DNA 의존성 단백질 키나제 촉매 서브유닛(DNA-PKcs)이 수컷 생쥐의 만성 신장 질환 진행을 촉진합니다

신장 손상상피 탈분화와 myo를 시작합니다.fi동안 브로블라스트 활성화만성 신장 질환의 진행. 여기서 우리는fiDNA-PKcs의 발현은 다음과 같습니다.fi에서 눈에 띄게 증가했습니다.만성 신장 질환의 신장 조직환자와 수컷 쥐일측성 요관 폐쇄로 인해 발생그리고일측 허혈-재관류 손상. 생체 내에서 DNA-PKcs의 녹아웃 또는 그 종을 이용한 치료fic 억제제 NU7441은만성 신장 질환의 발병수컷 쥐에서. 시험관 내에서 DNA-PKcs deficiency는 상피 세포 표현형을 보존하고 억제합니다.fi성장 인자-베타 1의 변형에 의해 유도된 세포 모세포 활성화. 또한, 우리의 결과는 DNA-PKcs의 가능한 기질인 TAF7이 RAPTOR 발현을 상향 조절하여 mTORC1 활성화를 향상시키고, 이후 손상된 상피 세포 및 근에서 대사 재프로그래밍을 촉진한다는 것을 보여줍니다.fi브로블라스트. 종합하면, DNA-PKcs는 TAF7/mTORC1 신호 전달을 통해 대사 재프로그래밍을 교정하기 위해 억제될 수 있습니다.만성 신장 질환치료의 잠재적 표적이 될 수 있습니다.만성 신장 질환.

25% acteoside 9% echinacoside cistanche

시스탄체의 약초 제제에 대해 알아보려면 여기를 클릭하십시오.만성 신장 질환

만성 신장 질환(CKD)는 전 세계 성인의 10%에 영향을 미칩니다1. 만성콩팥병은 다음 단계로 진행될 가능성이 높기 때문에 전 세계 공중보건에 큰 부담을 안겨줍니다.말기 신장 질환(ESRD), 투석이나 신장 이식이 필요한 경우1,2. 신장 간질 섬유증은 CKD2-4의 주요 병리학적 특징 중 하나입니다. 신장 섬유증의 많은 병태생리학적 특징은 간경변증 및 심근병증과 같은 다른 섬유증 질환과 공유됩니다5. CKD에는 효과적인 치료법이 없으며, 이는 병리학적 메커니즘에 대한 더 나은 이해가 시급히 필요함을 강조합니다.근본적인 CKD.

손상된 신장에서 간질성 섬유증은 변형 성장 인자-베타 1(TGF- 1), 상피 탈분화 및 근섬유아세포 활성화와 같은 섬유화 촉진 인자의 비정상적인 발현과 관련됩니다2. 간질성 섬유증의 핵심 중재자로서 TGF- 1는 평활근 액틴(-SMA), 피브로넥틴(FN) 및 콜라겐을 포함한 섬유증 유전자의 발현을 활성화할 뿐만 아니라 Warburg 효과와 유사한 대사 재프로그래밍을 촉진합니다. 신장 세포6,7. 최근 새로운 증거에 따르면 대사 조절 장애와 간질성 섬유증 사이의 관계가 입증되었으며, 이는 신장 손상 동안 신장 세포(신세뇨관 상피 세포8,9 및 근섬유아세포10)에서 대사 재프로그래밍이 발생하고 CKD 발병에 기여한다는 사실을 보여줍니다. 신장 세포의 대사 재프로그래밍은 지방산 산화(FAO)의 급격한 감소와 해당작용으로의 대사 전환을 유발하여 면역 세포 침윤 및 간질성 섬유증에 기여합니다7,11,12. 또한, 임상 데이터에 따르면 CKD 환자에서는 대사 및 염증 경로가 조절되지 않는 것으로 나타났습니다7. 유전적 또는 약리학적 방법을 통해 FAO를 복원하거나 해당과정을 억제하면 신장 섬유증의 다양한 동물 모델에서 섬유증이 약화됩니다11,13-15.

대사 재프로그래밍의 분자 메커니즘에서 세포질 세린/트레오닌 단백질 키나제인 포유류 라파마이신 표적(mTOR)은 세포 대사를 조절하고 대사 항상성을 유지하는 역할을 합니다. mTOR의 두 가지 별개의 기능적 복합체가 결합 단백질에 따라 정의되었습니다. MTOR 복합체 1(mTORC1)은 특정 조절자인 RAP TOR과 상호작용하며 라파마이신에 민감합니다. mTOR 복합체 2(mTORC2)는 RICTOR20에 의해 규제됩니다. 만성 mTORC1 활성화는 신장 간질 섬유증을 포함한 다양한 병리학적 조건에서 대사 재프로그래밍을 촉진하지만9,21-23, 특히 간질 섬유증에서 이 활성화를 조절하는 메커니즘은 거의 알려져 있지 않습니다.

25% acteoside 9% echinacoside cistanche

촉매 서브유닛(DNA-PKcs)과 Ku70/80 이종 이량체로 구성된 삼량체 복합체인 DNA 의존성 단백질 키나제(DNA-PK)는 DNA 이중 가닥 절단(DSB)24,25 또는 ROS26에 의해 활성화됩니다. DNA-PK의 잘 알려진 기능은 V(D)J 재조합 중에 생성된 프로그래밍된 DSB를 연결하고 림프구 재조합에 중요한 역할을 하는 NHEJ(비동종 말단 결합)를 중재하는 것입니다25. 결과적으로, DNA-PKcs의 돌연변이는 V(D)J 재조합의 결핍으로 인해 T 및 B 림프구의 발달을 정지시킵니다. 그러나 DNA-PKcs 녹아웃 마우스에서는 성장 지연이나 T 세포 림프종 발생 빈도가 높지 않았습니다. DNA DSB 센서이지만 DNA-PKcs는 NHEJ29에 필요한 것보다 훨씬 높은 수준으로 세포에 축적되는 등 몇 가지 특이한 특성을 가지고 있습니다. 더욱이 DNA-PKcs는 핵과 세포질 모두에 위치합니다. 특이한 특성과 일치하여 최근 증거에 따르면 DNA-PKcs에는 NHEJ31 이외의 추가 기능이 있음이 나타납니다. 예를 들어 전사 인자 USF-1의 DNA-PKcs 매개 인산화는 인슐린에 의해 유도된 지방산 합성을 촉진하고32 DNA-PKcs는 노화 동안 대사 감소를 촉진합니다33. 신진대사 및 노화와 같은 DNA PKcs의 비NHEJ 기능에 대한 연구가 막 시작되었지만 많은 질문에 대한 답이 남아 있습니다31. 또한, phosphoinositide 3-kinase(PI3K) 관련 키나제 중 하나인 DNA-PK가 mTOR 활성화를 조절하는 것으로 밝혀졌습니다34.

이 연구에서 우리의 결과는 DNA-PKcs가 CKD에서 TATA-box 결합 단백질 관련 인자 7(TAF7)의 인산화를 통해 RAPTOR/mTORC1 신호 전달의 활성화를 중재한다는 것을 보여줍니다. DNA-PKcs의 억제는 CKD에서 손상된 상피 세포와 근섬유아세포의 대사 재프로그래밍을 교정합니다. DNA-PKcs는 CKD 치료를 위한 새로운 잠재적 표적이 될 수 있습니다.

결과

DNA-PKcs는 CKD 환자의 신장과 신장 섬유증이 있는 생쥐에서 증가합니다.

DNA-PKcs의 활성은 건강한 및 CKD 인간 신장 조직의 DNA-PKcs(p-DNA-PKcs)에서 S2056 자가인산화의 면역조직화학적 염색으로 분석되었습니다. 신장절제술 샘플의 비종양 부분은 "건강한" 신장 조직으로 사용되었으며, 이는 신장 세포 암종 환자로부터 수집되었습니다. 결과는 이러한 정상 신장 조직에서는 p-DNA-PKcs가 거의 검출되지 않았으나 CKD 인간 신장 조직에서는 p-DNA-PKcs의 단백질 수준이 현저하게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 1a). 생체 내에서 DNA-PKcs 활성과 신장 섬유증의 관련성을 확인하기 위해 신장 섬유증과 관련된 중요 유전자인 피브로넥틴(FN)의 발현을 면역조직화학적 염색으로 분석하였고, 간질성 섬유증의 정도를 분석하기 위해 시리우스 레드 염색도 시행하였다. CKD 환자에서 (그림 1a). 우리의 결과는 p-DNA-PKcs의 단백질 수준과 간질성 섬유증의 정도 사이에 긍정적인 연관성이 있음을 보여주었습니다(P= 0.005, 그림 1b, c). 또한, 이전에 발표된 인간 CKD 마이크로어레이 데이터세트(Nephroseq)를 사용하여 DNA-PKcs의 발현 수준도 분석했습니다. 우리는 DNA-PKcs의 mRNA 수준이 대조군에 비해 48명의 CKD 환자의 신장 생검 조직에서 16-배 이상 유의하게 증가했음을 발견했습니다(보충 그림 1a). 환자의 신장 섬유증 (보충 그림 1b). 또한 p-DNA-PKcs를 Lotus tetragonolobus lectin(LTL)(신장 세뇨관 마커) 또는 -SMA(근섬유아세포의 마커)와 함께 면역형광 공동 염색한 결과 DNA-PKcs가 세뇨관 상피 세포와 CKD 환자의 신장 조직의 근섬유 아세포 (그림 1d, e). 이용 가능한 온라인 신장 단일 세포 RNA 염기서열 분석 데이터베이스(http://humphreyslab.com/SingleCell/)를 분석한 결과 DNA-PKcs mRNA는 신장 세포에서 광범위하게 발현되었으며 대조 신장과 비교하여 인간 당뇨병 신장에서 상향조절된 것으로 나타났습니다(보충 그림). .1c).

DNA-PKcs 활성과 신장 섬유증 발달 사이의 연관성을 추가로 확인하기 위해 우리는 다음으로 신장 섬유증, 일측성 요관 폐쇄(UUO) 및 일측성 허혈-재관류(UIR)의 두 마우스 모델에서 DNA-PKcs의 발현과 활성을 조사했습니다. p-DNA-PKcs의 면역조직화학 염색은 p-DNA PKcs가 UUO 모델의 가짜 대조군과 비교하여 3일째에 현저하게 유도되었으며, 3일부터 3일까지 신장 섬유증이 진행됨에 따라 p-DNA-PKcs의 단백질 수준이 추가로 증가했음을 나타냅니다. 14 (그림 1f). 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 결과는 DNA-PKcs의 전체 단백질 및 mRNA 수준이 가짜 대조군과 비교하여 UUO 마우스의 신장 조직에서도 유의하게 상향조절되었음을 보여주었습니다(그림 1g 및 보충 그림 1e). UIR 마우스에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다 (그림 1h 및 보충 그림 1d, f). DNA-PKcs와 CKD 사이의 잠재적 연관성으로 인해 우리는 CKD에서 DNA PKcs의 역할과 기계적 의미를 더 조사하게 되었습니다.

생쥐에서 CKD의 DNA-PKcs 매개 진행

다음으로, 우리는 방법(보충 그림 2a)에 설명된 대로 CRISPR/cas9를 사용하여 DNA-PKcs 암호화 유전자 Prkdc가 녹아웃된 DNA-PKcs 녹아웃 마우스를 만들었습니다. DNA-PKcs 이형접합성(+/-) 및 동형접합성(-/-) 녹아웃 및 야생형(WT) 마우스는 보충 그림 2a에 표시된 것처럼 유전자형 분석으로 구별되었습니다. Prkdc mRNA(보조 그림 2c)와 DNA-PKcs 단백질 수준(그림 2e)은 DNA-PKcs-/-마우스의 신장 조직에서 검출되지 않았으며 이는 마우스에서 DNA-PKcs가 성공적으로 녹아웃되었음을 나타냅니다. 신장 손상 및 섬유증에 대한 DNA-PKcs 녹아웃 전략의 효과를 평가하기 위해 성인(6~8주령) DNA-PKcs-/- 및 WT 대조 수컷 마우스에 UUO를 실시하고 수술 후 7일에 안락사시켰습니다. PAS 염색은 UUO에 의해 유발된 세뇨관 위축 및 확장의 정도가 WT 대조군에 비해 DNA-PKcs-/-마우스에서 현저하게 개선되었음을 보여주었습니다(그림 2a). 신장 섬유증은 관찰 된 바와 같이 WT 마우스에 비해 DNA-PKcs-/-마우스에서도 크게 개선되었으며 Masson 염색으로 정량화되었습니다 (그림 2b). 간질 콜라겐 I 침착 및 -SMA에 대한 면역 표지 이미지는 WT 대조군과 비교하여 DNA-PKcs-/-마우스의 UUO 신장에서 두 가지 고전적인 섬유화 마커가 모두 유의하게 감소되었음을 보여줍니다 (그림 2c, d). FN 및 -SMA를 포함한 섬유화 마커의 단백질 수준도 웨스턴 블롯으로 분석한 바와 같이 DNA-PKcs-/-마우스의 UUO 신장에서 유의하게 감소했습니다(그림 2e). QRT-PCR 분석에 따르면 생쥐에서 DNA-PKcs를 녹아웃시키면 UUO 신장에서 크게 상향 조절되는 Col1a1, Col3a1, Fn1 및 Acta2를 비롯한 중요한 신장 섬유증 유전자의 발현 수준이 현저하게 감소하는 것으로 나타났습니다. 섬유증 감소와 일치하여 DNA PKcs 녹아웃은 UUO에 의해 유도된 신장 손상 마커 KIM-1의 mRNA 수준도 감소시켰습니다(보충 그림 2c). 더욱이, 염증은 신장 섬유증의 주요 특징이며 신장 섬유증의 발병에 중요한 역할을 합니다. 따라서 우리는 qRT-PCR을 통해 사이토카인 Il1, Il6, Tnf 및 Mcp1을 포함한 염증 관련 마커를 분석했습니다. UUO 모델에서 우리는 UUO에 의해 유도된 염증성 사이토카인의 상향 조절이 DNA-PKcs 녹아웃에 의해 현저하게 감소됨을 발견했습니다(보충 그림 2c). 임상 연구와 동물 모델 모두 대식세포와 신장 섬유증의 정도 사이에 강한 상관관계가 있으므로, UUO신장 조직의 침윤된 대식세포를 대식세포 마커 F4/80에 대한 면역조직화학적 염색으로 평가했습니다. 이미지는 UUO 7일 후 WT 마우스의 막힌 신장에 많은 침윤된 대식세포를 나타냈는데, 이는 DNA-PKcs 녹아웃에 의해 현저하게 감소되었습니다(그림 2f). 흥미로운 DNA-PKcs

신장 섬유증에 대한 신장 관형 DNA-PKcs의 영향을 추가로 평가하기 위해 우리는 CRISPR/cas9 녹인 마우스를 사용하여 생체 내에서 특정 DNA-PKcs 녹아웃이 있는 근위 신장 관형 상피 세포를 만들었습니다(보충 그림 2e, f). DNA-PKcs에 대한 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 3주 동안 피막하 주사한 후 근위 신세뇨관 세포 특이적 DNA-PKcs 녹아웃 마우스를 UUO에 적용하고 수술 후 7일에 안락사시켰습니다. DNA-PKcs의 면역형광 염색은 신세뇨관 세포에서 DNA-PKcs가 없음을 보여주었지만(그림 2h) AAV-gRNA가 주입된 cas9 마우스의 -SMA 양성 근섬유아세포(보충 그림 2g)에서는 여전히 발현되었습니다. DNA PKcs에 대한 gRNA 없이 AAV를 주사한 cas9 마우스의 경우. 웨스턴 블롯 분석 결과, AAV-sgRNA가 주입된 cas9 마우스의 UUO 신장에서 DNA PKcs와 FN 및 -SMA를 포함한 전섬유증 마커의 단백질 수준이 대조군에 비해 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 2g). . UUO 모델과 유사하게 DNA-PKcs 녹아웃 마우스도 UIR 유발 CKD로부터 보호되었습니다 (보충 그림 2h-m). 함께, 이러한 결과는 DNA-PKcs의 결실이 생쥐에서 CKD의 진행을 약화시킨다는 것을 시사합니다.

신장에서 DNA-PKcs의 과발현이 신장 섬유증을 유발하기에 충분한지 여부를 확인하기 위해 인간 DNA-PKcs 과발현 플라스미드(Addgene: 83317)를 여러 이전 연구에서 설명한 대로 꼬리 정맥 고압 주입 방법을 통해 마우스 신장에 전달했습니다. DNA-PKcs 플라스미드 주입 후 36시간 후에 마우스에게 7일 동안 UUO 수술을 실시했습니다. 종합적으로, 우리의 결과는 인간 DNA-PKcs의 이소성 발현이 생체 내에서 신장 섬유증의 진행을 유도하기에 충분하다는 것을 나타냅니다 (보충 그림 3).

25% acteoside 9% echinacoside cistanche

DNA-PKcs 활성 억제는 생쥐에서 CKD 발병을 약화시킵니다

이러한 발견으로 인해 우리는 DNA PKcs 억제제가 신장 섬유증을 예방하는 데 사용될 수 있다는 가능성을 고려하게 되었습니다. 우리의 가설을 테스트하기 위해 성인(6~8주령) WT 수컷 생쥐를 UUO 수술 후 1일부터 매우 특이적인 DNA-PKcs 억제제 NU7441로 매일 치료했습니다. NU7441- 처리 및 대조 마우스는 UUO 수술 후 7일에 안락사되었으며, 면역조직화학적 염색으로 DNA-PKcs 활성을 분석한 결과, NU7441 처리는 UUO 신장 조직에서 DNA-PKcs의 활성화를 현저하게 억제하는 것으로 나타났습니다. 그림 3a). UUO에 의해 유발된 세뇨관 위축 및 확장 정도는 PAS 염색에서 볼 수 있듯이 비히클 대조군에 비해 NU7441 처리 후 크게 개선되었습니다(그림 3b). Masson 염색의 조직병리학적 분석에서는 비히클 대조군 UUO 신장과 비교하여 NU{14}} 처리된 마우스의 폐색된(UUO) 신장에서 신장 간질 섬유증이 약 50% 감소한 것으로 나타났습니다(그림 3c). 면역형광 염색 이미지는 UUO에 의해 유도된 간질 콜라겐 I의 침착이 NU7441 처리에 의해 현저하게 감소되었음을 보여주었습니다(그림 3e). 웨스턴 블롯으로 분석한 FN 및 -SMA를 포함한 섬유화 촉진 마커의 단백질 수준도 비히클 대조군과 비교하여 NU{19}} 처리 마우스의 UUO 신장에서 유의하게 감소했습니다(그림 3f). QRT-PCR 분석에 따르면 NU7441 치료는 비히클 대조군과 비교하여 UUO 생쥐의 신장 조직에서 Col1a1, Col3a1, Fn1 및 Acta2를 포함한 중요한 신장 섬유증 유전자의 발현 수준을 현저하게 감소시키는 것으로 나타났습니다 (보충 그림 4a). 또한 UUO 생쥐의 신장 조직에서 대 식세포의 침윤은 비히클 대조군과 비교하여 NU7441 처리 후 크게 감소했습니다 (그림 3d). NU7441은 또한 qRT-PCR로 분석한 바와 같이 UUO 마우스의 신장 조직에서 사이토카인 Il1, Il6, Tnf 및 Mcp1을 포함한 염증 관련 마커의 발현 수준을 감소시켰습니다(보충 그림 4a). 또한, DNA PKcs 녹아웃 마우스도 NU7441로 처리하여 NU7441의 가능한 오프 타겟을 조사했습니다. 우리의 결과는 NU7441이 DNA-PKcs 녹아웃 마우스에서 명백한 항섬유증 효과를 나타내지 않았음을 보여 주었으며(그림 3g, h), 이는 이 실험 환경에서 DNA-PKcs에 대한 NU7441의 특정 작용을 시사합니다.

UUO 유발 신장 손상 및 신장 섬유증에 대한 NU7441의 보호 효과는 UIR 유발 CKD까지 확장되었습니다. 예상대로 NU7441 치료는 비히클 대조군과 비교하여 UIR로 인한 신장 손상 및 섬유증을 예방했습니다 (보충 그림 4b-h). 함께, 이러한 결과는 NU7441에 의한 DNA-PKcs 활성의 억제가 생쥐의 CKD 진행을 약화시킨다는 것을 나타냅니다.

25% acteoside 9% echinacoside cistanche

그림 3|DNA-PKcs 활성의 억제는 UUO 마우스에서 CKD의 발달을 약화시킵니다. NU7441(40mg/kg) 또는 UUO를 처리한 비히클(7일차)로 처리된 마우스의 신장에서 p-DNA-PKcs의 면역조직화학적 염색, 눈금 막대: 20μm. 막대는 정량 결과를 나타냅니다(평균 ± SD, 각 그룹의 n= 6마리 마우스). b NU7441 또는 UUO를 적용한 비히클로 처리된 마우스 신장의 PAS 염색, 눈금 막대: 50μm. 막대는 정량 결과를 나타냅니다(평균 ± SD, 각 그룹의 n= 6 마우스). c NU7441 또는 UUO를 적용한 비히클로 처리한 생쥐의 신장에 대한 Masson 염색, 눈금 막대: 50μm. 막대는 정량 결과를 나타냅니다(평균 ± SD, 각 그룹의 n= 6 마우스). d NU7441 또는 UUO 처리된 비히클로 처리된 마우스의 신장에서 F4/80의 면역조직화학적 염색, 눈금 막대: 20μm. 막대는 정량 결과를 나타냅니다(평균 ± SD, 각 그룹의 n= 6 마우스). e NU7441 또는 UUO 처리된 비히클로 처리된 마우스의 신장에서 COL1A1의 면역형광 염색, 스케일 바: 20μm. 막대는 정량 결과를 나타냅니다(평균 ± SD, 각 그룹의 n= 6 마우스). f NU7441 또는 UUO를 처리한 비히클로 처리한 생쥐의 신장에서 FN 및 -SMA의 단백질 수준. 막대는 정량 결과를 나타냅니다(평균 ± SD, 각 그룹의 n= 6 마우스). g DNA-PKcs-/- 또는 NU7441 또는 UUO를 받은 비히클로 처리된 WT 마우스의 신장에서 FN 및 -SMA의 단백질 수준. 막대는 정량 결과를 나타냅니다(평균 ± SD, 각 그룹의 n= 6 마우스). h DNA-PKcs-/-또는 NU7441 또는 UUO를 처리한 비히클로 처리된 WT 마우스의 신장에 대한 시리우스 레드 염색. 막대는 정량 결과를 나타냅니다(평균 ± SD, 각 그룹의 n= 6 마우스). a, c, e에 대한 p-값을 결정하기 위해 양측 unpaired t-test를 사용했습니다. 일원 분산 분석(One-way ANOVA)과 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 b, d, h에 대한 p-값을 결정했습니다. 양방향 ANOVA와 Šídák의 다중 비교 테스트를 사용하여 f, g에 대한 p-값을 결정했습니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

25% acteoside 9% echinacoside cistanche

DNA-PKcs의 억제는 관형 상피 세포 표현형을 보존하고 체외에서 간질 섬유 아세포 활성화를 조절합니다

상피 손상과 근섬유아세포 활성화는 CKD2 발병의 핵심 사건입니다. 면역 염색 결과 p-DNAPKcs는 HK-2 세포(그림 4a)와 일차 관형 상피 세포(보충 그림 5a) 모두에서 TGF 1 자극에 의해 분명히 유도되는 것으로 나타났습니다. 웨스턴 블롯 결과는 DNA-PKcs의 인산화 및 총 단백질 수준이 TGF 1 또는 H2O2 처리된 HK-2 세포에서도 유의하게 상향조절되었음을 보여주었습니다(그림 4i 및 보충 그림 5b). 또한 CRISPR-Cas9를 사용하여 DNA-PKcs 녹아웃 HK-2 세포를 생성하고 WT 및 DNA-PKcs-/- 마우스 일차 관형 상피 세포를 배양했습니다. DNA-PKcs 녹아웃 HK-2 세포의 성공적인 구성은 Western blotting으로 확인되었습니다 (보충 그림 5c). 우리의 결과는 NU7441에 의한 DNA-PKcs의 녹아웃 또는 DNA-PKcs의 억제가 신장 상피 세포의 탈분화를 개선했음을 보여주었습니다. 이는 DNA-PKcs 녹아웃 또는 NU{{27에서 TGF1에 노출된 후 FN 및 Col1A1 생산 수준이 낮아지는 것으로 나타났습니다. }}처리된 세포(그림 4b-d, k, l). 그러나 KU80 녹아웃은 관형 상피 세포에서 TGF1에 의해 유도된 FN 생산을 증가시켰습니다(그림 4m). UUO 모델과 마찬가지로 DNA-PKcs 녹아웃은 H2O2에 의해 유도된 HK-2 세포의 DNA 파손을 악화시키지 않았습니다(보충 그림 5d). KU70/80은 먼저 DSB에서 DNA 파손된 끝을 인식한 다음 DNA-PKcs를 모집하여 NHEJ37을 통해 DSB 복구에 필요한 DNA-PK를 형성합니다. 이러한 결과는 DNA-PKcs가 DSB 복구 기능과 관계없이 CKD에서 신장 상피 세포의 섬유화 촉진 작용을 강화했음을 시사합니다.

DNA-PKcs가 간질성 섬유아세포의 활성화 및 증식에 관여하는지 여부를 조사하기 위해 배양했습니다. 웨스턴 블롯 결과는 DNA-PKcs의 인산화 및 총 단백질 수준이 TGF 1 처리된 NRK{3}}F 세포에서도 유의하게 상향조절되었음을 보여주었습니다(그림 4j). 면역염색 결과, NRK-49F 세포에서 TGF 1 처리에 의해 DNA-PKcs의 활성이 현저하게 유도되었으나(그림 4e), NU7441 처리에 의해 현저하게 억제되는 것으로 나타났습니다. TGF 1로 NRK{10}}F 세포를 처리하면 COL1, -SMA 및 FN의 상향 조절로 섬유아세포 활성화 및 근섬유아세포 분화가 유도되는 반면, NU7441로 전처리하면 전섬유화 표현형이 크게 둔화됩니다(그림 4f, g, n). 또한, NU7441 처리는 EdU 염색으로 알 수 있듯이 비히클 대조군과 비교하여 TGF 1에 의해 유도된 NRK{17}}F 세포 증식을 유의하게 억제했습니다(그림 4h). 종합하면, 이들 데이터는 DNA-PKcs의 억제가 관형 상피 세포 표현형을 보존하고 시험관 내에서 TGF1에 의해 유도된 간질성 섬유아세포 활성화를 조절한다는 것을 나타냅니다.

또한 TGF 1-유도 DNA-PKcs 발현 메커니즘도 조사했습니다. 첫째, JASPAR 전사 인자 결합 프로파일 분석을 통해 DNA-PKcs의 프로모터 영역에서 SMAD2의 여러 가능한 결합 부위를 발견했습니다. 둘째, 루시퍼라제 분석 결과 SMAD2의 과발현이 DNA-PKcs의 전사 활성화를 증가시키는 것으로 나타났습니다(보충 그림 5e) . 또한 SMAD 신호 전달 활성화에 대한 DNA-PKcs의 효과도 분석되었습니다. 결과는 DNA-PKcs 녹아웃이 UUO 마우스 모델에서 SMAD2/SMAD3의 활성화를 억제한다는 것을 보여주었습니다(보충 그림 5f). 이러한 결과는 SMAD2/SMAD3가 DNA PKcs 발현을 상향조절한 반면, DNA-PKcs는 SMAD2/SMAD3(보충 그림 5g)을 활성화하여 양성 루프를 형성했음을 시사합니다.

Wecistanche의 지원 서비스 - 중국 최대의 cistanche 수출업체:

이메일:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/전화:+86 15292862950

더 많은 사양을 보려면 쇼핑하세요.

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop (영어)