칼슘 옥살레이트 신장 결석 형성 과정에 대한 디오스민의 이중 조절 효과: 결정화, 성장, 응집, 결정 세포 접착, 신장 세뇨관 세포로의 내재화 및 세포외 기질을 통한 침입
Mar 16, 2022
자세한 정보:ali.ma@wecistanche.com
수파폰 캄춘a,b,c,1, 유디순이사a,1, 비쓰 통분커드a,*
aMedical Proteomics Unit, Office for Research and Development, 의학부 Siriraj 병원, Mahidol University, Bangkok 10700, Thailand
b태국 Phayao 56000, University of Phayao, 연합 보건 과학 학교 의료 기술과
c통합 분자 생물 의학의 우수 단위, 연합 보건 과학 학교, Phayao 대학, Phayao 56000, 태국
키워드: 생리활성화합물, 플라보노이드, 억제제, 조절제, 신장결석, 촉진제, 요로결석
요약
디오스민여러 약리학적 활성을 가진 과일과 식물에서 발견되는 천연 플라본 배당체(바이오플라보노이드)입니다. 그것은 다양한 질병/장애에서 건강 보조 식품 또는 치료제로 널리 사용되었습니다. 권장되지만 에 대한 보호 메커니즘의 증거신장결석병(신결석/요로결석), 특히 가장 흔한 유형인 옥살산칼슘(CaOx) 일수화물(COM)에 대해서는 불분명한 상태로 남아 있습니다. 따라서 이 연구에서 우리는 다음과 같은 효과를 체계적으로 평가했습니다.디오스민(2.5–160 nM에서) 다양한 단계에서신장COM 결정화, 결정 성장, 응집, 결정 세포 접착, 신세뇨관 세포로의 내재화 및 세포외 기질(ECM)을 통한 침입을 포함한 돌 형성 과정. 결과는디오스민언급된 모든 COM 신장 결석 과정에 용량 의존적 조절 효과가 있었습니다.디오스민결정화 동안 COM 결정 수와 질량은 크게 증가했지만 결정 크기와 성장은 감소했습니다. 하는 동안디오스민결정 응집을 촉진하여 결정 세포 접착 및 신세뇨관 세포로의 내재화를 억제합니다. 마지막으로 diosmin은 ECM을 통해 크리스탈 침공을 촉진했습니다. 우리의 데이터는 COM에 대한 diosmin의 억제 및 촉진 효과를 모두 입증하는 증거를 제공합니다.신장돌 형성 과정. 이러한 diosmin의 이중 조절 활성에 근거하여 항요로결석증의 역할이 의심스럽고 다음과 같은 경우 사용에 주의가 필요하다.신장돌병.
1. 소개
디오스민(3',5,7-트리하이드록시-4'-메톡시플라본-7-람노글루코사이드)는 다양한 식물과 과일, 주로 감귤류에서 흔히 발견되는 천연 바이오플라보노이드입니다. [1,2]. 그것은 합성되거나 다른 플라보노이드인 헤스페리딘에서 파생될 수 있습니다[1,2]. Diosmin 단독 또는 hesperidin과의 조합은 만성 정맥 기능 부전 및 치질과 같은 정맥 및 림프계 질환의 치료를 위한 사혈제로 널리 사용됩니다[3,4]. 또한, diosmin은 항산화 및 항염증 활성[5,6], 항돌연변이 및 항종양 특성[7,8], 항생제 효과[9], 항고혈당 특성[9]을 포함한 여러 생물학적 및 약리학적 활성을 나타냅니다. 10] 및 다기관 손상에 대한 보호 효과, 즉,
심혈관 [11], 망막 [12],신장, 간 및 뇌 손상 [13].
신장결석병(또는 신결석/요로결석)은 신장 내부에 발달되어 침착된 고형 결석에 의해 발생하며 높은 재발률로 전 세계 모든 지역에서 인간에게 영향을 미칩니다[14-17]. 모든 다양한 원인 결정 중에서 옥살산칼슘(CaOx), 특히 일수화물 형태(COM)는 결석 형성자(신장 결석 환자)에서 발견되는 가장 병원성이며 가장 흔한 결정 성분입니다[18]. 기계적으로 COM 결정체는 신세뇨관 상피세포에 가장 강력한 접착력과 세포독성 효과를 가지고 있다[19,20]. 결석 발병 과정에서 Randall의 플라크 모델과 세뇨관 내 가설 모두 COM 결정화, 성장, 응집, 신세뇨관 세포 또는 신우에 대한 표면 접착에 의한 유지, 세포 내로의 내재화 및 침습을 포함한 COM 결석 형성 과정의 공통된 특징을 가지고 있습니다. 세포외 기질(ECM)을 통한 신장 간질[21,22].
최근, 새로운 및/또는 재발성 결석 형성의 예방을 목적으로 약용 식물/과일 및 이들의 생리활성 화합물을 사용한 약물 발견에 많은 연구가 집중되었습니다. 다수의 이전 보고서에 따르면 일부 생리활성 화합물, 특히 여러 약용 식물/과일에서 추출한 페놀성 화합물(폴리페놀, 플라보노이드, 플라본 배당체 등)이신장시험관 내 및 생체 내 모두에서 돌병[23-25]. 이러한 유익한 물질 중 일부 보고서에서는 diosmin이 동물 모델에서 신장 조직 내부의 CaOx 결정 침착을 방지할 수 있다고 제안했습니다[26,27]. 그러나 COM 신장 결석 형성에서 그것의 정확한 조절 역할(억제 또는 촉진)과 메커니즘(단계 또는 결석 형성 과정)은 조사되지 않았습니다. 따라서 본 연구는 다음의 효과를 체계적으로 평가했습니다.디오스민(2.5–160 nM에서) 다양한 단계에서신장결정화, 결정 성장, 응집, 결정 세포 접착, 신세뇨관 세포로의 내재화 및 ECM을 통한 침입을 포함한 돌 형성 과정.
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2. 재료 및 방법
2.1. 디오스민 제제
디오스민(Tokyo Chemical Industry; Tokyo, Japan)를 100% 디메틸 설폭사이드(DMSO)(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)에 용해시키고 최종 농도 2.5, 5, 10, 20, 40, COM 결정에 미치는 영향을 조사하기 위한 80 및 160 nM. 또한 모든 실험에서 음성대조군으로 100% DMSO를 사용하였다.
2.2. 세포 배양
네프론의 원위 세뇨관 분절(ATCC; Manassas, VA)에서 유래된 MDCK 신장 세뇨관 상피 세포주를 10% 소태아혈청(FBS)이 보충된 Eagle's minimum essential medium(MEM)(Gibco; Grand Island, NY)에서 증식시켰다. 60U/ml 페니실린 G(Sigma-Aldrich) 및 60ug/ml 스트렙토마이신(Sigma-Aldrich). 세포는 37℃에서 5% CO2가 있는 가습 인큐베이터에서 유지되었습니다.
2.3. COM 결정화 분석
COM 결정화는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[28,29]. 요약하면, 결정화 완충액(10mM Tris-HCl 및 90mM NaCl 함유)(pH 7.4) 중 500ul의 10mM CaCl2·2H2O를 24-웰 플레이트(Corning Inc.; Corning, 뉴욕). 동일한 부피(4 ul)의 결정화 완충액(공백 대조군), DMSO(음성 대조군) 또는디오스민(2.5, 5, 1{11}}, 2{20}}, 40, 80 또는 160 nM)을 CaCl2와 혼합했습니다. 마지막으로, 결정화 완충액에 500ul의 1.0mM Na2C2O4를 첨가하여 CaCl2 및 Na2C2O4의 최종 농도를 각각 5mM 및 0.5mM이 되도록 하였다. 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 배양한 다음 검사하였다. 결정 이미지는 Nikon Eclipse Ti-S 도립 위상차 광학 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)에서 최소 15개의 고배율 필드(HPF)에서 무작위로 캡처되었습니다. NIS Element D 소프트웨어 버전 4.11(Nikon)을 사용하여 각 샘플에 대해 최소 15개의 HPF에서 결정 크기와 수를 측정했습니다. 결정질량은 다음 공식을 사용하여 15개 HPF의 최소 100개 결정에서 계산되었습니다. 결정질량(µm2/HPF)=각 필드의 평균 결정 크기(µm2) × 각 필드의 결정 수(/HPF) 1)
2.4. COM 결정 성장 분석
결정 성장 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[30,31].
간단히 말해서, 결정화 완충액에 10mM CaCl2⋅2H2O 및 1.0mM Na2C2O4의 동일한 부피(500 ul)를 { {12}}웰 플레이트. 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 완전한 결정화를 허용했습니다. 이 시점(T0)에서 동일한 부피(4 ul)의 결정화 완충액(공백 대조군), DMSO(음성 대조군) 또는디오스민(2.5, 5, 1{{1{15}}}, 20, 40, 80 또는 160 nM)을 각 웰에 첨가하고 혼합물을 60분 동안 추가로 인큐베이션하였다(T60). T0 및 T60에서 결정 이미지는 Nikon Eclipse Ti-S 도립 위상차 광학 현미경으로 최소 15개의 HPF에서 무작위로 캡처되었습니다. T0 및 T60에서의 결정 크기는 NIS Element D 소프트웨어 버전 4.11(Nikon)을 사용하여 측정한 반면, 결정 성장(Δ Crystal 크기로 표시)은 다음 공식을 사용하여 15개 HPF의 최소 100개 결정에서 계산되었습니다.=T60에서의 결정 크기 - T0에서의 결정 크기(2)
2.5. COM 결정 응집 분석
결정 응집 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[32,33]. COM 결정은 결정 성장 분석에서 위에서 언급한 대로 생성되었지만 50-ml 원뿔형 튜브(Corning Inc.)에서 더 큰 부피로 생성된 다음 2000g에서 5분 동안 원심분리하여 수확했습니다. 상층액은 버리고 COM 결정은 메탄올로 3회 세척하였다. 2000g에서 5분 동안 다시 원심분리한 후 메탄올을 버리고 결정을 25℃에서 밤새 공기 건조시켰다. COM 결정(건조 중량 1000μg)을 {{11}웰 플레이트(Corning Inc.)의 각 웰에 있는 1ml의 결정화 완충액에 재현탁했습니다. 동일한 부피(4 ul)의 결정화 완충액(공백 대조군), DMSO(음성 대조군) 또는디오스민(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 또는 160 nM)을 각 웰의 COM 결정 현탁액에 첨가했습니다. 플레이트를 150 rpm 및 25℃에서 1시간 동안 진탕 배양기(Zhicheng; Shanghai, China)에서 연속적으로 진탕시켰다. 그 후, COM 결정 집합체("밀접하게 결합된 3개 이상의 개별 COM 결정의 집합체"[32]로 정의됨)의 형성을 검사하고 Nikon Eclipse Ti-S 도립 위상차 광학 현미경으로 이미지화했습니다. COM 결정 응집체의 수는 웰당 최소 15개의 무작위 HPF에서 계산되었습니다.
2.6. COM 결정 세포 접착 분석
결정 세포 접착 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[34,35]. 간단히 말해서, COM 결정은 위에서 언급한 대로 50-ml 원뿔형 튜브에서 생성된 다음 2000g에서 5분 동안 원심분리하여 수확했습니다. 상층액은 버리고 COM 결정은 메탄올로 3회 세척하였다. 2000g에서 5분 동안 다시 원심분리한 후 메탄올을 버리고 결정을 25℃에서 밤새 공기 건조시켰다. 결정은 세포에 개입하기 전에 30분 동안 UV 광선으로 오염을 제거했습니다.
MDCK 세포(2 × 105 cells/well의 밀도)를 6-웰 플레이트(Corning Inc.)의 각 웰에 48시간 동안 파종하고 성장시켜 컨플루언트 단층을 얻었다. 그런 다음 COM 결정(배양 배지 ml당 건조 중량 결정 100μg)을 추가하기 전에 배양 배지를 새로 고쳤습니다. 동일한 부피(4 ul)의 결정화 완충액(공백 대조군), DMSO(음성 대조군) 또는디오스민(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 또는 160 nM)을 각 웰에 첨가했습니다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 추가로 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 PBS로 5회 격렬하게 세척하고 Nikon Eclipse Ti-S 도립 위상차 광학 현미경으로 이미지화하였다. 세뇨관 세포 표면에 부착된 나머지 COM 결정의 수는 웰당 최소 15개의 무작위 필드에서 계산되었습니다.
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2.7. COM 결정 내재화 분석
형광 표지된 COM 결정은 이전에 설명한 대로 생성되었습니다[36,37]. 결정화에 사용된 화학 물질의 조성/농도는 일반(비표지) 결정에 대해 위에서 언급한 것과 동일하지만 0.1 µg/ml 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL)는 Na2C2O4와 혼합하기 전에 CaCl2⋅2H2O 용액에 첨가합니다. 후속 단계(결정화 및 수확)는 위에서 언급한 바와 같이 수행되었지만 어둠 속에서 수행되었습니다.
신세뇨관 상피 세포로의 결정 내재화를 평가하기 위해 MDCK 세포(2 × 105 cells/well의 밀도)를 6-웰 플레이트(Corning Inc.)의 각 웰에 파종하고 48시간 동안 성장시켜 얻었다. 합류 단층. 세포 단층을 37℃에서 1시간 동안 5% CO2가 포함된 가습 배양기에서 FITC 표지 COM 결정(1{14}} µg crystal/ml 배지)과 함께 배양했습니다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고 트립신-EDTA 용액과 함께 배양하여 내부화되지 않은(부착 및 비부착) 결정을 제거하였다. 결정이 내재화된 세포의 백분율은 유세포 분석기(BD Accuri C6)(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 총 10,000개의 획득 이벤트에서 정량화되었습니다. 일반(표지되지 않은) COM 결정과 함께 배양된 세포는 양성 형광 신호에 대한 잡음 및 임계값을 사전 설정하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 양성 형광 신호가 있는 세포를 계수하고 이러한 백분율 계산에 사용했습니다.
2.8. ECM 분석을 통한 COM 결정 침습
COM 결정은 결정 응집 및 결정 세포 접착 분석에 대해 위에서 설명한 대로 제조되었습니다. 결정 침습 분석은 이전에 확립된 프로토콜에 따라 수행되었습니다[38,39]. 간단히 말해서, 결정화 완충액(공백 대조군), DMSO(음성 대조군), 알부민(Sigma-Aldrich)(양성 대조군)으로 코팅된 총 20μg COM 결정 또는디오스민(2.5, 5, 1{{1{19}}}}, 20, 40, 80 또는 160nM)을 200ul MEM에 첨가했습니다. 이어서 PBS에 녹인 0.3 pM Lys-plasminogen(Fitzgerald Industries International; Acton, MA) 200 ul를 혼합하고 결정-단백질 복합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 결합되지 않은 플라스미노겐을 2000g에서 5분 동안 원심분리하여 폐기하고 펠렛을 PBS로 1회 세척하였다. 그 후, PBS 중 100 ul의 0.15 pM 유로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA)(Fitzgerald Industries International)를 결정-단백질-플라스미노겐/플라스민 복합체와 혼합하였다. 그런 다음 혼합물을 ECM 이동 챔버 내부의 매트릭스 겔 위에 추가하고 37℃에서 배양했습니다. 24-시간 인큐베이션 후, 마이그레이션 챔버 상부에 남아있는 용액을 거즈 또는 티슈 페이퍼를 사용하여 제거했습니다. 매트릭스 겔 내부에 침입한 COM 결정은 DIC(Differential Interference Contrast) 모드(Nikon H600L)가 있는 광학 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다. NIS Element D 소프트웨어 버전 4.11(Nikon)을 사용하여 동일한 챔버 내에서 최소 15개의 저전력 필드(LPF)에서 크리스탈 침입 거리는 측정하고 평균을 냈습니다.
2.9. 통계 분석
위의 모든 실험은 삼중(3개의 독립적인 실험)으로 수행되었으며 정량적 데이터는 평균 ± SEM으로 보고됩니다. Tukey의 사후 검정과 함께 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 다중 비교를 수행했습니다. 변수 간의 관계를 확인하기 위해 Pearson 상관관계 검정을 수행했습니다. 모든 통계 분석은 SPSS 소프트웨어(버전 18)(IBM SPSS; Armonk, NY)를 사용하여 수행되었습니다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
3. 결과
3.1. COM 결정화에 대한 디오스민의 영향
결정화는 필수적인 초기 단계 중 하나입니다.신장모든 유형의 석재 형성 과정. 1-시간 결정화 후디오스민다양한 농도(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 또는 160nM)에서 COM 결정 크기 및 개수를 측정하고 결정 질량을 계산했습니다. 결정화 완충액 및 희석제 DMSO는 각각 블랭크 및 음성 대조군으로 사용되었습니다. 데이터는 disomin의 모든 용량(2.5-160nM)이 블랭크 및 음성 대조군과 비교할 때 결정 크기를 유의하게 감소시켰지만 결정 수를 용량 의존적으로 증가시켰다는 것을 보여주었습니다(그림 1A-1C). 결정수에 따라 결정질량은 용량 의존적으로 증가하였다(Fig. 1D). 전반적으로, 이러한 데이터는 diosmin이 COM 결정화(신결정)를 촉진함을 나타냅니다.
3.2. COM 결정 성장에 대한 디오스민의 영향
의 조절 효과디오스민COM 결정 성장에 대한 평가는 신결정이 없는 경우 초기 결정화 단계 완료 후 추가 배양 60-후 결정 크기(Δ 결정 크기)의 변화를 측정하여 평가했습니다. 결과는 disomin의 모든 용량(2.5-160nM)이 블랭크 및 음성 대조군과 비교하여 용량 의존적 방식으로 Δ 결정 크기를 유의하게 감소시킴을 입증했습니다(그림 2). 이러한 발견은 diosmin이 COM 결정 성장을 억제한다는 것을 나타냅니다.
3.3. COM 결정 응집에 대한 디오스민의 영향
결정 성장 외에도 서로 단단히 접착되는 개별 결정의 응집은신장돌 병인. 높은 수준의 결정 응집은 궁극적으로 결석 확대 및 작은 신세뇨관 내강의 폐쇄로 이어질 수 있습니다. 공백 및 음성 대조군과 비교하여,디오스민10-160nM에서 용량 의존적으로 COM 결정 응집체의 수가 증가했습니다(그림 3). 이러한 결과는 diosmin이 COM 결정 응집을 촉진함을 나타냅니다.
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3.4. COM 결정 세포 접착에 대한 디오스민의 효과
원인 결정체의 보유는 다음의 중요한 단계 중 하나입니다.신장결석 형성은 결정이 소변 유출과 함께 배출되는 것을 방지하는 결정 세포 접착에 의해 유도될 수 있습니다. 따라서 우리는 의 조절 활동을 평가했습니다.디오스민COM 크리스탈 셀 접착. 데이터는 5-160nM의 diosmin이 빈 및 음성 대조군과 비교하여 용량 의존적 방식으로 신장 세뇨관 세포에 대한 COM 결정의 접착 능력을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 4). 이러한 데이터는 diosmin이 COM 결정 세포 접착을 억제한다는 것을 나타냅니다.
3.5. 신장 세뇨관 세포로의 COM 결정 내재화에 대한 디오스민의 효과
부착 후 일부 COM 결정은 신세뇨관 세포로 내재화될 수 있으며 여러 후속 세포 반응을 일으킬 수 있습니다[37,40]. 결정 내재화는 FITC-표지된 COM 결정을 사용하여 평가하고 유세포 분석에 의해 정량화했습니다. 일반 COM 결정(레이블 없음)을 사용하여 기술적 노이즈를 빼고 형광 강도가 FITC 신호에서 나온 것인지 확인했습니다. 블랭크 및 음성 대조군과 비교하여, 결정이 내재화된 세포의 백분율은디오스민10–160nM에서 용량 의존적 방식으로(그림 5). 이 발견은 disomin이 신장 세뇨관 세포로의 COM 결정 내재화를 억제한다는 것을 나타냅니다.
3.6. ECM을 통한 COM 결정 침습에 대한 디오스민의 영향
ECM을 통한 수정 침습은 병원성/파괴적 과정입니다.신장다양한 염증 반응과 캐스케이드를 유발하여 질병 기전을 악화시킬 수 있는 결석 발병. 우리는 결정-단백질 복합체의 플라스미노겐-플라스민 활성에 기반한 확립된 프로토콜을 사용하여 이 현상을 조사했습니다[38,39]. 결과는 모든 용량의 디소민(2.5-160nM)이 용량 의존적 방식으로 ECM을 통한 COM 결정 침입을 유의하게 향상시키는 것으로 나타났습니다(그림 6). 재미있게,디오스민160nM에서 COM 결정 침입에 대해 알려진 강력한 프로모터인 알부민에 필적하는 COM 결정 침입을 촉진할 수 있습니다[41](그림 6). 이러한 결과는 diosmin이 ECM을 통한 COM 결정 침습을 강력하게 촉진함을 나타냅니다.
그림 1. 효과디오스민COM 결정화에. 결정화 분석은 동일한 부피(4ul)의 결정화 완충액(블랭크 대조군), DMSO(음성 대조군) 또는 디오스민(2.5-160nM)으로 수행되었습니다. (A): 1-h 결정화 후 각 조건의 결정 형태. 원래 배율은 모든 패널에 대해 400배였습니다. (B): 결정 크기. (C): 결정 번호. (D): 결정질량("재료 및 방법"의 공식 1 참조)은 15개 HPF의 최소 100개 결정에서 분석되었습니다. 각 막대는 3개의 독립적인 실험에서 파생된 데이터의 평균 ±SEM을 나타냅니다. *=피< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
그림 2. 효과디오스민COM 결정 성장에. 결정 성장 분석은 동일한 부피(4ul)의 결정화 완충액(블랭크 대조군), DMSO(음성 대조군) 또는 diosmin(2.5–160nM)을 사용하여 결정화가 완료된 후(신결정화를 방지하기 위해) 수행되었습니다. (A): T0 및 T6{15}}에서 각 조건의 결정 형태. 모든 패널의 원래 배율은 4{18}}0배였습니다. (B)-(J): 각 그룹의 T0 및 T60에서 개별 결정에서 측정된 결정 크기의 히스토그램. (K): Δ 결정 크기("재료 및 방법"의 화학식 2 참조)는 15개 HPF의 최소 100개 결정에서 분석되었습니다. 각 막대는 3개의 독립적인 실험에서 파생된 데이터의 평균 ± SEM을 나타냅니다. *= p < 0.05="" vs.="" 빈="" 컨트롤;="" #="p">< 0.05="" 대="">
그림 3. 효과디오스민COM 크리스탈 집계에. 동일한 부피(4ul)의 결정화 완충액(블랭크 대조군), DMSO(음성 대조군) 또는 디오스민(2.5-160nM)을 사용하여 결정 응집 분석을 수행했습니다. (A): 응집된 COM 결정의 현미경 사진(점선 원으로 표시). 원래 배율은 모든 패널에 대해 400배였습니다. (B): 결정 응집체의 수는 각 웰에서 15개 이상의 무작위 HPF에서 계산되었습니다. 각 막대는 3개의 독립적인 실험에서 파생된 데이터의 평균 ± SEM을 나타냅니다. *=p< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
그림 4. 효과디오스민COM 크리스탈 셀 접착. 결정 세포 접착 분석은 동일한 부피(4ul)의 결정화 완충액(블랭크 대조군), DMSO(음성 대조군) 또는 디오스민(2.5-160nM)으로 수행되었습니다. (A): PBS로 격렬하게 세척하여 결합되지 않은 결정을 제거한 후 세포 단층에 단단히 부착된 나머지 결정의 현미경 사진. 원래 배율은 모든 패널에 대해 200배였습니다. (B): 부착된 결정의 수는 각 웰의 15개 이상의 무작위 필드에서 계산되었습니다. 각 막대는 3개의 독립적인 실험에서 파생된 데이터의 평균 ±SEM을 나타냅니다. *= p<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
그림 5. 효과디오스민신장 세뇨관 세포로의 COM 결정 내재화. 결정 내재화 분석은 FITC-표지된 COM 결정(FITC-COM)을 사용하여 수행된 반면, 일반(비표지) COM 결정은 배경/잡음 빼기에 사용되었습니다. 분석은 동일한 부피(4ul)의 결정화 완충액(공백 대조군), DMSO(음성 대조군) 또는 diosmin(2.5–16{12}}nM)으로 수행되었습니다. (A): 0.1% 트립신/2.5mM EDTA로 비내재화된 결정을 제거한 후 세포의 크기(y축) 및 FITC 형광 강도(x축)의 유세포 분석 도트 플롯 분석. (B): 내재화된 FITC 표지된 COM 결정이 있는 세포의 백분율. 각 막대는 3개의 독립적인 실험에서 파생된 데이터의 평균 ± SEM을 나타냅니다. *{18}} 피<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
그림 6. 효과디오스민ECM을 통한 COM 크리스탈 침공. ECM 분석을 통한 결정 침습은 결정화 완충액(블랭크 대조군), DMSO(음성 대조군), 알부민(양성 대조군) 또는 디오스민(2.5-160nM)으로 코팅된 COM 결정을 사용하여 수행되었습니다. (A): COM 결정의 현미경 사진이 ECM 마이그레이션 챔버를 통해 침입하거나 마이그레이션되었습니다. 원래 배율은 모든 패널에 대해 100배였습니다. (B): 크리스탈 침입 거리는 각 챔버에서 최소 15개의 무작위 LPF에서 측정되었습니다. 각 막대는 3개의 독립적인 실험에서 파생된 데이터의 평균 ±SEM을 나타냅니다. *= p<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. 토론
신장 결석은 내부에 결석이 형성되어 발생합니다.신장그리고 골반뼈 시스템. 일반적인 신장 결석 형성 과정에는 COM 결정화, 성장, 응집, 결정 세포 접착에 의한 유지 및 ECM이 풍부한 신장 간질을 통한 침입이 포함됩니다[21,22]. 다양한 약물 및/또는 영양 보조제를 사용하여 이 질병을 예방하기 위한 여러 시도가 있습니다. 최근의 많은 증거에서 감귤류에서 추출한 플라보노이드, 플라본 배당체 및 기타 화합물이 신장 결석 질환 및 기타 장애에 예방 효과가 있을 수 있다고 보고했습니다[23-25]. 이 중,디오스민, 주로 감귤류에서 발견되는 천연 플라본 배당체 및 헤스페리딘 유도체[1,2]는 인명 피해 및 손상을 예방하는 역할을 한다고 제안되었습니다.신장조직 [13,42]. 또한, 동물 모델을 사용한 몇몇 이전 연구에서 항요로결석증 역할이 보고되었습니다[26,27]. 그럼에도 불구하고, 신장 결석 예방에 있어 디오스민의 유익한 효과와 근본적인 메커니즘은 여전히 모호합니다. 따라서 우리는 COM 결정에 대한 diosmin의 조절 활성을 조사했습니다. COM의 다양한 단계에서 체계적인 분석이 수행되었습니다.신장결정화, 결정 성장, 응집, 결정 세포 부착, 신세뇨관 세포로의 내재화 및 ECM을 통한 침입을 포함하는 결석 형성.
경구 섭취 후디오스민, 인간의 혈장 수준은 {{0}}.5에서 200ng/ml(또는 0.8–300nM) 범위입니다[43,44]. 최대 혈장 농도(Cmax)는 약 50ng/ml(또는 85nM)입니다[43,44]. 따라서 우리의 현재 연구에서 사용된 디오스민의 용량(2.5-160nM)은 약동학에 대한 약리학적으로 적절한 범위에 있었습니다. DMSO는 권장 사항에 따라 diosmin을 완전히 용해시키기 위한 희석제로 사용되었기 때문에 DMSO는 데이터 해석을 방해할 수 있는 희석제 자체의 영향이 없음을 확인하기 위해 빈 대조군과 함께 음성 대조군으로 사용되었습니다. 모든 분석에서 데이터는 관찰된 DMSO의 유의한 영향이 없음을 보여주었고 음성 대조군에서 파생된 모든 정량적 데이터는 블랭크 대조군의 데이터와 비슷했습니다.
COM 결정화 분석은 모든 농도의디오스민(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 및 160nM)은 COM 결정 크기를 줄일 수 있지만 반면에 결정 수를 늘렸습니다. 결정질량은 결정 크기와 수의 최종 제품이며 COM 결정화 정도를 반영하는 것과 더 관련이 있으므로 디오스민이 이 결정 지수에 영향을 미치는지 여부를 평가했습니다. 데이터는 모든 농도의 디오스민이 결정 수에 대한 데이터와 일치하는 COM 결정 질량에 대한 촉진 효과가 있음을 보여주었습니다. 결정화 후 COM 결정은 다음 단계를 위해 더 큰 크기로 더 성장할 수 있습니다.신장돌 형성.
결정화와 대조적으로, 모든 농도에서 diosmin은 용량 의존적 방식으로 COM 결정 성장에 대한 억제 효과를 나타냈다. 일부 이전 연구에서는 CaOx 결정의 용해도가 글리코실화와 함께 하이드록시안트라퀴논의 유도체에 의해 증가될 수 있다고 보고했습니다[45]. 또한, 이러한 생리 활성 화합물에 존재하는 당은 분자 구조의 하이드록실 그룹으로 인해 자유 칼슘 이온과 결합하여 CaOx 결정의 형성을 억제할 수 있습니다[45,46]. Diosmin은 또한 이러한 메커니즘에 기반한 COM 결정화 과정에서 가용화된 칼슘 및 옥살산 이온이 신세뇨관액의 COM 결정질 입자로 전환되는 데 영향을 미칠 수 있습니다.
그럼에도 불구하고 COM 결정 응집은 10-160nM에 의해 촉진되었습니다.디오스민, 개별 결정을 모집하여 결정 집합체를 형성하기 위해 함께 결합하기 위한 링커 또는 접착 분자로 작용하는 디오스민의 능력을 암시합니다. 이 결합은 또한 개별 결정 사이의 접착 다리의 진행을 초래하고 COM 결정의 큰 구조 형성을 유도할 수 있으며, 이는 내부에 돌의 침적에 쉽게 기여합니다.신장[32].
신장 세뇨관 세포 표면에 결정의 부착을 통한 COM 결정 보유는 신장 결석 형성을 위한 또 다른 중요한 단계로 확립되었습니다[47]. 우리의 데이터는 diosmin이 MDCK 신장 세뇨관 세포의 정점 표면과 결합하는 COM 결정의 접착 능력을 감소시킬 수 있음을 보여주었습니다. 일부 이전 연구에서는 CaOx 결정에 코팅되거나 신장 세뇨관 세포에서 발현되는 글리코사미노글리칸(다당류 화합물)이 신장 세뇨관 세포에 대한 CaOx 결정의 접착 능력을 방해할 수 있음을 보여주었습니다[48]. 또한, 세뇨관 세포에서 결정 수용체의 발현은 결정 세포 접착을 결정하는 중요한 메커니즘 중 하나입니다[21]. CaOx 결정이 정단막, 특히 미세 융모의 손상을 유도하는 반면, EGCG(epigallocatechin gallate)와 같은 일부 폴리페놀은 결정 세포 접착 및 세포 손상을 예방할 수 있습니다[49]. 또한, 다양한 식물 추출물의 플라보노이드 물질은 소변 pH 수준을 증가시켜 결정 세포 부착을 억제하는 것으로 이전에 보고되었습니다[50,51]. 아마도,디오스민또한 COM에 의해 유도된 이러한 세포 손상을 약화시켜 결정 세포 접착을 감소시킬 수 있습니다.
COM 결정 내재화는 주로 액틴 세포골격 매개 거대음세포작용 경로를 통한 세포내이입에 의해 나타나는 것으로 입증되었습니다[40]. 케르세틴과 같은 플라보노이드는 거대음세포증에 필요한 액틴 세포골격에 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다[52,53]. 우리의 연구 결과는 diosmin이 COM 결정을 내재화하는 MDCK 세포의 능력을 상당히 감소시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 diosmin의 억제 효과는 macropinocytosis pathway에 직접적인 영향을 미치는 세포 내부의 actin 세포골격의 조립이나 조직화와 관련이 있을 수 있다[54,55].
내재화 후 COM 결정은 엔도리소좀에 의해 분해되어 신장 간질에서 유리 칼슘 및 옥살산 이온의 증가를 초래합니다[37]. 이러한 칼슘 및 옥살산 이온의 증가는 신장 간질에서 COM 신결정화를 유발할 수 있습니다[56,57]. 또한, 간질 COM 결정의 존재는 긴밀한 접합 및 세포주위 접착 장벽의 결함으로 인한 것일 수 있으며, 이는 증가된 세포주위 투과성 및 결정 전위를 초래한다[58-60]. 이러한 결정은 ECM을 통해 신장 간질을 침범하여 여러 염증 반응과 조직 손상을 유발할 수 있습니다[58-60]. 이 연구에서 우리는 ECM 마이그레이션 챔버를 통한 COM 결정의 침입이 모든 농도의 diosmin에 의해 유도됨을 관찰했습니다. Diosmin은 COM 결정 표면에 결합하고 ECM 이동 챔버에서 결정 이동을 유도하는 플라스미노겐-플라스민 시스템과 상호작용할 수 있습니다[38,39].
신장용 시스탄체
왜냐하면디오스민다양한 COM 결석 형성 과정에 대한 억제 및 촉진 효과를 모두 유도했기 때문에 우리는 Pearson 상관 관계 테스트를 사용하여 이들의 관계를 결정했습니다. 상관 분석 결과 결정 수는 결정 크기와 결정 성장(Δ 결정 크기) 모두와 반비례하는 것으로 나타났습니다(그림 7A 및 B). 결정 크기는 결정 성장과 강한 상관관계가 있지만(그림 7C) 결정 질량과 역 상관관계가 있습니다(그림 7D). 마지막으로, 결정 질량은 결정 수와 결정 응집 모두와 강한 상관관계가 있습니다(그림 7E 및 F). 상관 분석에서 데이터는 결정 수와 결정 질량이 결정 크기보다 결정화를 반영하는 데 더 관련이 있음을 나타냅니다(그림 7A, D 및 E). 또한, 결정화 중 신결정의 크기는 미리 형성된 결정의 성장과 관련이 있는 반면(그림 7C), 결정화 정도(결정 수 및 결정 질량에 의해 반영됨)는 결정 응집 정도와 밀접한 관련이 있습니다(그림 7E 및 에프). 그러나 이러한 상관 관계는 diosmin 효과에 특이적일 가능성이 가장 높은 반면, 다른 조절자의 효과는 동일한 상관 관계를 가질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. 예를 들어, 피브로넥틴은 결정질량을 감소시키고 결정 성장을 억제하지만 결정 응집을 촉진한다[31]. 또한, 온전한 생존 대장균은 결정 크기와 질량을 증가시키지만 결정 수에는 영향을 미치지 않습니다[33]. 이러한 데이터는 다양한 COM 결정 분석 간의 상관 관계가 모든 조절자에 대해 보편적이지 않음을 나타냅니다.
마지막으로, 우리는 다양한 분석에서 얻은 결과를 요약하고 이를 병원성 기전과 통합했습니다.신장결석 질병(그림 8의 개략도 참조). 상관 분석에서 diosmin은 결정화를 촉진합니다(그림 8A). 결정화와 결정 성장 사이,디오스민결정화를 촉진하여 균형을 잘 유지하지만 결정 성장을 억제합니다(그림 8B). COM 결정 단독에 대한 모든 효과와 관련하여(개재하는 세포 및 ECM은 고려하지 않음), 디오스민의 촉진 활성은 결정화 및 결정 응집을 모두 촉진하지만 결정 성장만 억제하기 때문에 COM 결정에 대한 억제 활성보다 더 두드러집니다. 도 8C). 결정화가 증가하더라도 결정 크기가 감소하고 성장 억제와 관련이 있습니다(그림 7C). 이 데이터는 Kavanagh et al.에 의해 보고된 결과와 일치합니다. [61-63], 결정화의 증가는 용액에서 칼슘 및 옥살산 이온의 과포화도 감소로 이어져 성장을 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 그러나 결정 성장이 결정을 결정하는 유일한 요인은 아닙니다.신장돌 병인 [64], 특히 결정 덩어리가 압도적이고 결정 응집의 증가(그림 7F)와 관련이 있을 때 결정 재료가 작은 관형 세그먼트에 달라붙어(관내 가설에서) 돌 형성의 기회. 또한, 이전 연구는 결정 수의 증가가 결정 응집 및 돌 확대의 증가와 관련이 있음을 나타내는 우리의 발견과 일치하는 데이터를 보여주었습니다[63].
그림 7. 상관관계 분석. (A)-(F): COM 결정 수, 결정 크기, Δ 결정 크기, 결정 질량 및 결정 응집체 수 사이의 상관 관계를 Pearson 상관 테스트로 분석.
그림 8. 의 변조 효과를 요약한 개략도디오스민COM에서신장돌 형성 과정. (A): COM 결정화에 대한 디오스민의 효과. (B): COM 결정화 및 결정 성장에 대한 디오스민의 효과. (C): COM 결정화, 성장 및 응집에 대한 디오스민의 효과. (D): 전체 COM 신장 결석 형성 과정에 대한 디오스민의 효과.
신세뇨관 세포 및 ECM과의 상호작용을 고려할 때,디오스민COM에서 신장 결석 형성이 훨씬 더 명확해집니다(그림 8D). Diosmin은 결정 세포 접착을 억제하여 세포로의 결정 내재화를 감소시킵니다. 이것은 우리의 최근 연구[34] 및 다른 그룹의 이전 연구[65]에서 보고된 바와 같이 COM 결정의 크기가 작을수록 더 큰 것보다 신세뇨관 세포에 결합하는 접착력이 더 낮다고 설명할 수 있습니다. 더 작은 COM 결정체의 접착력이 떨어지는 것은 각각 원자간력 현미경과 프로테옴 분석에 의해 결정된 세포 표면에 대한 접착력이 적고 결합된 COM 결정 수용체의 수가 적기 때문입니다[34]. Diosmin은 또한 결정 내재화를 억제합니다. 내면화 과정은 신중한 해석이 필요한 양날의 검이라는 점에 유의하자. 세포가 엔도리소좀에 의해 결정을 제거하는 데 사용하는 방어 메커니즘 중 하나에서 내재화 또는 엔도사이토시스. 그러나 손상되지 않은 결정의 분해는 유리 칼슘 및 옥살산 이온을 생성하여 세포 내 구획에서 신결정을 생성할 수 있는 신장 간질로 이동할 수 있습니다[56,57]. 한편, diosmin은 ECM을 통한 결정 침습을 촉진하는데, 이는 신장 결석 발병에 중요한 메커니즘 중 하나입니다(특히 Randall의 플라크 모델에서)[58-60]. 전반적으로, 그림 8D는 COM에 대한 diosmin의 모든 이중 변조 효과를 요약합니다.신장돌 형성 과정. 이러한 촉진 및 억제 효과의 균형은 (수학적 방정식과 달리) 정확하게 계산될 수 없다는 점에 유의해야 합니다. 또한 석재 형성 과정을 방해할 수 있는 여러 다른 내인성 및 외인성 요인이 있습니다. 마지막으로, diosmin은 또한 고려해야 하는 항산화 및 항염증 특성을 포함하여 신장 결석 형성에 대한 몇 가지 간접적인 영향을 나타냅니다[5,6]. 따라서 이러한 이중 조절 효과의 최종 결과는디오스민COM에서신장석재 형성은 생체 내 조사와 대규모 집단 전향적 연구가 더 필요합니다.
5. 결론
요약하면, 우리는 여기에서 용량 의존적 방식으로 COM 결정 변조에 대한 diosmin의 이중 효과를 보고합니다. COM 결정 성장, 결정 세포 부착 및 신세뇨관 세포로의 내재화를 억제하는 반면,디오스민ECM을 통한 COM 결정화, 응집 및 침입을 촉진합니다. 따라서 항요로결석증의 역할이 의심스럽고 신장결석 질환에 사용에 주의가 필요하다.
CRediT 저작자 기여 진술서
Supaporn Khamchun: 개념화, 방법론, 소프트웨어, 검증, 형식 분석, 조사, 데이터 큐레이션, 쓰기 – 원본 초안, 시각화, Sunisa Yoodee: 개념화, 방법론, 소프트웨어, 검증, 형식 분석, 조사, 데이터 큐레이션, 쓰기 – 원본 초안, 시각화, Thongboonkerd 방문: 개념화, 방법론, 소프트웨어, 검증, 리소스, 쓰기 – 검토 및 편집, 감독, 프로젝트 관리, 자금 조달.
이해 상충 진술
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 말
Kittiya Suwannakud의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 PMU-B와 태국 연구 기금(IRN60W0004)을 통해 국립 고등 교육 과학 연구 및 혁신 정책 위원회(NXPO) 사무국의 지원을 받았습니다. VT는 Siriraj 병원 의학부 "Chalermphrakiat" Grant도 지원합니다.
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