밀접한 관련이 있음이 점점 더 많은 연구에서 밝혀졌습니다.
연구자들은 뇌의 단백질이 뉴런 사이의 신호 전달에 영향을 미쳐 학습 및 기억과 같은 인지 활동에 영향을 미칠 수 있음을 발견했습니다. 예를 들어, 기억 인코딩 및 저장 과정에 필요한 대부분의 단백질 분자는 시냅스에서 합성됩니다. 이러한 단백질 분자는 신경 신호의 전도 및 전달에 직접적으로 관여할 뿐만 아니라 시냅스 연결 및 뉴런 간의 안정성에도 영향을 미쳐 기억의 생성 및 강화에 영향을 줄 수 있습니다.
연구에 따르면 특정 단백질이 기억 과정에서 중요한 역할을 한다는 사실도 밝혀졌습니다. 예를 들어, 뉴런의 CaMKII 단백질 키나제는 시냅스 연결의 강도와 안정성을 조절하고 학습과 기억에 중요한 역할을 합니다. 또 다른 중요한 단백질은 BDNF로, 이는 뉴런의 성장, 시냅스 강화 및 뉴런 생존을 촉진하여 기억의 강화 및 유지를 향상시킬 수 있습니다.
또한 일부 연구에서는 신체 건강과 식단도 단백질체학과 기억력에 중요한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 적절한 수면, 적절한 운동, 저지방, 고단백 식단은 단백질 합성과 회복을 촉진하여 기억력과 인지 능력을 향상시키는 데 도움이 됩니다.
요약하자면, 단백질체학과 기억은 밀접하게 연관되어 있습니다. 생명 과학을 연구하는 과학자들은 기억력을 강화하고 알츠하이머병과 같은 인지 장애 치료를 예방하기 위해 프로테옴을 조절하는 방법을 점점 더 많이 발견하고 있습니다. 그러므로 우리는 과학적인 연구 결과에 주목하고, 좋은 식습관, 생활 습관, 운동 습관을 유지하여 건강하고 강한 두뇌를 유지하고 더 나은 기억력을 가져야 합니다. 기억력 향상이 필요하다고 볼 수 있는데, Cistanche Deserticola는 아세틸콜린 수치와 성장인자 수치를 높이는 등 신경전달물질의 균형도 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 이 물질은 기억과 학습에 매우 중요합니다. 또한 Cistanche Deserticola는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌에 충분한 영양분과 에너지를 공급하여 뇌 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.
그중에서도 Nrf2 억제제인 ubcM2의 하향조절은 이 경로의 활성을 높일 수 있습니다. 세포골격의 서로 다른 구성 요소(ACTG2 및 ACTA1)가 차별적으로 행동하고 Nrf2 또는 Keap1에서 유의미한 차등 발현이 부족하다는 점을 고려하면 DEPem에 대한 노출이 세포골격의 재배열(Nrf2가 핵으로 전이되는 것을 선호하지 않음)과 활성화를 유도할 수 있다고 결론 내릴 수 있습니다. 산화 스트레스 자극을 통해 간접적으로 Nrf2 경로가 활성화됩니다(그림 4).
이러한 발견은 PRDX, GSR 및 GST(하류 유전자)의 상향 조절을 보여주는 전사체 분석에 의해 잘 뒷받침됩니다. 그러나 전사체 분석에서는 c-Fos와 FRA1(핵 Nrf2의 두 가지 억제제)이 상당히 하향 조절되어 DEPe 치료 중에 Nrf2 활성이 더 높아진다는 점을 추가로 자세히 설명했습니다.
Phagosome 성숙
Phagosome 성숙은 점점 더 산성화되고 막에 결합된 세포 내 구조로 내부화된 입자의 이동을 촉진하여 입자 분해를 초래합니다. 표면 막이 밀봉되거나 절단된 후, 식소체는 초기 엔도솜, 후기 엔도솜 및 리소솜과 융합되어 그 구성이 상당히 산성화되어 산화 및 분해 환경으로 전환됩니다.
포식체 운동은 세포골격 단백질 결합(미세소관)을 기반으로 발생하며, 이는 엔도솜과 리소솜이 역동적인 방식으로 순차적으로 융합되도록 합니다(Gotthardt et al. 2002). 성숙하는 동안 GTPase Rab5는 여러 분자와의 상호작용을 통해 초기 엔도솜의 융합을 유도합니다. 초기 엔도솜 항원 1(EEA1), VPSS34 복합체 및 SNARE단백질을 포함합니다.
더욱이, 산성화는 막을 가로질러 H+를 이동시키고 내강을 더욱 산성화시키는 vATPase(액포 양성자 펌프)를 통해 동시에 발생합니다(Desjardins et al. 1994).
이 경로의 유의미한 관련은 전사체 수준에서 발견되지 않았지만, 우리의 단백질체 분석은 ATP6V1A(ATPase H+수송 V1 하위 단위 A), ATP6V1E1,ATP1B2B, ATP1B3A, ATP6V1F, DYNLRB1(dynein 경쇄 로드블록 유형 1)의 하향 조절을 보여줍니다. TUBA1C(튜불린 알파 1c), TUBB2A, TUBB4A 및 VAMP2(소포 관련 막 단백질 2)는 DEPe 처리가 하부포식체 성숙 활성 또는 리소좀 pH 변경으로 이어질 수 있음을 시사합니다(그림 4). 이는 DEPe 노출로 인해 신경 자가포식 기능이 저하되고 대기 오염의 신경 독성에 기초가 되는 메커니즘을 시사한다는 최근 보고서와 일치합니다(Barnhill et al.2020).
아밀로이드 처리
아밀로이드 플라크는 치매가 있는 AD 및 PD의 신경병리학적 뇌 병변의 특징입니다. 이러한 구조는 AD의 병태생리학의 중심인 A-베타 펩타이드로 구성됩니다(SadighEteghad et al. 2015).
아밀로이드 베타는 Type 1 막횡단단백질-아밀로이드 단백질(APP)의 감마-분비효소 복합체(Presenilin1/2)와 베타-분비효소(BACE1)에 의해 처리됩니다. 비정상적인 Ca2+유입은 CDK5 경로를 통해 미세소관 관련 단백질 타우브의 인산화에 역할을 하는 칼페인(Calpain)의 비정상적인 활성화를 초래하는 것으로 알려져 있습니다.
더욱이, A-베타의 축적과 관련된 산화 스트레스는 MAP 키나제를 포함한 여러 키나제의 활성화에 기여하여 타우의 인산화를 초래합니다. 타우의 병리학적 과인산화는 미세소관의 불안정화에 필수적인 역할을 합니다(Sadigh-Eteghad et al. 2015 ). 이러한 변화는 특히 AD 및 PD의 발병과 관련이 있으며 대기 오염이 위험을 증가시키는 데 기여하는 요인이 될 수 있습니다.
우리의 발현 분석은 CAPNS1(calpain small subunit 1), MARK1(미소관 친화성 조절 키나아제 1) 및 PRKAR1B(단백질 키나아제cAMP 의존형 I 조절 서브유닛 베타)를 포함한 세 가지 조절 인자가 하향조절됨에 따라 아밀로이드 처리 조절 인자에 대한 DEPe의 불안정한 영향을 시사합니다. 단백질 수준(그림 4).
미토콘드리아 기능 장애
세포 내 산소의 주요 소비자인 미토콘드리아에는 전자를 산소로 전달하는 다수의 산화환원 캐리어가 포함되어 있으며, 이로 인해 활성산소종(ROS)이 형성됩니다.
이 세포 소기관에는 ROS를 해독하고 다른 세포 구성 요소에 대한 산화 손상을 방지하는 항산화 방어 시스템이 포함되어 있습니다. DEPe 노출로 인해 미토콘드리아 기능 장애를 일으킬 가능성이 있는 주요 단백질의 발현이 변화되었습니다. 도 4에 나타난 바와 같이, ATP 합성효소(ATP5F1D, ATP5mea), 시토크롬 c 산화효소(COX7A2), NADH 탈수소효소(NDUFA10,NDUFS8), 2-옥소글루타레이트 탈수소효소(OGDH), 및 전자 수송에서 중추적인 역할을 하는 시토크롬 b-c1 복합체 서브유닛 2(UQCRC2).
이는 ATP 생산을 변경하고 직접적으로 ROS 생산 및 독성을 증가시킬 수 있습니다. 미토콘드리아 기능 장애는 AD 및 PD의 발병에 기여하는 것으로 제안되었으며, 앞서 언급한 일부 경로와 마찬가지로 대기 오염은 이 중요한 세포 기관의 기능을 방해하여 위험을 변경할 수 있습니다.
축삭 안내 신호
신경 연결의 형성에는 시냅스 표적을 향해 이동하는 축삭의 확장이 필요합니다. 축삭 앞쪽 가장자리의 축삭 성장 원뿔에는 축삭의 탐색에 필요한 매력적이고 반발적인 안내 신호를 감지하는 능력이 있는 수용체가 포함되어 있습니다.
BMP, Shh 및 Wnt(최근 축삭 안내에 관련됨) 외에도 안내 단서에는 최소한 4가지 주요 그룹이 있습니다. (i) Netrins 및 DCC/UNC-5 수용체; (ii) 플렉신, 세마포린 및 뉴로필린 수용체; (iii) 슬릿 및 로보 수용체; 및(iv) 에프린 및 Eph 수용체. 이러한 단백질은 분비되어 세포외 기질(슬릿, 네트린 및 일부 세마포린)과 연관되거나 세포 표면에 고정될 수 있습니다(에프린 및 다른 세마포린)(Stoeckli 2018). DEPe를 사용한 치료는 축삭 유도의 여러 측면에 영향을 미칩니다.
단백질 수준에서는 치료 시 몇 가지 중요한 요소와 조절 인자가 변경되었습니다. PLXNB2(플렉신 B2)는 과도하게 표현되고 ARHGEF11(Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 11), CHMP1A(전하 다포체 단백질 1A), COPS5(COP9 신호소체소체 5), GNAT1(G 단백질 하위 단위 알파 트랜스듀신 1), GNAT2를 포함한 여러 단백질은 과소 표현됩니다. (G 단백질 소단위 알파 트랜스두신 2), GNB5(G 단백질 소단위 베타 5), MYL1(미오신 경쇄 1), MYL2(미오신 경쇄 2), NCK1(어댑터 단백질 1), PLXNA1(플렉신 A1), PRKAR1B(단백질 키나제) cAMP 의존형 I형 조절 하위단위 베타), RAC3(Rac 계열 smallGTPase 3), RAP1A(RAS 종양유전자 계열의 구성원), SHANK2(SH3 및 다중 안키린 반복 도메인 2), TUBA1C(튜불린 알파 1c), TUBB2A(튜불린 베타 2A 클래스 IIa ) 및 TUBB4A(tubulinbeta 4A 클래스 Iva)는 발달 중인 배아에서 축삭 유도의 심각한 손상을 시사합니다(보충 표 5).
흥미롭게도, 축삭 유도 경로는 전사체 수준에서 크게 영향을 받지 않았는데, 이는 이 경로의 관련이 효과기/조절자 단백질 중 일부가 분해되는 하류 결과일 수 있음을 시사합니다.
여기에 설명된 축삭 안내 경로의 변화는 AD 및 PD와 관련된 신경 독성 경로를 반영하거나 단순히 발달 중인 배아의 신경 발달 간섭을 반영할 수 있습니다. DEPe에 노출된 성인의 발현 프로필을 분석하면 이 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다.
기타 경로
우리의 단백질체학 및 전사체 분석은 또한 멜라토닌 분해, 일주기 리듬, Sertoli 세포-Sertoli 세포 접합 신호, 상피 부착 접합 신호, 갑상선 호르몬 대사 II(접합 및/또는 분해를 통해), RhoA 신호, 이노신을 포함한 여러 경로 및 대사 경로의 관련성을 입증했습니다. -5'-인산염 생합성 II, GP6 신호 전달 경로, RhoGDI 신호 전달, 외인성 프로트롬빈 활성화 경로 및 응고 시스템. 이러한 변경 사항 중 상당수는 개발 중단으로 인한 변경 사항을 반영할 수 있습니다.
예를 들어, 단백질체학 및 전사체 분석 모두 광전달 경로가 DEPe 처리 시 발현에 가장 큰 변화를 갖는 것으로 나타났습니다. 보충 표 5에서 볼 수 있듯이 Opsin, GRK, S-arrestin, Transducin-, Transducin-, PDC 및 GUCA를 포함한 여러 유전자는 DEPe 노출로 인해 전사 수준이 약화되었습니다. 이 경로에서 어떤 요소의 유도에 대한 증거가 부족하기 때문에 DEPe 치료는 시각 시스템의 발달을 손상시키는 것으로 보입니다. 이는 치료 후 눈이 완전히 발달하지 않고 작다는 우리의 관찰과 일치합니다.
기능 평가
이 보고서에서는 시토크롬 P450(Cyp1A)의 상당한 상향 조절이 DEPe 노출의 가장 두드러진 효과였습니다. Cyp1A는 많은 내인성 및 외인성 화합물을 대사하며 뇌에서의 발현 증가는 독성을 예방하거나 독성에 기여할 수 있습니다. DEPE 독성에서 Cyp1A의 역할을 더 잘 이해하기 위해 CRISPR/Cas9를 활용하여 Cyp1A 녹다운 모델을 생성했습니다. 제브라피시의 유전자 편집 절차는 모자이크 배아를 생성하는 부분적인 과정일 가능성이 높으므로 "녹아웃" 대신 "녹다운"(KD)이라는 용어를 사용합니다. 서열 특이적 가이드 RNA를 사용하여 첫 번째 CCA PAM 사이트를 Cyp1A의 첫 번째 엑손인 TGA(정지) 코도닌으로 변환했습니다. 비표적 가이드-RNA는 스크램블 컨트롤(SC)로 대안적으로 사용되었습니다.
그런 다음 최대 20개의 KD 및 SC 배아(5pdf)의 머리에서 총 RNA를 분리하고 qPCR 분석을 통해 녹다운 효율성을 검증했습니다. 높은 처리량의 RNA-Seq 연구에서 관찰된 것과 유사하게, 이 실험은 SC 배아에서 DEPe 처리 시 Cyp1A의 급격한 유도(기준선에서 30.59-배)를 입증한 반면 KD 배아에서는 발현 증가가 느렸습니다. 그림 5a).
7-주간 과정(n이 40 이상) 동안 6개 그룹의 배아의 생존이 그림 5b에 나와 있습니다. 간단히 말하면, 7pdf에서 평균 생존율은 WT/DMSO, WT/DEPe, SC/DMSO, SC/DEPe, KD/DMSO 및 각각 KD/DEPe입니다. 따라서 Cyp1A의 KD는 생존율을 감소시켰지만 대조군에 비해 DEPe 처리 어류에서는 극적으로 감소했습니다.
또한 KD는 형태학적 기형의 비율도 상당히 높았습니다(그림 5c). 따라서 DEPe에 의한 Cyp1A 발현 유도는 보호적인 보상 메커니즘인 것으로 보입니다. 우리 연구 결과의 중요한 한계는 제브라피시 뇌에서 Cyp1A 발현 유도를 측정했지만 KDexperiments는 전체 배아에서 발현을 감소시켰다는 것입니다.
신경퇴행성 질환에 대한 중요성과 의미
대기오염은 삶의 질에 부정적인 영향을 미치고 인간과 동물의 질병 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 높은 처리량 발현 분석을 통해 우리는 DEPe 처리가 제브라피시 배아 머리의 여러 생물학적 과정과 신호 전달 경로를 변경했음을 보여주었습니다. 식세포 형성, 아밀로이드 처리 및 미토콘드리아 기능의 변화는 특히 신경변성과 관련이 있습니다.
놀랍게도 우리의 결과는 대기 오염 독성에 중요한 역할을 하는 것으로 가정된 염증의 명확한 관여를 나타내지 않았습니다. 이는 몸 전체가 아닌 5-일된 제브라피시의 머리에서만 발현을 측정했기 때문일 수 있습니다. 이 연구는 DEPe 노출이 뇌에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위한 것입니다.
뇌에는 DEPe에 의해 활성화될 가능성이 있는 미세아교세포가 포함되어 있지만 이러한 미세아교세포는 뇌 세포의 매우 작은 부분을 구성하므로 변화가 감지되지 않을 수 있습니다. 또한, 소교세포는 3~5pdf까지 발달 중인 유충의 뇌에 존재하지 않고 기능합니다. 이 때문에 조기 노출은 염증 반응 연구에 가장 적합하지 않을 수 있습니다. 생체이물 대사의 유도는 또한 대기 오염에 대한 보상 또는 보호 반응과 관련이 있을 가능성이 높습니다.
우리의 Cyp1AKD 모델은 이 경로의 보호 역할을 검증했으며 발현 연구가 대기 오염과 같은 독성 물질의 메커니즘을 결정하는 중요한 단서를 제공할 수 있는 방법에 대한 훌륭한 예를 나타냅니다. Cyp1A 유전자의 다형성이 대기 오염에 노출된 인간의 AD 또는 PD 위험을 변화시키는지는 알려지지 않았지만, 이러한 결과는 잠재적인 유전자-환경 상호작용을 암시하며 추가 조사가 필요합니다.
해결해야 할 중요한 질문 중 하나는 대기 오염에 대한 DEPe 노출의 관련성입니다. DEPe는 흡입 챔버를 사용할 수 없는 세포 배양 및 기타 모델에 대한 대기 오염 연구에 사용되는 가장 일반적인 혼합물입니다. DEP의 디클로로메탄 추출물에는 혈류로 들어가 뇌에 생체축적될 가능성이 가장 높은 PAH와 같은 소수성 부분이 포함되어 있습니다. 최근 연구에서는 인간 부검 뇌의 여러 PAH 농도를 확인했으며 여기에 제시된 연구에서 사용된 것과 매우 유사한 PAH 농도가 포함되어 있음을 발견했습니다(Pastor-Beldaet al. 2019). 따라서 제브라피시 두뇌에 대한 노출은 인간 두뇌에 생물학적으로 축적되는 것으로 관찰된 PAH 및 기타 부분을 포함하고 있기 때문에 매우 관련이 있습니다.
이 작업에 자금을 지원한 다음 기관에 감사드립니다: Levine Foundation(JMB), 국립 환경 보건 과학 연구소의 보조금, NIEHST32ES015457(LMB, SK) 및 The Parkinson's Alliance(JMB).
저자 기여 연구의 개념 및 설계(MSJ, LMB, JMB); 데이터 획득(MSJ, HM, LMB, SL): 데이터 분석 및 해석(MSJ, LMB, JMB) 중요한 지적 내용(MSJ, HM, LMB, JMB)에 대해 기사 초안을 작성하거나 비판적으로 수정합니다.
자금 지원 이 연구는 Levine Foundation(JMB), 국립 환경 보건 과학 연구소, NIEHS T32ES015457(LMB, SK) 및 The Parkinson's Alliance(JMB)의 보조금을 지원 받았습니다.
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