Bletilla Striata의 잠재적인 항멜라닌 생성 활성 성분의 발견 및 식별

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 및 Hongjiang Chen1,2*

추상적인

배경:Bletilla striata는 중국 전통 의학(TCM)의 많은 피부 미백 고전 공식의 주요 약이며 최근 화장품 산업에서 널리 사용됩니다. 그러나 그 유효성분은 아직 불분명하고 섬유근은 효율적으로 사용되지 않고 있다. 현재 연구의 목적은 제브라피시 모델과 분자 도킹을 통해 잠재적인 항멜라닌 생성 활성 성분을 발견하고 식별하는 것입니다.

행동 양식:그만큼항산화제활성은 2,{1}}디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH) 라디칼 소거 활성, 2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤티아졸린{9}}술폰산)(ABTS ) 라디칼 소거 활성 및 철 환원항산화제전력(FRAP) 분석. 항 멜라닌 생성 활성은 다음과 같이 평가되었습니다.티로시나제억제활동제브라피쉬에서 체외 및 멜라닌 억제. 화학 프로필은 사중극자 비행 시간 탠덤 질량 분석(UPLC-Q-TOF-MS/MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의해 수행되었습니다. 한편, 잠재적인 항멜라닌 생성 활성 성분은 분자 도킹에 의해 일시적으로 확인되었습니다.

결과:B. striata 섬유 뿌리(EFB)의 95% 에탄올 추출물은 IC{1}}.94 mg/L, 11.69 mg/L, 6.92 mmol FeSO4/g, 및 각각 58.92 mg/L. 또한 EFB와 B. striata tuber(ETB)의 95% 에탄올 추출물은 용량 의존적으로 제브라피쉬 배아의 멜라닌 합성을 유의하게 감소시켰다. 24개의 스틸베노이드를 포함한 39개의 화학 성분이 EFB 및 ETB에서 잠정적으로 확인되었습니다. 분자 도킹은 83개(60개의 스틸베노이드 포함) 및 85개(70개의 스틸베노이드 포함) 화합물이 티로시나제 및 아데닐산 사이클라제에 대해 더 강한 결합 친화성을 나타내는 것으로 나타났습니다.

결론:본 연구 결과는 제약 및 화장품 산업에서 천연 피부 미백제로 EFB 및 ETB를 사용하는 근거를 뒷받침합니다.

키워드: Bletilla striata, 항산화, 항멜라닌 활성, UPLC-Q-TOF-MS/MS, Zebrafish, Molecular docking

항산화제 부작용 및 이점을 확인하려면 클릭하세요.

배경

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. 에프. 중국, 한국, 일본 등 아시아에 널리 분포하는 다년생 초본이다[1]. 백지라고도 알려진 B. striata의 말린 괴경은 Shennong의 Classic of Materia Medica에 처음 기록되어 있으며 중국에서 수천 년 동안 중국 전통 의학(TCM)으로 널리 사용되었습니다. 중국 약전에는 지혈 및 진통에 수렴작용이 있다고 기재되어 있어 토혈, 객혈, 외상성 출혈, 궤양, 종창 및 갈라진 피부의 치료에 널리 사용되었다[2, 3]. 약리학적 연구에 따르면 B. striata는 상처 치유[4, 5], 항궤양[6, 7], 지혈[8],안티-염증[9], 항산화제[10], 항균 [11], 항인플루엔자 바이러스 [12] 및 노화 방지 [13]. 동시에 B. striata는 다음을 포함한 다양한 종류의 화학 성분을 포함합니다.다당류[14], 비벤질, 페난트렌, 안트라퀴논,플라보노이드및 2-이소부틸말레이트[3, 15] 등

B. striata는 한의학[16]에서 많은 피부 미백의 고전적인 공식의 주약이며 최근에는 화장품 산업에서 널리 사용됩니다[17]. 그러나 그 유효성분은 아직 불분명하고 일부 연구 결과도 이와는 반대되는 것으로 나타났다. 예를 들어, Chenet al. B. striata의 95% 에탄올 추출물이 in vitro에서 68.36%의 억제율로 물 추출물보다 더 높은 tyrosinase 억제 활성을 가지고 있음을 나타냈으며[18] Huang et al. Tyrosinase에 대한 B. striata 물 추출물의 억제 활성은 in vitro에서 62%의 억제율을 나타내는 95% 에탄올 추출물의 억제 활성보다 더 강력함을 보여주었다[19]. Luetal.[20]과 Linghuetal.[21]의 연구 결과에 따르면 B. striata의 물과 95% 에탄올 추출물, 특히 클로로포름 분획은 B16 세포 성장을 억제하고 농도 의존적 ​​방식으로 세포 사멸을 유도할 수 있습니다.

tyrosinase 억제 및 흑색종 세포주에 대한 시험관내 시험은 복잡한 생체내 조건 및 시험 시료의 흡수, 대사, 분포 및 배설을 포함하지 않기 때문에 많은 시료가 tyrosinase 및 흑색종 세포주에 대해 유의한 억제 활성을 나타냈다. 그럼에도 불구하고 시험관 내에서는 약하게 효과적이거나 심지어 비효과적인 것으로 나타났습니다[22,23]. glabridin은 kojic acid보다 176배 강한 IC{2}}.43μmol/L로 유의한 tyrosinase 저해 활성을 보였다. 그럼에도 불구하고 생체 내에서 zebrafish의 착색에 대한 억제 효과가 없었습니다[24].

한편, B. striatatuber(TB)의 가공 과정에서 생성된 부산물은 B. striata fibrous root(FB)였다. 현대 연구에 따르면 FB에는 TB와 유사한 화합물이 포함되어 있으며 페놀 함량이 더 높습니다[25]. 또한, FB 추출물의 항균[26], 항산화 및 항-티로시나아제 활성이 결핵 추출물[25]보다 더 강력하였다. 그러나 FB의 자원이 효율적으로 사용되지 않고 농지에 버려져 FB 자원의 낭비와 환경오염을 초래하였다[27].

작은 열대 민물고기인 Zebrafish(Danio rerio)는 새로운 약리학 동물 모델입니다.

및 생체 내 독성 연구, 저비용, 짧은 수명 주기, 높은 투명도, 유지 관리 용이성, 높은 생식력, 더 적은 수의 테스트 샘플 필요 등 많은 이점이 있습니다[28, 29]. 또한, zebrafish는 표면에 멜라닌 색소가 있어 색소 침착 과정을 간단하게 관찰할 수 있어 항멜라닌 생성 연구에 널리 사용되었다[28, 30].

본 연구에서는 zebrafish 모델에서 TB와 FB의 조다당류와 95% 에탄올 추출물의 항산화 및 tyrosinase 저해 활성과 항멜라닌 생성 활성을 비교하였다. 한편, 잠재적인 항멜라닌 생성 활성 성분은 분자 도킹에 의해 일시적으로 확인되었습니다. 우리는 결핵(ETB)과 FB(EFB)의 95% 에탄올 추출물이 상당한 항산화 및 항-티로시나제 활성을 갖고 있으며 용량 의존적 방식으로 제브라피쉬 배아의 멜라닌 합성을 감소시킬 수 있음을 발견했습니다. 따라서 ETB와 EFB는 제약 및 화장품 산업에서 천연 피부 미백제로 사용할 수 있습니다.

행동 양식

화학물질 및 시약

티로시나제, 3-(3,4-디히드록시페닐)-L-알라닌(L-DOPA) 및 알부틴은 Aladdin 시약 회사(중국 상하이)에서 구입했습니다.2,{7}}디페닐{8 }}피크릴히드라질(DPPH), 2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤티아졸린{15}}술폰산)(ABTS),{16}}히드록시{17}},5,7 ,8-테트라메틸크로만{21}}카르복실산(Trolox) 및 2,4,{24}}트리스({25}}피리딜)-s-트리아진(TPTZ)은 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. (미국 미주리주 세인트루이스). 아세토니트릴 및 메탄올(HPLC 등급)은 Tedia(Fairfield, OH, USA)에서 구입했습니다. 탈이온수는 Milli-Q water system(18.2 MΩ, Millipore, USA)으로 준비하였다.

식물 채집 및 추출 절차

B. striata는 Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd.(Quzhou, Zhejiang, China)에서 수집되었습니다. 상품권 견본은 Zhejiang Pharmaceutical College의 식물 표본실(등록 번호 190615)에 기탁되었습니다. 전체 식물은 괴경과 섬유질 뿌리로 나뉘었다. 그 후, 그것들을 작은 조각으로 자르고 각각 진공 동결 건조로 건조시켰다.

건조되고 분말화된 샘플(TB 및 FB)을 95% 에탄올로 3회(각 1.5시간) 환류 추출하였다. What man 여과지(No.1)를 사용하여 추출물을 여과하였다. 여액을 회전 증발기(Hei-VAP, Heidolph, Germany)에서 50도에서 농축 건조시킨 후 진공 동결 건조기로 건조시켰다. TB(ETB) 및 FB(EFB)의 에탄올 추출 수율은 각각 5.21% 및 6.53%였습니다. 찌꺼기는 80도 물에 4시간 동안 분산시키고 에탄올로 침전시켜 조 다당류를 추출하는 데 사용되었습니다[31]. TB(PTB)와 FB(PFB)의 다당류 수율은 각각 14.75%와 6.45%였습니다.

시스탄체 추출물

화학 분석

화학 분석은 사중극자 비행 시간 탠덤 질량 분석법(UPLC-Q-TOF-MS/MS)이 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에서 수행되었습니다. 크로마토그래피 분리는 WatersBEH Shield RP C18 컬럼(100×2.1mm, 1.7μm)을 사용하여 Waters Acquity UPLC tem(Waters Corp., Milford, MA, US)에서 수행되었습니다. {43}} 학위 . 이동상은 물(A) 및 아세토니트릴(B)의 0.1% 포미산으로 구성되었으며 선형 구배: 0–3분, 5–16% B; 3-8분, 16-30% B; 8-10분, 30-35% B; 10-15분, 35-55% B; 15-18분, 55-80% B;18-19분, 80-5% B; 19-20분, 5% B. 유속은 0.3mL/min이고 주입량은 2μL입니다.

TOF-MS/MS 실험은 ESI(electrospray ionization)가 장착된 AB SCEIX Triple TOF 5600 질량분석기(AB SCIEX, Foster City, CA, USA)를 사용하여 수행되었습니다. MS 검출은 음이온화 방법으로 수행하였다. 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다. 소스 및 탈용매 온도는 각각 100도 및 450도였습니다. 탈용매 가스 유속은 900L/h이고; 모세관 전압은 2kV였습니다. 콘 전압은 40V였습니다. 충돌 에너지는 22 eV였습니다. 전체 스캔 스펙트럼은 100에서 2000Da까지였습니다.

항산화 분석 DPPH 라디칼 소거 활성

DPPH 라디칼 소거 활성은 Ali et al. 약간 수정[32]. 간단히 말해서, 50 μL 테스트 샘플 용액을 96-웰 플레이트에서 150 μLDPPH 에탄올 용액(0.2mM)과 혼합하고 30분 동안 암소에서 보관했습니다. . 517nm(A1)에서 혼합물의 흡광도를 마이크로플레이트 분광광도계(Thermo Fisher Scientific, America)로 평가했습니다. DPPH에탄올 용액과 혼합한 시험시료가 없는 바탕용액을 양성군(A0)으로 하였다. 시험시료용액과 DPPH가 혼합되지 않은 바탕용액을 바탕그룹(A2)으로 하였다. 모든 실험은 삼중으로 실행되었습니다. DPPH 라디칼 소거율은 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.

DPPH 라디칼 소거율(%) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100% .

ABTS 라디칼 소거 활동

ABTS 라디칼 소거능은 Ali et al. [32]. 요약하면, 7mMABST 수용액을 2.45mM 과황산칼륨과 1:1(v/v)의 비율로 혼합하고 실온에서 암실에서 16시간 동안 인큐베이션하여 ABST 플러스 스톡 용액을 얻었다. 스톡 용액을 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석하여 734nm에서 흡광도(0.72±0.2)를 조정했습니다. 다른 농도의 20μL 테스트 샘플을 180μL ABTS 플러스 용액과 완전히 혼합했습니다. 반응성 혼합물을 5분 동안 암실에 보관한 후 734nm에서 흡광도(B1)를 측정했습니다. 시험 시료와 ABST plus를 첨가하지 않은 혼합물의 흡광도를 각각 B와 B로 설정하였다. 모든 실험은 삼중으로 실행되었습니다. ABTS 라디칼 소거율은 다음 공식에 따라 계산되었습니다.

ABTS 라디칼 소거율(퍼센트) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100% .

제2철 환원 항산화력 분석(FRAP)

제2철 환원 활성은 Kosakowska et al.의 절차에 따라 결정되었습니다. [33]. 300mM 아세테이트 완충액, 10mM TPTZ(2,4,{5}}트리스(2-피리딜)-s-트리아진) 및 20mM FeCl3를 (v/v/v)에서 혼합했습니다. 10:1:1의 비율로 작업 시약을 준비했습니다. 각 테스트 샘플 용액 100μL를 100μL TPTZ 작업 시약과 혼합하고 37도에서 20분 동안 인큐베이션하고 593nm에서 흡광도를 측정했습니다. 한편, 0–1000ug/mL 농도 범위의 일련의 FeSO4 표준 용액을 사용하여 검량선을 작성했습니다. 철 환원 능력은 강한 Fe2 + -TPTZ 청색 착물의 형성에서 계산되었습니다. 결과는 Fe2 + 항산화 능력(mmol FeSO4/g of extract)으로 표현되었습니다.

티로시나제 억제 활성

티로시나제 억제 활성은 기질로 L-DOPA를 사용하여 분광광도법으로 측정했습니다[34]. 간단히 말해서, 다양한 농도의 50μL 샘플 용액을 96-웰에서 50μL 티로시나제(200단위/mL, 용해된 pH 6.8 인산염 완충액)와 혼합했습니다. 플레이트에 넣고 25도에서 15분간 배양합니다. 그런 다음 L-DOPA(50μL)를 첨가하여 반응을 시작했습니다. 25도에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 멀티스칸 스카이 마이크로플레이트 분광광도계(ThermoFisher Scientific, America)를 사용하여 490 nm에서의 흡광도(Aa)를 측정했습니다. 유사하게, 티로시나아제가 없는 샘플 웰(Ab)과 효소는 있지만 샘플이 없는 대조군 웰(Ab)의 흡광도가 동시에 검출되었다. 티로시나아제 억제 활성은 다음 식에 의해 계산하였다:

티로시나제 억제율(퍼센트)=[1− (Aa - Ab)/Ac] × 100% .

IC50은 다음과 같이 GraphPad Prism 방정식을 사용하여 계산되었습니다.

Y=min plus (max − min)/1 plus 10(x−logIC50)×Hill 기울기

X는 억제제 농도를 나타내고; Y는 최소(최소) 및 최대(최대) 값과 함께 억제 데이터(백분율)를 나타냅니다. 언덕 경사는 슬로프 팩터입니다.

Cistanche는 tyrosinase 활성을 억제합니다.

제브라피쉬의 멜라닌 억제

야생형 AB 계통 제브라피쉬(Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, Zhejiang Province 제공)는 어류(0.2% 탈이온수, pH 6.9–7.2, 전도도 48{ {18}}-510 mS/cm, 경도 53.7-71.6mg/L CaCO3) 28±0.5도의 일정한 온도에서 14/10h 명암 광주기에서 매일 2회 살아있는 브라인 슈림프를 먹였습니다. zebrafishembryos는 자연 산란에서 얻었고 30분 이내에 수집되었습니다. zebrafish 분석은 AAALAC(실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회)의 인증을 받았습니다. 본 연구는 Hunter Biotechnology, Inc.의 IACUC(Institutional Animal Careand Use Committee)의 승인을 받았으며 IACUC 승인 번호는 001458입니다.

수정 후 6시간(hpf) 단계의 배아를 72시간 동안 6가지 농도(1{19}}, 30, 62.5,125, 250 및 500mg/L)로 처리하여 최대 비치사 농도(MNLC)를 평가했습니다. ). 그 결과, 모든 추출물의 MNLC는 62.50mg/L 이상이었습니다. 10개의 배아를 6-웰에 넣고 6 hpf에서 54 hpf(48시간 노출 ). DMSO(0.05%, v/v) 및 arbutin(10 및 30mg/L)은 각각 정상 및 양성 대조군으로 사용되었습니다.

동기화된 배아를 디지털 카메라(VertA1, 중국)가 장착된 실체현미경(SZX7, Olympus, Japan)으로 수집하고 관찰하였다. 제브라피쉬 색소 침착 영역과 직접적인 상관관계가 있는 멜라닌 축적은 GNUImage Manipulation Program(GIMP 버전 2.10.2)을 사용하여 계산되었으며 음성 대조군(멜라닌 축적 100%)에 대한 백분율로 표현되었습니다[28, 30].

분자 도킹 연구

문헌[2]에서 B. striata에서 분리된 158개의 화합물, 19개의 배당체, 28개의 비벤질, 19개의 페난-트렌, 18개의 비페난트렌, 23개의 디히드로페난트렌, 5개의 안토시아닌, 11개의 스테로이드, 8개의 트리테르페노이드, 퀴논산, 5-페난트렌 및 10개의 다른 화합물을 리간드로 사용하였다. 3D 구조는 ChemBio3D로 그려졌으며 MM2 및 Autodock 도구를 사용하여 최적화되었습니다. 티로시나제(PDBID:5M8N) 및 아데닐산 사이클라제(PDB ID:5IV3)의 3D 결정 구조는 RCSB Protein Data Bank(www.rcsb.org/pdb/home/home.do)에서 검색했습니다. 모든 물 분자와 헤테로 원자는 키메라와 MGL 도구를 사용하여 결정 구조에서 제거되었습니다. 마지막으로 오토독

Vina는 수용체 단백질을 소분자 리간드와 도킹하는 데 사용되었습니다. 수용체 단백질 도킹 부위의 매개변수는 원래의 리간드 mimosine과 LRE1에 따라 각각 -36.700, 7.034, -19.104, -17.467, -22.807, 2.786으로 설정되었다[35]. 더 높은 계산 정확도를 달성하기 위해 각 수용체에 대해 20개의 철저 매개변수를 생성하고 가장 친화도가 높은 구조를 최종 도킹 구조로 선택하고 Pymol2.3에서 시각화했습니다. 한편, 원래 리간드인 mimosine과 LRE1은 양성 대조군으로 사용되었습니다[36].

인실리코 ADMET 예측

B. striata의 상위 3개 히트는 tyrosinase 및 adenylate cyclase와 더 나은 결합 친화성을 가지며 ADMET 분석을 받았습니다. Schrodingersuite의 QikProp을 사용하여 분자량(MW), 예측된 옥탄올/물 분배 계수(QPlogPo/w), 예측된 수용해도(QPlogS), 예측된 겉보기 Caco-2 세포를 포함한 물리적 특성 및 약물 관련 특성을 계산했습니다. 장-혈액 장벽에 대한 투과성(QPPCaco), 예측된 뇌/혈액 분배 계수(QPlogBB), 예측된 피부 투과성(QPlogKp), HERGK 플러스 채널 차단에 대한 예측된 IC50(QPlog HERG) 및 예측된 인간 경구 흡수. 속성은 Lipin-ski의 5법칙과 문헌[37, 38]에 따라 평가되었습니다.

분자 역학 시뮬레이션

시뮬레이션된 생물학적 환경에서 리간드-단백질 복합체의 안정성과 동적 변동을 조사하고 도킹 결과를 추가로 검증하기 위해 화합물 blestrin D(75)를 분자 역학(MD) 시뮬레이션 연구의 리간드로 선택했습니다. 분자 도킹 결과. blestrin D와 티로시나아제 및 아데닐산 사이클라아제의 복합체는 TIP3P 물 모드를 사용하여 MD 시뮬레이션을 수행하고 100ns 동안 실행했습니다. 시뮬레이션 기간 동안 단백질 안정성을 조사하기 위해 초기 구조에 대한 단백질 백본 원자의 RMSD(Root Mean Square Deviation) 값을 계산했습니다[39].

결과

화학적 구성 요소

ETB 및 EFB의 일반적인 기본 피크 크로마토그램 크로마토그램은 그림 1에 나와 있습니다. PeakView 소프트웨어를 사용하여 구성 요소를 식별했습니다. 분자식은 10ppm의 질량 오차 내에서 정확하게 할당되었습니다. 정확한 분자량과 단편은 ChemSpider 및 Massbank와 같은 문헌 및 무료 화학 구조 데이터베이스에 따라 구성 요소를 식별하는 데 사용되었습니다. 그 결과 EFB와 ETB에서 24개의 스틸베노이드(비벤질, 페난트렌 및 그 유도체), 6개의 배당체, 4개의 페놀산, 3개의 퀴논, 1개의 스테로이드 및 1개의 기타 화합물을 포함한 39개의 화학 조성이 잠정적으로 확인되었습니다. 동시에 추출된 이온 크로마토그램[40]을 이용하여 MS 모드에서 각 화합물의 피크 면적을 측정하여 상대적인 반정량화를 수행했습니다. 농도)를 표 1에 요약하였다.

항산화 능력

자외선 A(UVA) 조사가 활성 산소종(ROS) 생성을 유도하고 피부 세포의 과도한 멜라닌 생성을 매개할 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다. , 42]. 따라서 본 연구에서는 DPPH, ABTS 라디칼 소거 활성 및 FRAPassay를 통해 항산화능을 평가하였다. 결과(표 2 및 그림 2)는 EFB(IC{6}}.94mg/L)가 PTB(IC50=548.24 mg/L)에 비해 시험관 내에서 가장 강력한 DPPH 라디칼 소거 활성을 보유함을 보여주었습니다. , PFB(IC{10}}.81mg/L) 및 ETB(IC{12}}.25mg/L). ABTS 및 FRAP 분석에서도 유사한 경향이 관찰되었습니다. TB와 PB의 95% 에탄올 추출물은 조다당류보다 시험관 내에서 더 강한 항산화 활성을 보였습니다. 또한 EFB는 ETB보다 항산화 활성이 더 강하여 선행 연구 결과와 일치하였다[25].

티로시나제 억제 활성

Tyrosinase는 멜라닌 생합성 경로의 주요 속도 제한 효소였으며 항 멜라닌 생성 효과가 있는 천연물의 잠재력을 확인하는 데 널리 사용되었습니다[43]. 그 결과(Fig. 3) ETB와 EPB가 in vitro에서 PTB와 PPB보다 tyrosinase 저해 활성이 더 강하여 이전 연구 결과와 일치하였다[25]. EFB는 ETB(IC{9}}.44mg/L) 및 양성 화합물 arbutin(IC{ {11}}.02mg/L).

제브라피쉬의 멜라닌 억제

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), 차량 0.05% DMSO가 제브라피쉬 배아의 멜라닌 생성에 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다. 그러나 48시간 동안 테스트된 샘플과 알부틴에 노출된 후 제브라피쉬 배아는 PFB 10 mg/L 그룹을 제외하고 다양한 정도의 멜라닌 침착을 나타냈습니다(그림 3B,4). ETB 10mg/L(78.38%) 및 30mg/L(64.72%) 그룹의 상대적 멜라닌 함량이 PTB 10mg/L(93.06%) 및 30mg/L(82.02%) 그룹보다 유의하게 낮았다(p).<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

분자 도킹

티로시나제는 멜라닌 생합성의 속도 제한 효소입니다. 티로신이 3,{2}}디히드록시-페닐알라닌(DOPA)으로 수산화되고 DOPA 토도파퀴논이 산화됩니다. 따라서 tyrosinase는 멜라닌 생성 억제제 개발의 중요한 표적으로 여겨져 왔다[44]. 또한, adenylatecyclase는 cAMP-유도 멜라닌 생성의 핵심 효소입니다. MC1R 수용체에 대한 멜라노트로핀 알파 폴리펩타이드(-MSH)의 결합은 아데닐레이트 사이클라제의 활성화, cAMP 수준의 증가, 티로시나제 유전자의 상향 조절된 발현을 유도하고, 후속적으로 멜라닌 합성을 증가시킨다[45]. 따라서 우리는 이전에 B. striata에서 분리된 158개 화합물[2], withtyrosinase 및 adenylate cyclase에 대한 분자 도킹 연구를 수행했습니다. 연구된 리간드의 티로시나제 및 아데닐레이트사이클라제의 결합 에너지는 표 S1에 요약되어 있습니다. 원래 리간드인 mimosine(- 6.4 kcal/mol) 및 LRE1(- 8.5 kcal)에 비해 83(60 stilbenoids 포함) 및 85(70 stilbenoids 포함) 화합물이 tyrosinase 및 adenylate cyclase에 대해 더 강한 결합 친화성을 나타냅니다. /몰). 1,8-비스(p-히드록시벤질)-4-메톡시페난트렌-2,{27}}디올(56), 블레스트린 D(75), 2,{31}}디히드록시 -1,6-비스(p-하이드록시벤질)-4-메톡시{37}},{38}}디하이드로페난트렌(93)은 결합 에너지가 있는 티로시나제에 대한 상위 3리간드였습니다. -10.2, 10.0, 9.7kcal/mol. 블레스트린 D(75), 블레스트린 B(73) 및 3,3'-디하이드록시-5-메톡시-2,5',6-트리스(p-하이드록시벤질) 비벤질(42) 각각 -12.1, -11.9 및 -11.6 kcal/mol의 결합 에너지를 갖는 아데닐산 사이클라제에 대한 상위 3개의 리간드였습니다. 이들의 이론적 결합 친화도 및 리간드-아미노산 상호작용은 표 3에 요약되어 있습니다.

Biphenanthrene 화합물인 blestrin D(75)가 tyrosinase와 adenylate cyclase의 결합포켓으로 들어가고(Fig. 5), tyrosinase와 adenylate cyclase 모두에 대해 유의한 결합 친화력을 보였다는 점은 주목할 만하다. Van der Walls 상호작용은 전체 에너지 상호작용 값에 기여하는 반면, 히드록실기는 각각 아미노산 잔기 Glu 451, 티로시나아제의 Arg114 및 아데닐산 사이클라아제의 Val 167과 수소 결합을 생성합니다(표 3 및 그림 S1). 화합물 93도 상당한 결합 친화력을 나타냈습니다. 아미노산 잔기 Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 및 Gln236과 함께 6개의 수소결합 형성을 통해 티로시나제 쪽으로.

인실리코 ADMET 예측

허용 가능한 범위와 함께 몇 가지 중요한 매개변수의 예측 값이 표 4에 요약되어 있습니다. 3,3',{3}}트리메톡시비벤질, 블레스트린 B 및 블레스트린 D의 QPlogS와 3,3'의 QPlogBB{{6} }trimethoxybibenzyl, 상위 3개 히트의 다른 모든 계산된 ADMET 속성은 예상 범위 내에 있는 반면, 상위 3개 히트의 QPlog HERG는 -5 미만이었고, 이는 인간이 사용할 수 있는 약물 가능성을 나타냅니다. 3,3',{10}트리메톡시비벤질을 제외하고 티로시나제와 아데닐레이트사이클라제 모두에 대한 상위 3개 히트의 QPlog Kp는 유리한 범위에 있었으며, 이는 이러한 화합물이 피부에 쉽게 침투할 수 있음을 나타냅니다.

분자 동적 시뮬레이션

RMSD 플롯은 단백질-리간드 복합체의 RMSD 값이 전체 시뮬레이션 기간 동안 크게 변동하지 않음을 보여주었습니다. tyrosinase 및 ade-nylate cyclase 복합체를 포함하는 blestrin D의 RMSD 값(그림 6A)은 각각 1.5~2.8Å 및 2.{8}}~3.6Å 범위에서 결정되었습니다. 시뮬레이션 중 각 잔류물의 유연성을 반영하는 RMSF 값. 더 높은 RMSF 값을 가진 잔류물은 더 유연함을 나타냈습니다(그림 6B). 루프 영역의 아미노산 잔기의 RMSF 값은 크게 변동하는 것으로 나타났습니다. 활성 부위 잔류물은 티로시나아제의 Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 및 Arg230과 같은 작은 RMSF 값(1.{13}}Å)을 유지하고 Val167, Leu102, Phe45, Lys95 및 Leu166의 adenylate 바인딩 포켓이 안정적으로 유지되었음을 나타냅니다. tyrosinase 및 adenylate cyclase와 blestrin D의 분자적 상호작용을 Fig. 7에 나타내었다.

결합 자유 에너지는 분자 역학 일반화 출생 표면적(MM-GBSA) 방법에 의해 계산되었습니다[39]. tyrosinase 및 adenylatecyclase와 blestrin D의 예상 결합 자유 에너지는 각각 -96.94kcal/mol 및 -139.69kcal/mol로 결합 상호 작용이 자발적임을 암시합니다(표 5). 더욱이, 리간드 결합을 선호하는 기여는 비극성 용매화 상호작용, 반 데르 발스 및 정전기 상호작용이었다.

EFB에 함유된 화학성분의 종류와 함량이 ETB보다 많았다는 점은 주목할 만하다. EFB에서 확인된 모든 화합물의 피크 면적은 ETB의 피크 면적의 약 2배였습니다. Mili-tarine은 EFB와 ETB에서 가장 풍부한 화합물로 항산화, 항염 및 신경 보호 활성이 매우 우수하며 중국 약전 2020 판에서 B. striata의 품질 관리를 위한 화학적 마커로 선택되었습니다[46]. militarine의 상대 피크 면적은 EFB(38.39×106)에서 ETB(30.48×106)보다 약간 높았다. Gastrodin은 Gastrodia elata와 같은 많은 한약에서 잘 알려진 화합물로, 상당한 티로시나아제 억제 및 라디칼 소거 효과를 나타냅니다[30]. EFB(1.43×106)에서 가스트로딘의 상대 피크 면적은 inETB(2.17×106)보다 약간 낮았다.

TB와 PB의 95% 에탄올 추출물은 조 다당류보다 시험관 내에서 더 강한 항산화 활성을 보였습니다. 또한, EFB는 ETB보다 더 강한 항산화 활성을 나타내어 이전 연구 결과와 일치하였다[25]. 이 현상은 EFB에 밀리타린 및 스틸베노이드(천연식물 폴리페놀)와 같은 항산화 화합물이 더 많이 함유되어 있기 때문일 수 있습니다. 예를 들어, 4개의 페놀성 수산기를 갖는 비페난트렌인 4,8,4',8'-테트라메톡시-[1,1'-비페난트렌]{12}},7,2',7'-테트롤의 상대 피크 면적은, FB에서 9.15×1{20}}6인 반면 0.01×106 inTB였습니다.

본 연구에서 PPB와 PTB는 용량 의존적으로 약간의 tyrosinase 억제 활성을 나타내었지만, PB(PPB 함유)의 수성 추출물에서는 활성이 검출되지 않는 것으로 나타났다[25]. 이 현상은 샘플 준비가 다르기 때문일 수 있습니다. Jiang의 실험[25]에서는 PB의 수성 추출물을 사용하여 티로시나아제 억제 활성을 평가한 반면, 본 연구에서는 수성 추출물을 에탄올로 침전시켜 조다당류를 얻었다.

최근 zebrafish 모델은 in vivo에서 멜라닌 생성 억제 효과를 평가하는 데 널리 사용됩니다[47, 48]. 기존 화장품 산업에서 상업적으로 이용되고 있는 하이드로퀴논 글루코사이드 화합물인 Arbu-tin을 양성대조군으로 설정하였다. ETB와 EFB의 멜라닌 생성 억제 활성은 알부틴보다 강력하여 ETB와 EFB가 화장품 산업에서 피부 미백제로 적용될 수 있음을 나타냅니다.

EFB(1.91 × 106)에서 블레스트린 D의 상대 피크 면적은 ETB(0.46 × 10 )의 약 4배입니다. EFB에서 화합물 56(8.73 × 1{17}}6) 및 93(0.64 × 106)의 상대 피크 면적도 ETB(0.01 × 106 및 0.10 × 106 미만)보다 상당히 높습니다. 이것은 EFB가 ETB보다 더 강력한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 이유 중 하나일 수 있습니다. 티로시나제 및 아데닐산 사이클라제에 대한 상위 3개 리간드가 모두 스틸베노이드(비벤질, 페난트렌 및 그 유도체)에 속한다는 점에 주목하는 것이 흥미롭습니다. 스틸베노이드는 천연 식물 폴리페놀, 항염증, 항균 및 항산화 활성과 같은 놀라운 생체 활성으로 인해 지난 몇 년 동안 큰 관심을 끌었습니다. [49] 레스베라트롤은 가장 흔한 스틸베노이드입니다. 이전 연구는 레스베라트롤과 그 유도체가 티로시나제의 촉매 활성, 유전자 발현 및 번역 후 변형을 상당히 억제할 수 있음을 나타냈습니다. 따라서, 그들은 화장품에서 피부 미백 및 노화 방지제로 잠재적으로 유용함을 보여주었다[41, 50].

Cistanche는 화장품에서 피부 미백 및 노화 방지제로 잠재적으로 유용함을 보여주었습니다.

자세한 내용은 그림을 클릭하십시오.

결론

이 연구에서는 B. striatatuber (PTB) 및 fibrous root (FPB) 및 B. striata tuber (ETB) 및 fibrous root (EFB)의 95% 에탄올 추출물의 조다당류의 항산화 및 항 멜라닌 생성 활성을 체계적으로 조사했습니다. . 그 결과 EFB가 가장 강력한 DPPH, ABTS 라디칼 소거 활성 및 제2철 환원 활성을 갖는 것으로 나타났다. 또한, ETB 및 EFB는 시험관 내에서 티로시나제 활성 및 제브라피쉬 배아의 멜라닌 합성을 용량 의존적 방식으로 상당히 감소시킬 수 있습니다. 분자 도킹은 대부분 stilbenoids에 속하는 많은 수의 화합물이 있음을 나타내며 원래 리간드의 결합 친화력과 비교하여 tyrosinase andadenylate cyclase에 대한 더 강한 결합 친화성을 나타냅니다. 본 연구 결과는 제약 및 화장품 산업에서 ETB와 EFB를 천연 피부 미백제로 사용하는 이론적 근거를 뒷받침합니다.