시험관 내 및 실리코에서 Tyrosinase 억제제에 대한 통찰력
Mar 28, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
정희진 a,b,c, 노상균 a,b,c, 박유진 a, 강동완 a, 춘부순 d, 정해영 a,b,c,⇑,문형룡 a
추상적인
티로시나아제는 멜라닌 생합성을 담당하는 핵심 효소로 자외선에 의한 피부 손상을 보호하는 데 효과적입니다. 강력한 티로시나제 억제제를 발견하기 위한 지속적인 노력의 일환으로 우리는 13개의 (E)-벤질리덴{1}}인다논 유도체(BID1–13)를 체계적으로 설계 및 합성하고 티로시나제에 대한 억제 활성을 결정했습니다. 평가된 화합물 중에서 BID3은 버섯 티로시나제의 가장 강력한 억제제였습니다(IC50=0.034mM, mycophenolate 활성; IC50=1.39mM, diphenols 활성). 동역학 연구에 따르면 BID3는 L-DOPA를 기질로 사용하여 Ki 값이 2.4mM인 혼합 유형의 티로시나제 억제를 입증했습니다. 인실리코 분자 도킹 시뮬레이션은 BID3이 티로시나제의 촉매 및 알로스테릭 부위에 결합하여 효소 활성을 억제할 수 있음을 입증했으며, 이는 BID3와 티로시나제 간의 시험관내 실험 연구를 확인시켜주었습니다. 또한, BID3 처리 후 멜라닌 함량이 감소하고 세포성 티로시나아제 활성이 억제되었다. 이러한 관찰은 BID3가 강력한 티로시나제 억제제이며 잠재적으로 색소 침착 관련 장애의 치료를 위한 미백제로 사용될 수 있음을 보여주었습니다.
1. 소개
멜라닌은 표피의 혈관층에 있는 멜라닌 세포에 의해 합성되는 것으로 일반적으로 자유 라디칼을 소거하거나 들어오는 자외선을 분산시켜 유해한 자외선으로 인한 손상으로부터 포유류 피부를 보호하는 것으로 일반적으로 알려진 색소 계열을 말합니다[1]. 그러나 풍부한 멜라닌칸 생성은 표피의 눈에 띄는 과색소침착을 유발하며, 이는 기미, 주근깨, 검버섯 또는 노인성 흑점으로 명백할 수 있습니다[2].
구리 함유 금속효소인 티로시나제(EC 1.14.18.1)는 멜라닌 생성 과정에 관여하는 핵심 효소입니다. Tyrosinase는 멜라닌 생성의 두 가지 속도 제한 단계를 촉매합니다. 티로신의 하이드록실화(크레졸라제 또는 마이코페놀레이트 활성)를 통해 3,{7}}디하이드록시페닐알라닌(L-DOPA)을 생성하고 L-DOPA(카테콜라제 또는 디페놀 활성)를 상응하는 DOPA-퀴논으로 산화시킵니다. L-tyrosine이 기질일 때 tyrosinase 촉매 반응의 산물은 DOPA-quinone이며 이는 멜라닌으로 전환됩니다[3]. 이러한 단계는 UV 손상으로부터 피부를 보호하는 데 중요합니다. 버섯 아가리쿠스는 멜라닌 생성에 대한 연구 모델로 적합하도록 하는 포유류 티로시나제 효소와 상업적으로 이용 가능하고 높은 상동성에 사용됩니다[4]. 인간의 경우 멜라닌은 UV로 인한 손상으로부터 피부를 보호하는 데 도움이 됩니다[5]. 그러나 멜라닌칸의 과잉 수치는 과색소침착, 기미, 주근깨, 검버섯 등 다양한 피부질환을 유발한다[6]. 따라서 과도한 피부 색소침착을 억제하기 위해서는 약물과 유사한 피부 미백 특성을 나타내는 뉴티로시나제 억제제가 필요하다.
1-벤조일-사이클로펜타논 골격을 가진 인다논은 다양한 식용 식물 공급원에 존재하는 자연 발생 구성요소인 고리형 5원 고리를 형성하는 불포화 케톤 시스템을 포함하는 칼콘의 단단한 사촌으로 간주됩니다. [7 ]. 여러 연구에 따르면 1-인다논 부분이 있는 화합물은 항염증[8-10], 항암[11,12], 항산화[13], 항파킨슨병과 같은 다양한 유익한 생물학적 활성을 나타내기 때문에 약리학적 중요성이 있습니다. 질병[14], 항알츠하이머병[15-17], 항균[18], 항면역 억제[19] 및 항-티로시나제[20] 특성.
칼콘(1,{1}}디아릴{2}}적절한{3}})은 방향족 케톤으로 3개의 탄소 α,b-불포화 카르보닐 시스템에 연결된 2개의 방향족 고리로 구성된 중심 코어입니다[21, 22]. 이들은 다양한 식용 천연 식물에서 발견되는 자연 발생 성분으로 pyrazolines, pyrimidine, flavanol, flavones, flavanones, isoflavones, aurones, anthocyanidin, dihydroflavanol, dihydrochalcone과 같은 flavonoids 및 isoflavonoids 합성 경로의 전구체 화합물로 간주됩니다. a,b 불포화 카르보닐 시스템은 생물학적 활성 유형에 가장 중요합니다. 이러한 시스템은 인다논뿐만 아니라 칼콘과 같은 많은 천연 제품에 분포되어 있기 때문에 분자가 상대적으로 더 평면이고 아릴 치환기의 전자 효과 전달이 직접적으로 전달되기 때문입니다. 카보닐 그룹 [7]. 이전에 많은 연구자들이 chalcone이 여러 간행물[26-29]에서 새로운 종류의 tyrosinase inhibitor로 강조되었다고 보고했습니다. 최근 Kim과 동료[30,31]는 일련의 chalcone 유도체를 설계 및 합성하여 시험관내 항바이러스 효과를 평가했습니다. 쥐의 멜라닌 세포에 대한 티로시나제 및 항멜라닌 생성 활성.
이전에 보고된 데이터에 따르면 (E)-b-페닐-a,b-불포화 카보닐 골격을 가진 유도체는 potenttyrosinase 억제를 보였다[32-34]. (E)-벤질리덴-1-인다논은 화합물이 화학 구조에 (E)-b-페닐-a,b-불포화 카르보닐 골격을 갖고 있기 때문에 매력적인 항멜라닌 생성제가 될 수 있습니다. 특히, Radhakrishnan et al. (2015) [20](2015) [20](Z) 구성을 갖는 일련의 벤질리덴 인다논 유도체를 설계 및 합성하고 항티로시나제 활성에 대해 평가했습니다. 이러한 (Z)-벤질리덴{19}}인다논 유도체가 (E)-벤질리덴{23}}인다논 유도체의 항티로시나제 및 항멜라닌 생성 활성에 대해 조사되었지만 아직 자세히 조사되지 않았습니다.
따라서 우리는 (E)형 벤질리덴을 포함하는 1-인다논 골격의 13개 화합물(BID1-13)을 설계하고 합성했습니다. 이러한 합성 화합물 중에서 1-indanone의 B 고리에 있는 2,{5}}dihydroxygroup은 가장 큰 tyrosinase억제를 나타냈습니다(kojic acid, 양성 대조군보다 약 400-배 더 효과적임). 또한, 우리는 B16F10 흑색종 세포를 사용하여 멜라닌 합성에서 조절 역할을 특성화할 뿐만 아니라 BID3 티로시나제 억제 활성을 추가로 평가합니다. 확장된 실험에서 우리는 BID3의 항멜라닌 생성 가능성을 평가하고 효소 동역학 및 분자 도킹 연구를 확인하려고 했습니다. 연속적인 실험에서, a-MSH 및 IBMX로 유도된 B16F10 흑색종 세포에서 BID3 세포 티로시나제 잠재력과 멜라닌 생성도 조사되었습니다.
항산화 및 피부 진정: CISTANCHE EXTRACT
2. 재료 및 방법
2.1. 시약
버섯 티로시나제(EC 1.14.18.1), 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬(a-MSH), 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX), L-티로신, L{10}},{{ 11}}디하이드록시페닐알라닌(L-DOPA), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 코직산, 프탈산 및 트랜스-신남산은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. Dulbecco'smodified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin, amphotericin은 WELGENE Inc.(한국 경산시)에서 구입하였다. 다른 모든 시약은 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다.
2.2. 화학
2.2.1. 일반적인 방법
모든 시약은 상업적으로 입수하여 추가 정제 없이 사용했습니다. 박막 크로마토그래피(TLC) 및 컬럼 크로마토그래피는 각각 Merck 사전 코팅된 60F245 플레이트 및 MP Silica 40–63, 60 Å에서 수행되었습니다. 고분해능(HR) 질량 분석 데이터는 ESI 포지티브 모드에서 Agilent AccurateMass quadruple-time of flight(Q-TOF) 액체 크로마토그래피(LC) 질량 분석기(Agilent, Santa Clara, CA, USA)에서 얻었습니다. 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼은 1H NMR(400 및 500MHz) 및 13C NMR(100MHz)에 대해 각각 Varian Unity INOVA 400 분광계 또는 Varian UnityAS500 분광계(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에서 기록되었습니다. . DMSO d6, CD3OD 및 CDCl3는 NMR 샘플에 대한 NMR 용매로 사용되었습니다. 커플링 상수(J) 및 화학적 이동 값은 각각 헤르츠(Hz) 및 백만분율(ppm)로 측정되었습니다. 1H NMR 데이터 분석에 사용된 약어는 다음과 같습니다. s(singlet), bs(broad singlet), d(doublet), dd(doublet), t(triplet), TD(triplet of doublet), q( 사중주), 그리고 m(다중).
2.2.2. BID1-13 합성 절차
HCl 아세트산(0.4mL) 중 1M 중 벤즈알데히드(1.1–1.2 당량) 및 1-인다논(100 mg, 0.76 mmol)의 용액을 실온에서 교반했습니다. 4-48시간 동안. 물을 가한 후 침전물을 여과하고 남아있는 벤즈알데히드의 성질에 따라 물과 헥산:에틸아세테이트(1:1), 헥산:디클로로메탄(4:1-1:1) 또는 디클로로메탄과 메탄올의 혼합물로 세척하였다. (E)-벤질리덴{20}}인다논(BID1–13)을 32.8–99.1%의 수율로 제공합니다. 합성 화합물의 구조적 특성화(1H 및 13C NMR 및 모든 BID의 질량 데이터)는 보충 정보에 제공됩니다.
2.2.2.1. (E)-2-(4-히드록시벤질리덴)-2,3-디히드로-1H-인덴{10}}원(BID1).
노란색 고체; 수율, 93.4% ; 반응 시간, 6시간; 분자식, C16H12O2; mp, 224.7–225.9C; 1H NMR(4{44}}0MHz,DMSO d6) d 10.10(s, 1H, OH), 7.72(d, 1H, J{19}}.6Hz, 7- H), 7.64–7.58(m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7.43(s, 1H, 비닐 H), 7.39(t,1H, J{37}}.2Hz, 6-H), 6.87(d, 2H, J{43}}.0Hz, 30-H, {{46 }}H), 3.99(s, 2H,CH2); 13C NMR(100MHz, DMSO d6) d 193.9, 160.1, 150.4, 138.3,135.1, 134.0, 133.6, 132.2, 128.2, 6.1, 127.2, 124.6, 127.2, 126.ES H) 플러스 계산 237.0910, obsd 237.0911.
2.2.2.2. (E)-2-(3,4-디히드록시벤질리덴)-2,3-디히드로-1H-인덴{11}}원(BID2).
노란색 고체; 수율, {{0}}.6퍼센트 ; 반응 시간, 5시간; 분자식, C16H12O3; mp, 251.2–252.4C; 1H NMR(400 MHz,DMSO d6) d 9.65(s, 1H, OH), 9.24(s, 1H, OH), 7.72(d, 1H, J=7 .6Hz, 7-H), 7.66–7.61(m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7.42(t, 1H, J {{35 }}.2Hz, 6-H), 7.35(s, 1H, 비닐 H), 7.19(s, 1H, 20-H), 7.{89}}8(d,1H , J=8.0Hz, 60-H), 6.83(d, 1H, J{54}}.0Hz, 50-H), 3.98(s, 2H, CH2 ); 13C NMR(100MHz, DMSO d6) d 193.8, 150.4, 148.7, 146.3,138.3, 135.1, 134.5, 132.0, 128.2, 127.3, 125.4.7, 127.3, 127.1; HRMS(ESI 플러스) m/z C16H13O3(M 플러스 H) 플러스 calcd253.0859, obsd 253.0857.
2.2.2.3. (E)-2-(2,4-디하이드록시벤질리덴)-2,{8}}디하이드로-1H-인덴{11}}원(BID3).
노란색 고체; 수율, 5{{20}}.9% ; 반응 시간, 10시간; 분자식, C16H12O3; mp, 198.5–199.9 C(12월); 1H NMR(500MHz, CD3OD) d 8.17(s, 1H, 비닐계 H), 7.82(d, 1H, J{19}}.0Hz,{21}}H), 7.67–7.63(m, 3H , 4-H, 5-H, 7-H), 7.45(t, 1H, J=7.0Hz, 6-H), 6.45(d , 1H, J= 8.5Hz, 50-H), 6.39(s, 1H, 30-H), 4.01(s, 2H, CH2); 13C NMR(100 MHz, DMSO d6) d 193.9, 161.6, 160.4, 150.3,138.6, 134.8, 131.7, 130.3, 128.7, 130.3, 128.7, 128.9, 123.4.3, .0, 127.2, . HRMS(ESI 플러스) m/z C16H13O3(M 플러스 H) 플러스 calcd253.0859, obsd 253.0858.
2.2.2.4. (E)-2-(4-히드록시-3-메톡시벤질리덴)-2,3-디히드로-1힌덴{10}}원(BID4).
노란색 고체; 수율, 52.{1}} 퍼센트 ; 반응 시간, 4시간, 분자식, C17H14O3; MP, 186.9–187.4 C; 1H NMR(400 MHz, DMSO d6) d 9.71(s, 1H, OH), 7.73(d, 1H, J{19}}.6Hz, 7- H), 7.67–7.62(m, 2H, 4-H, 5-H), 7.45(d, 1H, J=2.{{50}} Hz , 20-H), 7.43(t, 1H, J=7.2 Hz, 6-H), 7.31(s, 1H, 비닐 H), 7.24(dd, 1H, J=8.0,2.0Hz, 60-H), 6.87(d, 1H, J{55}}.0Hz, 50-H), 4.05(s, 2H, CH2 ), 3.84(s, 3H, OCH3); 13C NMR(100MHz, DMSO d6) d 193.9, 150.5,149.7, 148.5, 138.3, 135.2, 134.4, 132.3, 128.2, 132.3, 128.2, 127.3, 124.7, .3, 1227.1, .3, 1227.7 HRMS(ESI + ) m/z C17H15O3(M + H) + 계산치 267.1016, obsd 267.1016.
2.3. 생물학적 평가
2.3.1. 버섯 티로시나제 억제 분석
Tyrosinase 억제 활성 분석은 이전에 설명된 것과 같이 약간의 변형을 가한 버섯 tyrosinase를 사용하여 수행되었습니다[35,36]. 간단히 말해서, 50mM 인산염 완충액(pH 6.5)에 있는 특정 농도의 각 화합물(0.0005-50mM) 10mL와 버섯 티로시나아제(1000units/mL) 20mL를 170mL 반응에 첨가했습니다. 웰 마이크로플레이트(Corning, USA)의 혼합물. 1mM L-티로신 또는 L-DOPA 용액, 50mM 인산칼륨 완충액(pH 6.5) 및 증류수의 비율은 10:10:9였습니다. 반응 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 492 nm(OD492)에서 분광광도분석을 통해 각 웰에서 생성된 도파크롬의 양을 측정하였다. 티로시나제 억제율(%)은 (1 Abssample/Abscontrol) 100%로 계산되었습니다. 시료 억제 정도는 50% 억제에 필요한 농도(IC50)로 표시하였다.
2.3.2. 티로시나제를 사용한 효소 동역학 분석
억제의 동역학 메커니즘을 결정하기 위해 Lineweaver-Burk 및 Dixonplots[37-39]의 두 가지 상보적인 동역학 방법이 사용되었습니다. Lineweaver-Burk 도표(이중 역수 도표)를 사용하여 다양한 농도의 L-DOPA(0.125, 0.25, 0.5 및 1)를 사용하여 BID3의 억제 유형을 결정했습니다. mM), 다양한 농도의 BID3(1, 2 및 4 lM)의 부재 및 존재 하에 기질로서. 다양한 농도의 L-DOPA(0.125, 0.25, 0.5 및 1 mM ). BID3의 농도는 1, 2 및 4mM이었다. 효소 절차는 이전에 설명된 티로시나제 분석 방법으로 구성되었습니다. 억제 상수(Ki)는 Dixon 플롯의 해석에서 결정되었습니다.
2.3.3. Tyrosinase 분자 도킹 시뮬레이션
효소 억제제 복합체의 구조를 결정하고 도킹 결과의 정확성, 반복성 및 신뢰성을 보장하기 위해 AutoDock4.2 소프트웨어를 사용했습니다. 디킹 연구를 위해 단백질 서열 정렬(Protein Data Bank(PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb)[40]에서 버섯 티로시나아제 단백질 표적의 결정 구조를 얻었고 자동 도킹 시뮬레이션을 수행했습니다. tyrosinase와 kojic acid,phthalic acid, cinnamic acid 또는 BID3 사이 도킹 절차: ChemOffice 프로그램(http://www.cam bridgesoft.com)을 사용하여 2D를 3D 구조로 변환, 전하 계산, 수소 원자 추가 [41 LigandScout 4.1.5는 리간드와 tyrosinase 사이의 가능한 상호작용 예측 및 약전 식별에 사용되었습니다.
2.3.4. 세포 배양 및 세포 생존력 분석
Murine 흑색종 B16F10 세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하여 10% FBS 및 1% 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양한 다음 37℃에서 배양하고 5% 대기 CO2로 가습하였다. 세포 생존력 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[42]. 간단히 말해서, 24시간 동안 {{10}웰 플레이트에 1,104개 세포/웰의 밀도로 세포를 시딩했습니다. 다음 날, 세포를 다른 농도의 BID3에 노출시키고 각각 24시간 또는 48시간 동안 배양했습니다. 그런 다음, 10mL EZ-Cytox 용액을 각 웰에 첨가하고 세포를 2-4시간 동안 배양했습니다. 450 nm의 파장에서 ELISA를 사용하여 흡광도를 측정했습니다. 각 분석은 3회 수행되었습니다.
2.3.5. 멜라닌 함량 분석
멜라닌 함량은 이전에 설명한 대로 결정되었습니다[43]. B16F10 흑색종 세포(2×105개 세포/웰)를 {{5}웰 배양 플레이트에 접종했습니다. BID3 onmelanogenesis의 억제 효과를 확인하기 위해 새로운 배지를 BID3(1, 5, 10 lM) 또는 kojic acid(10 mM)를 양성 대조군으로 포함하는 배지로 1시간 동안 교체한 다음 a-MSH(5 lM)로 자극했습니다. ) 및 IBMX(200mM) 48시간 동안. PBS로 2회 세척한 후 Trypsin/EDTA에서 배양하여 세포를 분리하고 펠렛을 1N NaOH 100mL에 녹인 후 60℃에서 한 손으로 혼합하여 멜라닌을 가용화시켰다. 멜라닌 함량은 ELISA 리더(TECAN, Sunrise, Austria)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 멜라닌 함량은 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다: (샘플/대조군) - 100 퍼센트. 모든 측정은 3회 수행되었습니다.
2.3.6. 세포성 티로시나아제 활성
세포의 티로시나제 활성은 약간의 수정을 가하여 이전에 설명한 대로 평가되었습니다[44,45]. 간단히 말해서, 2 105/세포를 6-웰 디쉬에 플레이팅하고 밤새 인큐베이션했습니다. 세포를 다양한 농도의 BID3(1, 5 및 10mM) orkojic acid(10mM)에 1시간 동안 노출시킨 다음, α-MSH(5mM) 및 IBMX(200mM)로 48시간 동안 자극했습니다. PBS로 두 번 헹군 후 세포를 50mM 인산염 완충액(pH 6.5), 0.1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF) 및 1% Triton X{22}}를 포함하는 100mL 용해 용액으로 용해하고 80C에서 30분 동안 동결했습니다. 용해물을 해동하고 4C에서 30분 동안 12,{26}} rpm으로 원심분리했습니다. 그런 다음 {{33}웰 플레이트에서 상청액(80mL)을 2mg/mL L-DOPA(20mL)와 합했습니다. . 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, ELISA 판독기(TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 492 nm에서의 광학 밀도를 측정하였다. BCA를 표준물질로 사용하는 BCA 단백질 분석 시약(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
Cistanche 추출물 혜택: 티로시나제를 억제합니다.
2.3.7. 통계 분석
모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시됩니다. 데이터는 처리 간의 차이를 결정하기 위해 일원 분산 분석(ANOVA)으로 분석한 후 Bonferroni 사후 검정을 수행했습니다. p < 0.05의="" 값은="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="">
3. 결과 및 논의
3.1. 화학
(E)-benzylidene{1}}indanone 유도체(BID1–13)는 일반 Scheme 1에 따라 합성되었습니다. 이 현재 연구에서는 13개의 (E)-2-benzylidene{6}}indanone 유도체와 이들의 tyrosinase 억제 특성을 조사했습니다. 표적(E)-2-벤질리덴-1-인다논 유도체는 산성(아세트산 중 1M HCl) 조건을 사용하여 합성되었습니다. 이러한 반응은 표적(E){10}}벤질리덴{11}} 32.8-99.1%의 수율로 인다논 유도체. 2-벤질리덴{18}}인다논의 E 이성질체만 1,{21}알릴릭 균주로 알려진 A 균주로 인해 생성된 것으로 보입니다. Z-이성체에서 페닐 고리와 카르보닐기 사이의 A-변형(sterichindrance)은 E-이성체에서 페닐 고리와 메틸렌기 사이의 변형보다 분명히 더 큽니다. 합성 화합물의 구조는 실험 섹션(그림 S1-S38)에 설명된 대로 1H 및 13C NMR 및 질량 분석에 의해 확인되었습니다. 특히, 올레핀 proton의 화학적 이동은 2-의 E-이성질체에서 차폐됩니다. 벤질리덴은 카르보닐기의 등방성 효과로 인해 Z 이성질체(<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">
반응식 1. (E)-2-벤질리덴-1-인다논의 합성.
3.2. 화합물의 티로시나제 억제 특성
버섯 티로시나아제를 사용하여 (E)-벤질리덴{1}}인다논 유도체의 티로시나아제 억제 가능성을 조사했습니다. 미코페놀레이트(L-티로신)와 디페놀(L-DOPA)이 이 실험의 기질로 사용되었습니다[35]. 효소 반응은 티로시나제, 기질 및 테스트 억제제로 수행되었습니다. 테스트된 모든 화합물은 농도 의존적 억제를 나타냈습니다. (E)-벤질리덴{8}}인다논 유도체의 IC50 값은 표 1에 나와 있습니다.
L-티로신 및 L-DOPA 기질 모두에서 BID3은 IC50 값이 0인 강력한 억제 활성을 나타냈습니다.{{1{15}}}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM 및 1.39 ± 0.{43}}각각 13.77 ± 0.20 mM 및 33.14 ± 0.93 mM의 IC50 값을 갖는 양성 대조군 코직산과 비교하여 각각 0004 mM (그림 1A). 또한, BID6은 각각 5.00 ± 0.91 mM 및 53.11 ± 2.79 mM의 IC50 값으로 L-티로신 및 L-DOPA에 대해 강력한 활성을 나타냈다. BID1은 IC50 값이 각각 39.74 ± 3.71 mM 및 130.0 ± 5.39 mM인 L-티로신 및 L-DOPA 경로를 통해 티로시나제에 대한 유의한 억제를 보여주었습니다. BID4 및 BID11은 중등도의 티로시나제 억제 활성을 나타냈다. 다른 유도체는 비활성입니다. 마찬가지로 BID2는 IC50 값이 41.27 ± 3.03 mM 및 52.93 ± 2.62 mM로 L-티로신 및 L-DOPA에 대해 유의한 활성을 나타냈습니다. 또한 보고된 혼합형 억제제인 프탈산 및 신남산은 억제를 나타내지 않았습니다. 200mm 농도에서 효과[47].
구조-활성 관계(SAR) 연구 결과와 일치하게, 페닐 고리에 (E)-벤질리덴-1-인다논 치환체를 포함하는 유도체가 잠재적 티로시나제 억제에 현저한 영향을 미쳤습니다. 가장 높은 효능으로 티로시나제를 억제하는 BID3은 4-히드록시기의 존재하에 2-히드록시기를 갖고 티로시나제 활성을 크게 억제합니다(BID1 vsBID3). 이러한 결과는 페닐 고리 구조의 2,{9}}디히드록시기(레조르시놀 부분)가 티로시나제의 향상된 억제를 담당할 수 있음을 시사했습니다. 흥미롭게도 잠재적인 합성 티로시나제 억제제에 대한 이전 연구에서 2,{11}디히드록시 치환이 티로시나제 활성을 강력하게 억제한다는 것을 보여주었습니다[48,49]. 또한 SAR 데이터는 4-히드록시기가 있는 상태에서 3-히드록시기의 도입이 티로시나제 억제에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 이러한 현상은 4-methoxy{17}}hydroxy phenyl ring이 tyrosinase에 대한 억제 활성을 증가시키는 반면, 3,{19}dihydroxy group(catechol moiety)의 도입은 tyrosinase 억제 활성( BID2 대 BID6) [35]. 이러한 결과는 3-하이드록시{24}}메톡시 그룹이 포르티로시나아제 억제 활성도 담당함을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 본 연구에서 2,{28}디메톡시 페닐 또는 3,{30}디메톡시 페닐기를 포함하는 BID9 및 BID11은 중간 정도의 티로시나제 억제 활성을 나타냈습니다. L-티로신 및 L-DOPA 경로를 통한 IC50 값에 기초하여, BID3은 가장 강력한 티로시나제 억제 활성을 나타내므로 이 억제 효과의 기본 메커니즘을 추가로 연구했습니다. Radhakrishnan et al. (2015) [20]은 수산기 치환된 (Z)-벤질리덴{38}}인다논 화합물이 강력한 티로시나제 억제제라고 보고했습니다. 이전 연구에서 히드록실 치환된 (Z)-벤질리덴{41}인다논 유도체가 항티로시나제 활성을 가지고 있음을 보여주었지만, 우리가 아는 한, (E)-벤질리덴{44}} 세포 기반 실험을 사용한 인다논 유도체
표 1. 치환된 2,{2}}dihydro-1H-inden-1-one(1-indanone) chalcone-like의 버섯 티로시나제 억제 가능성
파생 상품(BID1–13).
그림 1. BID3와 코직산에 의한 버섯 티로시나아제 활성의 농도 의존적 억제(양성 대조군)(n=3).
3.3. 티로시나제 억제의 효소 동역학 분석
BID3가 가장 강력한 억제제였기 때문에 우리는 억제 효과의 기본 메커니즘을 추가로 연구했습니다. 효소 억제 방식을 설명하기 위해 다양한 농도의 L-DOPA 및 다양한 BID3 농도에서 동역학 분석을 수행했습니다. 억제 패턴을 확인하기 위해 동역학 연구에서 얻은 데이터를 사용하여 Dixon 및 Lineweaver-Burk 플롯을 그리고 Dixon 플롯을 해석하여 억제 상수(Ki)를 결정했습니다(그림 2A 및 B). L-DOPA의 농도는 다음과 같이 표시됩니다: 1, 2, 4mM. 교차점은 왼쪽에 있으며 Ki 값이 2.4mM인 티로시나제에 대한 혼합형 억제를 나타냅니다(그림 2B). Ki 값은 효소-억제제 복합체를 형성하는 데 필요한 농도를 나타내므로 Ki 값이 낮은 억제제는 더 큰 티로시나제 억제 활성을 나타냅니다.
분자 도킹은 수년 동안 약물 발견에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다. 그러나 도킹 절차는 단백질의 결합 포켓에서 리간드의 정확한 위치를 식별하고 리간드와 단백질 사이의 친화도를 예측하는 것을 목표로 합니다. 즉, 도킹은 두 개의 분자가 3차원 공간에서 함께 맞춰지는 과정을 설명합니다. BID3가 티로시나제의 활성 부위에 결합하는지 확인하기 위해 버섯 티로시나제(PDB ID: 2Y9X)의 결정 구조에서 BID3의 가능한 결합 위치를 확인하기 위해 분자 도킹 분석을 수행했습니다(그림 3A). 이 결과는 AutoDock4.2를 사용하여 계산되었습니다. 프로그램. 가장 안정적인 결합 위치는 가장 낮은 점수를 받은 위치였습니다[50]. 최근 Hassani et al. [47]은 신남산과 프탈산이 혼합형 tyrosinaseinhibitor라고 보고했다. 따라서 Aid, cinnamic acid 및 phthalic acid를 사용하여 도킹 결과를 검증했습니다. ]. tyrosinase-BID3 inhibitorcomplex는 tyrosinase의 ASN260 및 MET280 잔기와 2개의 수소 결합을 포함하여 6.28 kcal/mol의 결합 에너지를 나타냈고, BID3과 tyrosinase 잔기 VAL248, PHE264, VAL283 사이에 소수성 상호작용이 관찰되어 버섯티로시나제(표 2, 및 도 3E 및 H). 또한, 두 개의 알로스테릭 부위에서 BID3, 프탈산(알로스테릭 억제제 1) 및 신남산(알로스테릭 억제제 2)의 분자 도킹 모델이 그림 3C 및 3D에 나와 있습니다. 프탈산과 신남산은 각각 알로스테릭 부위 1과 2에서 참조 리간드로 사용되었습니다[47,51]. 도 3F 및 I에 나타난 바와 같이, BID3 및 프탈산은 알로스테릭 부위 1에서 티로시나제의 TRY140 잔기와 수소 결합을 나타내고, 티로시나제의 LEU24, PHE147 및 ILE148과 3개의 소수성 상호작용 잔기를 나타냈다. BID3 및 신남산의 상응하는 리간드 상호작용 tyrosinase의 allosteric site2에는 tyrosinase의 ASP312와 LYS376 사이에 수소 결합이 포함된 반면, THR308은 allosteric site 2에서 소수성으로 상호작용했습니다(그림 3G 및 J). 또한 BID{51}}티로시나아제 결합은 티로시나아제의 두 알로스테릭 부위(각각 4.38 및 5.68kcal/mol)에서 결합 에너지를 발휘하는 것으로 밝혀져 두 알로스테릭 부위에 대한 높은 결합 친화도를 나타냅니다. 효소 동역학 연구에 기초하여, BID3는 혼합형 억제를 나타내었고, 촉매 부위와 2개의 알로스테릭 부위 둘 다에 대한 BID3의 결합성은 티로시나제의 혼합형 억제를 확인시켜 주었다.
그림 2. L-DOPA를 기질로 사용하여 BID3에 의한 버섯 티로시나아제 억제에 대한 Lineweaver-Burk(A) 및 Dixon 플롯(B).
3.4. 생물학적 활동
세포 배양 모델에서 BID3의 항-티로시나제 효과를 이용하기 위해 우리는 B16F10 세포에 대한 세포독성 효과를 조사했습니다. 세포를 48시간 동안 다양한 농도의 BID3(1-20mM)으로 처리하고 EZ-Cytox 분석을 사용하여 평가했습니다. 결과는 BID3이 20mM까지 B16F10 흑색종 세포에서 유의한 세포독성 효과를 나타내지 않았다는 것을 나타내었다(도 4A 및 B). 따라서 최대 20mM의 BID3를 사용하여 후속 실험을 수행했습니다.
표 2 AutoDock4.2 프로그램을 사용하여 결정된 버섯 티로시나아제(PDB ID: 2Y9X)에서 BID3의 결합 부위 및 도킹 점수.
멜라닌 생성은 티로시나아제 효소 캐스케이드에 의해 조절됩니다. 이러한 이유로 티로시나아제 활성을 감소시키기 위해 여러 피부 미백 화합물이 개발되었습니다. tyrosinaseinhibitor인 Kojic acid를 양성대조군으로 사용하였다[53]. 따라서, cAMP 상승 유도 과색소침착에 대한 BID3의 효과를 조사하기 위해, B16F1{13}} 세포를 BID3 존재 하에 a-MSH 및 IBMX로 처리했습니다(1, 5 및 2{{20}} mM) 48시간 동안 멜라닌 함량 및 셀룰러티로시나아제 활성을 측정하였다(도 4C 및 D). a-MSH 및 IBMX 처리는 B16F10 세포에서 멜라닌 함량(도 4C) 및 세포성 티로시나아제 활성(도 4D)에서 유의한 증가(P < 0.001#)를="" 유도했습니다.="" 그러나="" bid3="" 처리는="" 유의하게(p=""><0.001#) b16f10="" 세포에서="">< 0.01**;="" p="">< 0.001***)="" 및="" 농도="" 의존적으로="" b16f10="" 세포의="" 멜라닌="" 함량="" 및="" 세포="" 티로시나제="" 활성이="" a-msh="" 또는="" ibmmx="" 처리된="" 세포와="" 비교하여="" 감소하여="" 세포="" 멜라닌의="" 감소가="" 티로시나제="" 활성의="" 억제로="" 인한="" 것일="" 수="" 있음을="" 나타냅니다.="" .="" 따라서,="" 이러한="" 발견은="" bid3가="" 세포독성을="" 유도하지="" 않고="" b16f10="" 세포에서="" 티로시나제="" 활성="" 및="" 멜라닌="" 합성을="" 억제하는="" 항멜라닌="" 생성="" 효과를="" 발휘함을="" 명백히="">
인다논은 의약 화학의 특권 구조 중 하나이며 일반적으로 다양한 약리학적 활성 화합물과 관련이 있습니다[54]. 인다논 부분은 다양한 생리활성 천연물에 존재합니다. 이러한 관점에서 Okpekonet al., [55]은 Uvaria 뿌리에서 분리된 새로운 1-indanone 화합물을 보고했습니다. 이 화합물은 식물에서 분리된 최초의 1-인다논 유도체입니다. Nagle et al., [56]은 새로운 methylated indane-aldehyde가 마린시아노박테리움(marinecyanobacterium)에서 종양 혈관신생 조절제로 분리되었다고 보고했습니다. 마찬가지로, 인다논 코어의 생물학적 중요성 이후, 지난 몇 년 동안 연구자들은 치료제로서 약리학적 활성 인다논 유사체를 개발하는 데 집중해 왔습니다. 1-인다논의 구조적 다양성은 다양한 생물학적 반응을 의미하며 이러한 화합물은 농업 및 의약에 적용될 수 있습니다. 다양한 인다논 기반 화합물이 항알츠하이머병[16,57-59], 항암 [60- 62], 항균제[63,64] 및 항바이러스제[65,66]. 광범위한 응용 가능성으로 인해 1-인다논은 추가 연구의 흥미로운 대상이었으며 합성을 위한 새로운 클래스를 설계하는 것이 바람직합니다.
시스탄체 튜볼로사: 안티에이징
4. 결론
새로운 강력한 티로시나제 억제제를 식별하기 위해 13개의 (E)-벤질리덴{1}}인다논 유도체를 설계 및 합성했습니다. 이러한 화합물 중 (E)-2-(2,4-디히드록시-벤질리덴){ {6}},3-디하이드로{8}}H-인{10}}원(BID3)은 티로시나제 활성(IC{12}}.034 및 1.39mM, L-티로신 및 L-DOPA)는 참조 화합물인 코직산(각각 IC{18}}.77mM 및 33.14mM)보다 우수했습니다. 구조-활성 관계는 (E)-benzylidene-1-indanone 골격의 2 및 4-위치에 dihydroxyl 그룹의 존재가 tyrosinase에 대한 활성을 향상시키는 것으로 나타났습니다. Lineweaver-Burk 및Dixon 플롯에 의해 결정된 효소의 효소적 억제 방식은 BID3이 혼합형 억제제임을 나타냅니다. 분자 도킹 연구는 활성 부위와 알로스테릭 부위에서의 결합이 티로시나제 억제 활성을 향한 중요한 기전임을 보여줍니다. 이러한 결과에 기초하여, BID3는 과색소침착과 같은 피부 질환의 치료를 위한 강력한 티로시나제 억제제인 것으로 보였다.
사막 시스탄치 효능: 멜라닌 형성 억제