DNA 의존성 단백질 키나제 촉매 서브유닛(DNA-PKcs)이 수컷 생쥐의 만성 신장 질환 진행을 촉진합니다 2

TAF7의 DNA-PKcs 매개 인산화는 신장 섬유증을 악화시킵니다

DNA PKcs가 조절하는 가능한 분자 메커니즘을 더 자세히 분석하기 위해CKD의 발전, phosphoproteomics는 DNA-PKcs의 가능한 기질을 밝히기 위해 수행되었습니다. 그림 5a에서 볼 수 있듯이 차별적으로 인산화된 단백질의 대부분은 핵 단백질이었습니다. 그만큼인산화 수준이 단백질 중 단 6개의 단백질만이신장 조직의 현저한 감소화산 플롯 (그림 5a)에서 볼 수 있듯이 WT 마우스와 비교 한 DNA-PKcs-/-마우스. DNA-PKcs-/- 마우스와 WT 대조군 사이의 차별적으로 인산화된 단백질의 히트맵 분석은 Slc4a1, Ampd2, Hbb-b1, Gas2, Ank1 및 TAF7의 표시된 부위의 인산화 수준이 DNA-PK 녹아웃 후에 유의하게 감소했음을 보여주었습니다(그림 2). 5a). 세포하 위치 분석과 이들 단백질의 녹다운을 통해 우리는 DNA-PKcs가 아마도 TFIID의 하위 단위인 TAF7의 인산화를 통해 신장 섬유증을 매개한다는 것을 발견했습니다. 공면역침전 연구는 DNA-PKcs와 TAF7 사이의 직접적인 상호 작용 가능성을 보여주었습니다(그림 5b). DNA-PKcs와 TAF7 사이의 단백질-단백질 도킹은 온라인 데이터베이스 ClusPro39,40을 통해 분석되었습니다. 도킹 결과는 DNA-PKcs와 TAF7 사이의 직접적인 상호 작용 가능성을 보여 주었으며 TAF7의 213- 사이트 세린은 아마도 DNA-PKcs에 결합하는 가장 가까운 사이트 중 하나입니다 (보충 그림 6a). TAF7이 DNA-PKcs에 의해 직접 인산화되었는지 여부를 분석하기 위해 시험관 내 키나제 분석을 수행했습니다. 키나제 분석의 생성물을 질량 분석법으로 분석했습니다. 결과는 인간 TAF7의 S213, T137, Y24 및 S171 사이트가 DNA-PKcs에 의해 인산화되었음을 보여줍니다 (보충 그림 6b). 또한, 우리의 결과는 인간의 p-DNA-PKcs와 TAF7의 단백질 수준 사이의 긍정적인 연관성을 보여주었습니다.만성콩팥병p DNA-PKcs와 TAF7의 면역 형광 공동 염색을 통한 조직 (그림 5c).

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이전 연구에 따르면 TAF7의 계산된 분자량은 약 40kDa이지만 인산화된 TAF7은 약 55kDa41입니다. 웨스턴 블롯 및 면역조직화학적 염색 결과는 WT 대조군의 신장 조직에서 UUO에 의해 TAF7의 수준이 크게 유도되었음을 보여주었다(그림 5d 및 보충 그림 6d). DNA-PKcs 녹아웃은 WT 대조군과 비교하여 기준선 및 UUO 모델 모두에서 TAF7의 인산화를 억제했습니다 (그림 5d). UUO 생쥐에서 TAF7의 인산화는 Phos-tag SDS-PAGE42에 의해 확인되었습니다 (보충 그림 6c). UIR 모델에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다(그림 5e). DNA-PKcs 억제제 NU7441로 처리하면 생쥐에서 UIR에 의해 유도된 TAF7의 상향 조절된 인산화도 억제되었습니다(그림 5f). 또한, 웨스턴 블롯으로 분석한 TAF7의 단백질 수준은 HK-2 세포(그림 5g)의 DNA-PKcs 녹아웃과 HK2(그림 5h) 또는 NRF-49F 세포의 NU7441 처리가 모두 있음을 보여주었습니다. (그림 5i) 시험관 내에서 TGF1에 의해 유도된 TAF7의 상향 조절된 인산화를 억제했습니다.

DNA-PKcs는 신장 섬유증에서 TAF7의 인산화에 관여하기 때문에 TAF7 결핍이 신장 상피 세포의 탈분화 또는 TGF 1에 의해 유도된 간질 섬유아세포의 활성화 및 증식에 영향을 미칠 수 있는지 조사했습니다. TAF7 녹아웃 mPTC 세포 및 NRK{{5 }}CRISPR/Cas9를 사용하여 F 세포를 생성하고, TAF7 녹아웃 세포의 성공적인 구축을 웨스턴 블롯으로 확인했습니다(보충 그림 6e). 우리의 결과는 TGF1에 노출 된 후 낮은 수준의 FN 및 콜라겐 I 생성으로 볼 수 있듯이 TAF7 녹아웃이 신장 상피 세포의 탈분화를 개선한다는 것을 보여주었습니다 (그림 5j, l). 유사하게, TAF7 녹아웃은 낮은 수준의 FN 생산(그림 5k), 콜라겐 I(그림 5m), -SMA(그림 5n)에서 볼 수 있듯이 TGF 1에 의해 유도된 NRF-49F 세포의 섬유화 표현형을 둔화시켰습니다. )뿐만 아니라 TAF7-/-세포에서 낮은 수준의 EdU 염색 (그림 5o). 신장 상피 세포에서 TAF7의 과발현이 섬유화 표현형을 유도하기에 충분한지 여부를 확인하기 위해 HK{22}} 세포 또는 NRK49F 세포를 인간 TAF7 또는 이의 돌연변이체의 과발현 플라스미드로 형질감염시켰습니다. 웨스턴 블롯 결과는 HK-2 또는 NRF49F 세포의 전섬유화 표현형이 실제로 TAF7 또는 그 돌연변이의 과발현에 의해 강화되었음을 보여주었습니다(보충 그림 6h,j). 그러나 TAF7의 섬유화 효과는 HK-2 세포의 DNA-PKcs 녹아웃에 의해 거의 완전히 차단되었습니다(보충 그림 6i). 또한, 우리는 TAF7 결핍이 DNA-PKcs의 섬유화 효과에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사했습니다. 흥미롭게도 TAF7 결핍은 DNA-PKcs 과발현의 섬유화 효과를 억제하고 (보충 그림 6f) mPTC 세포에서 NU7441의 항 섬유화 효과를 차단했습니다 (보충 그림 6g). 최근에는 Wang S, et al. 세포질 DNA-PKcs가 Fis1과 증가하고 상호 작용하고 TQ 모티프의 Thr34에서 인산화되어 Drp1에 대한 Fis1의 친화력이 증가하고 AKI43에서 미토콘드리아 단편화가 유도된다는 사실을 발견했습니다. 우리 연구에서 핵 추출 단백질 분석 결과에 따르면 DNA-PKcs는 AKI 모델과 다른 UUO 마우스 신장의 핵에서 주로 국소화되고 증가한 것으로 나타났습니다 (보충 그림 6k). 그리고 Fis1을 쓰러뜨리면 TGF1이 적용된 신장 세뇨관 상피 세포에서 섬유화 반응이 촉진되었으며, 이는 Fis1이 CKD에서 DNA-PKcs의 섬유화 역할을 매개하지 않음을 시사합니다(보충 그림 6l). 종합하면, 이들 데이터는 TAF7의 DNA-PK 매개 인산화가 신장 섬유증을 악화시킨다는 것을 나타냅니다.

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TAF7은 RAPTOR의 발현을 상향 조절하여 mTORC1 활성화를 촉진합니다.

TAF7의 섬유화 촉진 효과의 메커니즘을 조사하기 위해, TGF 1이 있거나 없이 처리된 NC 및 TAF-/- mPTC 세포의 전사체 변화를 분석하기 위해 RNA-Seq를 수행했습니다. RNA-Seq 결과는 TAF7 녹아웃이 TGF {{5} } mPTC에서 섬유증 관련 유전자 발현을 유도했습니다 (보충 그림 7a, b). KEGG 경로 농축 분석은 mTOR 신호 전달 경로가 TGF 1 처리 없이 TAF-/-와 NC mPTC 세포 사이의 최상위 경로임을 보여주었습니다(그림 6a). 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은 TGF1 처리 후 mTOR 신호 전달 경로의 상당한 상향 조절을 나타냈는데, 이는 NC 대조군 세포와 비교하여 mPTC 세포에서 TAF7 녹아웃 후 유의하게 감소했습니다(그림 6a). mTOR 신호전달의 히트맵 분석은 mTORC144,45의 양성 조절자인 RPTOR(RAPTOR)가 TGF 1 처리에 의해 증가되었으며, 이는 mPTC 세포에서 TAF7의 녹아웃에 의해 억제되었음을 보여주었습니다(그림 6b).

RPTOR의 단백질 수준과 mTOR의 인산화는 모두 웨스턴 블롯으로 분석한 바와 같이 mPTC 세포에서 TGF1 처리 후 유의하게 증가했습니다. 그러나 TAF7 결핍은 NC 대조군과 비교하여 mPTC 세포에서 RPTOR의 단백질 수준과 TGF1에 의해 유도된 mTOR의 인산화를 감소시켰습니다(그림 6c). Raptor, Rictor 및 Mlst8을 포함한 mTOR 및 그 단백질 파트너의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과 TGF 1 치료가 Rptor, Rictor 및 Mlst8의 mRNA 수준을 상향 조절했지만 mTOR에서는 그렇지 않은 것으로 나타났습니다. TAF7 결핍은 NC 대조 세포와 비교하여 mPTC 세포에서 TGF1 처리 유무에 관계없이 Raptor의 mRNA 수준을 크게 감소시켰지만 Rictor, Mlst8 또는 mTOR은 그렇지 않았습니다(보충 그림 7c). 마찬가지로 DNA-PKcs 결핍 또는 억제는 mRNA 수준을 크게 감소시켰습니다.랩토린 신장 조직UUO 마우스 및 UIR 마우스의 (보조 그림 7d, e). 또한, 우리는 TGF 1에 의해 유도된 인간 Raptor의 전사 활성화에 대한 TAF7의 세린 213의 인산화를 분석하기 위해 TAF7, TAF7- S213D 및 TAF7-S213A의 두 가지 다른 잔기 213 세린 부위 돌연변이를 구성했습니다. 홍콩-2 셀. 루시퍼라제 분석 결과는 TAF7- S213A 그룹의 상대적 루시퍼라제 활성이 TAF7-WT 및 TAF{ {15}}S213D 그룹(그림 6d). 또한, ChIP 분석 결과는 TAF7이 Rptor 프로모터에 직접 결합할 수 있음을 보여주었습니다(그림 6e). 이러한 결과는 TAF7이 아마도 잔기 213의 인산화를 통해서만이 아니라 TGF1에 의해 유도된 RPTOR의 전사 활성화를 매개한다는 것을 나타냅니다. 또한, 우리의 결과는 RPTOR의 단백질 수준과 mTOR의 인산화가 둘 다라는 것을 보여주었습니다.신장 조직 증가UUO 및 UIR 마우스의 기준선 및 모델 마우스 모두에서 DNA-PKcs 녹아웃 후 유의하게 감소했습니다 (그림 6f-i). DNA-PKcs 녹아웃 HK-2 세포 및 NRF-49F 세포의 NU7441 처리에 대한 반응에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다(그림 6j, k). 또한 Western blot 결과는 DNA-PKcs 또는 TAF7의 과발현 후에 RPTOR의 단백질 수준과 mTOR의 인산화가 증가한 것으로 나타났습니다 (보충 그림 7f, g). 더욱이, RPTOR의 녹다운은 TGF1에 의해 유도된 mTOR의 인산화를 현저하게 억제했습니다(보충 그림 7h). 종합하면, 이러한 결과는 TAF7의 DNA-PKcs 매개 인산화가 RPTOR의 발현을 상향 조절하여 mTORC1 활성화를 촉진한다는 것을 나타냅니다.

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그림 6|TAF7의 DNA-PKcs 매개 인산화는 RPTOR 발현을 상향 조절하여 mTORC1 활성화를 촉진합니다. mTOR 신호(빨간색 글꼴로 표시)가 TAF7-/-와 NC 그룹 사이에서 차별적으로 발현되는 최고 신호 인자임을 보여주는 RNA-seq. GSEA는 mTOR 신호전달이 NC + TGF 1 그룹에서 상향조절되었고 TAF7-/- + TGF 1 그룹(n{12}}), TGF 1(5ng/ml) 처리에서 24시간 동안 억제되었음을 보여주었습니다. b 24시간 동안 TGF 1(5ng/ml) 처리 유무에 관계없이 NC 그룹과 비교하여 TAF7-/- 그룹에서 Rptor(빨간색 글꼴로 표시)가 감소했음을 보여주는 히트맵 이미지(각각 n{20}}) 그룹). c TAF7-/- 및 TGF 1(5ng/ml)로 24시간 처리한 NC mPTC에서 웨스턴 블롯으로 분석한 RPTOR, mTOR 및 인산화된 mTOR의 단백질 수준. 막대는 정량화 결과를 나타냅니다(평균 ± SD, n=3 독립 실험). d TGF 1(5ng/ml)을 사용하여 24시간 동안 HK-2 세포에서 루시퍼라제 리포터 분석. 막대는 3개의 독립적인 실험 결과를 나타냅니다(평균 ± SD). e TAF7이 Raptor의 프로모터에 결합하는지 분석하기 위해 ChIP 분석을 수행했습니다. 막대는 정량화 결과를 나타냅니다(평균 ± SD, n=3 독립 실험). f RPTOR, mTOR 및 인산화된 mTOR의 단백질 수준은 Western blot으로 분석되었습니다.신장 조직UUO(7일) 또는 UIR(21일)을 받은 DNA PKcs-/- 및 WT 대조 마우스(g), NU7441(40 mg/kg) 및 UUO(h)를 받은 비히클 처리 마우스의 UIR(i), DNA PKcs−/− 또는 NC HK-2 세포(j), NU7441(0.1μM) 또는 TGF 1(5ng)로 처리된 비히클 처리 NRK-49F 세포(k) /ml) 24시간 동안. 막대는 정량화 결과를 나타냅니다(평균 ± SD, 각 그룹의 n= 6 마우스 및 세포 모델에 대한 n=3 독립적 실험). 일원 분산 분석(One-way ANOVA)과 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 d, e에 대한 p-값을 결정했습니다. 양방향 ANOVA와 Šídák의 다중 비교 테스트를 사용하여 c, f–k에 대한 p-값을 결정했습니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

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DNA-PK의 억제는 생체 내 및 시험 관내 대사 재 프로그래밍을 수정합니다

이전의 여러 연구에 따르면9,46, mTORC1의 비정상적인 활성화는 대사 재프로그래밍을 중재하여 신장 섬유증의 진행을 촉진합니다.섬유성 신장. 따라서 우리는 DNA-PK 또는 TAF7의 억제가 섬유증 신장의 대사 재프로그래밍을 교정하는지 여부를 조사했습니다. TGF 1-처리된 NC 및 TAF-/- mPTC 세포의 전사체 변화에 대한 RNA-Seq 분석을 기반으로 KEGG 경로 농축 분석은 대사 신호 전달 경로가 TGF {{4} } 처리된 TAF-/- 및 NC mPTC 세포(그림 7a). 또한, GSEA는 NC 대조 세포와 비교하여 TAF7 녹아웃 mPTC 세포에서 TGF1로 처리한 후 산화적 인산화 및 지방산 산화(FAO) 경로의 유의미한 상향 조절을 나타냈습니다(그림 7a). NC 대조군과 비교하여 mPTC에서 TAF7이 녹아웃되었을 때 해당과정 경로가 유의하게 감소했습니다(그림 7a). 이러한 결과는 TAF7 결핍이 PTC 세포에서 TGF 1-유도된 대사 재프로그래밍을 교정한다는 것을 나타냅니다.

섬유증 신장의 대사 재프로그램 조절에서 DNA-PKcs의 역할을 이해합니다. 먼저, 지방산 산화에 관여하는 주요 효소(CPT1, CPT2, ACOX1, ACOX2)의 단백질과 mRNA 수준을 웨스턴 블롯과 qRT-PCR로 분석했습니다. 결과는 UUO 또는 UIR 조건 하에서 WT 마우스의 신장에서 이들 효소의 발현이 유의하게 감소했지만 DNA-PKcs 녹아웃 마우스에서는 그 발현이 유의하게 회복되었음을 보여주었습니다 (그림 7b, c 및 보충 그림 8). 둘째, 미토콘드리아 형태와 기능은 산화적 인산화에 필요하며, 전자현미경을 통해 UUO에 의해 유도된 WT 마우스의 신장 세뇨관 세포에서 미토콘드리아의 명백한 단편화가 밝혀졌으며 이는 DNA-PKcs-/- 마우스의 신장 세뇨관 세포에서 상당히 개선되었습니다. .7f). 이러한 결과는 WT 마우스에서 UUO에 의해 유도된 비정상적인 산화적 인산화 및 지방산 대사가 DNA-PKcs 녹아웃에 의해 개선된다는 것을 보여주었습니다.

해당작용은 신장 섬유증의 특징이며 신장 섬유증의 진행을 촉진합니다. 해당과정의 속도 제한 효소인 HK2(Hexokinase 2)와 LDHA(Lactate Dehydrogenase A)의 단백질 수준을 Western blot으로 분석했습니다. 결과는 UUO 생쥐와 UIR 생쥐의 신장 조직에서 HK2와 LDHA의 수준이 크게 상향 조절되어 섬유증 신장에서 해당작용 활성이 증가했음을 나타냅니다. 대조적으로, HK2 및 LDHA의 낮은 수준으로 표시되는 바와 같이, UUO 및 UIR 모델 모두에서 WT 마우스에 비해 DNA-PKcs 결핍 마우스의 신장 조직에서 해당 분해가 유의하게 억제되었습니다 (그림 7d, e). 세포외 산성화율(ECAR) 분석을 수행하여 TGF 1-처리된 DNA-PKcs−/− HK-2 세포 및 NU7441-처리된 NRK-49F 세포의 해당작용 활성을 분석했습니다. 시험관 내. DNA-PKcs의 녹아웃과 NU7441 처리는 ECAR을 크게 감소시켰으며 이는 대조 세포에 비해 TGF 1- 처리 세포에서 상향 조절되었습니다 (그림 7g-h). TAF7-/-의 녹아웃은 또한 TGF1에 의해 유도된 mPTC에서 ECAR의 상향 조절을 유의하게 감소시켰습니다(그림 7i). 또한, DNA-PKcs-/- 및 NU{21}} 처리된 세포의 배양 배지에서 세포외 젖산염 수준도 감소했습니다(그림 7j, k).

DNA-PKcs-/-마우스에서 대사 재프로그래밍이 어떻게 개선되었는지 이해하기 위해 UUO 수술 후 대사체 변화를 분석하기 위해 대사체학 프로파일링을 사용했습니다(그림 8a). UUO는 DNA-PKcs의 녹아웃에 의해 회복된 WT UUO 신장에서 피루브산과 같은 포도당 대사 산물의 하향 조절에 의해 입증된 바와 같이 WT 마우스의 신장에서 손상된 포도당 대사를 유도했습니다(그림 8a). 또한, UUO를 받은 WT 생쥐의 신장에서 젖산 축적 증가도 관찰되었으며, 이는 신장 세포에서 산화적 인산화에서 강화된 해당작용으로의 대사 전환을 나타냅니다. 그러나 DNA-PKcs-/-마우스의 손상된 신장에서는 해당작용이 유의하게 억제되었습니다(그림 8a). 또한 WT UUO 마우스의 신장에서 라우로일 카르니틴(그림 8a)과 미리스토일 카르니틴(그림 8a)을 포함한 카르니틴 결합 장쇄 지방산의 축적이 관찰되어 지방산 대사에 결함이 있음을 시사합니다. 대조적으로, DNA-PKcs 녹아웃은 UUO에 의해 유발된 이러한 모든 이상을 대부분 수정했습니다. 종합하면, 이들 결과는 DNA PK 또는 TAF7의 억제가 생체내 및 시험관내 손상 또는 TGF1에 의해 유도된 대사 재프로그래밍을 교정한다는 것을 나타냅니다.

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논의

모두 세포 손상에 의해 시작된 상피 탈분화와 근섬유아세포 활성화 및 증식은 CKD2의 진행을 촉진합니다. DNA 손상 반응(DDR)은 신장 상피 손상과 관련이 있는 경우가 많지만47, 진행성 CKD에서 상피 탈분화 및 근섬유아세포 활성화에 대한 잠재적인 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 본 연구에서 우리의 결과는 DNA 의존성 단백질 키나제 촉매 서브유닛인 DNA PKcs의 발현이 섬유성 신장에서 증가하고 CKD의 발병을 촉진한다는 것을 보여주었습니다. DNA-PKcs는 DNA 이중 가닥 절단(DSB)24,25 또는 ROS26에 의해 활성화되지만, 우리의 결과는 DNA-PKcs 발현이 TGF 1-SMAD 신호에 의해 활성화되는 반면 DNA-PKcs 녹아웃은 SMAD2/SMAD3을 억제하는 것으로 나타났습니다. . 이러한 결과는 섬유증에서 TGF 1-SMAD 신호 활성화를 매개하는 새로운 가능한 경로를 제시합니다.

다음으로 우리는 글로벌 prkdc 유전자 녹아웃 마우스를 생성했습니다. 우리의 결과는 DNA-PKcs의 삭제가 UUO 및 UIR 마우스 모델 모두에서 신장 세뇨관 손상과 신장 간질 섬유증의 진행을 약화시키는 것으로 나타났습니다. DNA-PKcs-/-마우스의 가장 두드러진 표현형은 림프구 결핍이기 때문에 DNA-PK가 림프구와 무관하게 신장 섬유증을 촉진한다고 결론을 내릴 수 없습니다. 림프구 결핍의 잠재적 영향을 배제하기 위해 우리는 CRISPR/cas9 녹인 마우스를 사용하여 생체 내에서 특정 DNA-PKcs 녹아웃이 있는 근위 신장 세뇨관 상피 세포를 만들었습니다. 우리의 결과는 DNA-PKcs의 신장 관형 특이적인 결실이 UUO에서 신장 간질 섬유증의 진행을 방해한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 우리의 결과는 또한 DNA-PKcs 결핍이 관형 상피 세포 표현형을 보존하고 시험관 내에서 간질성 섬유아세포 활성화를 조절한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 결과는 DNA-PKcs가 아마도 림프구 결핍과 직접적인 관계가 없이 상피 탈분화와 근섬유아세포 활성화를 매개한다는 것을 나타냅니다. 또한, 우리는 고도로 특이적인 DNA-PKcs 억제제인 NU7441의 항섬유화 효과를 조사한 결과, NU7441 치료가 UUO 및 UIR 마우스 모델 모두에서 신장 간질 섬유증의 진행을 현저하게 약화시키는 것으로 나타났습니다. NU7441은 생리학적 용량에서 DNA-PK의 부분 억제제입니다. 이전 연구에서는 NU7441 치료가 성체 마우스의 B 세포 기능에 유의미한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다33. 또한 UUO 마우스 모델에서 DNA-PKcs 녹아웃 마우스를 NU7441로 처리하여 DNA-PKcs에 대한 NU7441의 구체적인 작용을 확인했습니다. 이러한 결과는 추가 연구가 필요하지만 CKD의 임상 치료를 위한 NU7441의 잠재적인 변형을 시사합니다.

우리의 결과는 DNA-PKcs 결핍이 생체 내 및 시험관 내에서 DSB를 악화시키지 않았음을 보여 주었으며, 이는 DNA-PKcs가 DDR에서의 역할을 통해서가 아닌 신장 손상 및 신장 간질 섬유증을 매개한다는 것을 시사합니다. Phosphoproteomics 분석에 따르면 DNA-PKcs-/-마우스의 신장 조직에서 TAF7의 인산화가 감소한 것으로 나타났습니다. TAF7 결핍은 TGF1에 의해 유도된 신장 상피 세포 및 섬유모세포의 섬유화 촉진 표현형을 억제했습니다. TAF7의 섬유화 촉진 효과는 신장 상피 세포의 DNA-PKcs 결핍에 의해 거의 완전히 차단되었습니다. 우리의 결과는 TAF7이 DNA-PKcs 키나제 활성의 기질이고 TAF7의 DNA-PKcs 매개 인산화가 신장 섬유증을 악화시킨다는 것을 나타냅니다.

RNA-Seq 결과는 TAF7이 mTORC149의 양성 조절자인 Raptor의 발현을 상향 조절함으로써 mTORC1 활성화를 촉진한다는 것을 보여주었습니다. Phosphoproteome 결과는 세린 -213에 대한 TAF7의 인산화가 WT 대조군과 비교하여 DNA-PKcs-/-마우스의 신장에서 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다. 질량 분석법 분석에 따르면 인간 TAF7의 S213, T137, Y24 및 S171 부위는 시험관 내에서 DNA-PKcs에 의해 인산화되었습니다. 더욱이, TAF7-WT, TAF7-S213D 및 TAF7-S213A를 포함한 다양한 TAF7 돌연변이의 형질감염은 HK-2 세포에서 인간 Rptor의 전사 활성화를 증가시켰습니다. 이러한 결과는 TAF7이 TGF1에 의해 유도된 Rptor의 전사 활성화를 중재한다는 것을 나타내며, 이는 아마도 그 213- 부위의 인산화를 통해서만이 아닙니다. TAF7은 핵심 전사 인자는 아니지만 TAF141,51와 같은 다른 TAF와 상호작용하고 전사 인자의 효소 활성을 조절합니다. 이는 TAF7 단독의 과발현이 홍콩에서 인간 RPTOR의 전사를 활성화하지 못한 이유를 설명할 수 있습니다{{28} } TGF 1 처리가 없는 세포. TAF7의 여러 세린 잔기는 인산화되어 전사를 활성화하거나 억제할 수 있습니다. 예를 들어, 이전 연구에서는 세린 264에 대한 TAF7의 인산화가 TAF1에 대한 TAF7의 결합을 방해하여 사이클린 D141의 전사 상향 조절을 초래한다는 것을 발견했습니다. TAF{37}}의존 전사 외에도 TAF7은 TAF{39}}독립 전사도 조절합니다51. 이 연구에서 ChIP 분석 결과는 TAF7이 Rptor 프로모터에 직접 결합할 수 있음을 보여 주었으며, 이는 TAF7이 Rptor 발현을 시작하기 위해 다른 전사 인자와 협력할 수 있음을 시사합니다. Rptor의 TAF7- 매개 전사 상향 조절 메커니즘에 대해서는 추가 연구가 필요하지만, 우리의 결과는 DNA-PKcs가 TAF7의 인산화를 매개하여 Rptor의 발현을 상향 조절함으로써 mTORC1 활성화를 촉진한다는 것을 나타냅니다.

이전의 여러 연구에서는 mTORC1 신호 전달이 섬유성 신장의 탈분화 상피 세포와 근섬유아세포에서 활성화된다고 보고했습니다9,52. DNA-PK는 DNA 절단에 반응하여 종양 세포에서 AKT/mTOR 신호를 인산화하고 활성화시키는 것으로 보고되었지만 정확한 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 우리의 결과는 TAF7의 DNA-PKcs 매개 인산화가 Raptor의 발현을 상향 조절하여 mTORC1 활성화를 촉진하여 섬유증 신장에서 mTORC1 활성화의 가능한 메커니즘을 제공한다는 것을 보여주었습니다. mTORC1의 만성 활성화는 CKD9,54를 포함한 많은 질병에서 대사 재프로그램을 촉진합니다. 최근 연구에서는 신세뇨관 세포와 섬유아세포 모두 CKD9,10,13에 반응하여 대사 표현형을 변경한다는 사실이 강조되었습니다. 지방산 산화 경로와 산화적 인산화에서 해당과정으로의 전환은 대사 재프로그래밍의 주요 특징입니다. mTOR은 대사 항상성을 유지하는 데 중심적인 역할을 하기 때문에 mTOR를 억제하면 부작용이 나타납니다. 더욱이, TGF-신호전달의 장기간 억제는 허용할 수 없는 부작용과도 연관되어 있습니다57. 이 연구에서 우리는 DNA-PKcs의 활성이 CKD에서의 강력한 향상과 달리 정상적인 신장에서는 거의 감지되지 않음을 발견했습니다. 따라서 DNA-PKcs의 억제는 섬유증 신장의 대사 재프로그램을 교정합니다.

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그림 8|DNA-PK의 삭제는 대사 재프로그래밍을 교정합니다. 표시된 대로 각 그룹의 신장 조직에 대한 대사체학 분석. 각 그룹(n{2}})의 신장 내 해당과정 경로, 지방산 대사 및 크렙스 주기의 대사산물의 상대적 수준을 보여주는 히트맵 이미지. 막대는 각 그룹의 신장 내 대표적인 대사산물의 통계 분석을 나타냅니다(평균 ± SD, 각 그룹의 n= 4마리 마우스). 일원 분산 분석(One-way ANOVA)과 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 p-값을 결정했습니다. b DNA-PKcs가 TAF7의 인산화를 통해 Raptor/mTORC1 신호 전달의 활성화를 중재하고 손상된 상피 세포와 근섬유아세포에서 대사 재프로그래밍을 촉진하는 것을 보여주는 작업 모델(템플릿은 BioRender.com으로 생성됨)입니다.