Echinacoside는 심근 리모델링을 역전시키고 심장 기능을 향상시킵니다
Mar 30, 2022
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추상적인
심근 리모델링은 HF의 중요한 병리학 적 기초이며, 미토콘드리아 산화 스트레스는 심근 비대, 섬유증 및 세포 사멸의 촉진제입니다. ECH는 중국 전통 의학 Cistanches Herba의 주요 활성 성분입니다. 많은 연구에 따르면 신경 세포와 종양에서 강력한 항산화 능력을 가지고 있으며 미토콘드리아 산화 스트레스를 억제하고 미토콘드리아 기능을 보호하지만 구체적인 메커니즘은 불분명합니다. SIRT1/FOXO3a/MnSOD는 중요한 항산화 축이며, 연구에 따르면 ECH는 리간드로서 SIRT1에 공유적으로 결합하고 뇌 세포에서 SIRT1의 발현을 상향 조절합니다. 우리는 ECH가 SIRT1/FOXO3a/MnSOD 신호 축을 조절하고 심근세포에서 미토콘드리아 산화 스트레스를 억제함으로써 심근 리모델링을 역전시키고 HF의 심장 기능을 개선할 수 있다고 가정합니다. 여기에서 우리는 먼저 AC{7}} 세포로 ISO에 의한 산화 스트레스의 세포 모델을 유도하고 ECH, 미토콘드리아 ROS 수준, mtDNA 산화 손상, MMP, 카르보닐화 단백질, 지질 과산화, 세포내 ROS 및 세포 사멸이 감지되면 미토콘드리아 산화 스트레스 및 시험관 내 기능에서 ECH의 효과를 확인합니다. 그런 다음 ISO에 의해 유도된 HF 쥐 모델을 설정하고 ECH로 전처리합니다. 심장 기능 지수, 심근 리모델링, 미토콘드리아 산화 스트레스 및 기능, SIRT1/FOXO3a/MnSOD 신호 전달 축의 발현이 측정되었으며, 데이터는 ECH가 심장 기능을 개선하고 심근 비대를 억제하며 섬유증 및 세포 사멸이 SIRT1/FOXO3a/의 발현을 증가시킨다는 것을 나타냅니다. MnSOD 신호 축은 미토콘드리아 산화 손상을 줄이고 미토콘드리아 기능을 보호합니다. 우리는 ECH가 SIRT1/FOXO3a/MnSOD 축을 상향 조절하고 HF 쥐에서 미토콘드리아 산화 스트레스를 억제함으로써 심근 리모델링을 역전시키고 심장 기능을 개선한다고 결론지었습니다.
KEYWORD세키나코사이드, 심부전, 미토콘드리아 산화 스트레스, 심근 리모델링
신선한 허브 시탕슈에게미토콘드리아 산화 스트레스
1|소개
심부전(HF)은 유병률이 높고 예후가 불량한 대부분의 심혈관 질환의 궁극적인 결과이며, 고령화 사회의 심화 추세에 따라 전 세계적으로 만성 심부전(CHF)으로 인한 입원 및 사망률이 급격히 증가하고 있습니다.1 지난 20년 동안 심부전의 약물치료는 눈부신 발전을 이루었지만 그 효과가 매우 제한적이어서 신약이 시급하다. 심근 리모델링은 HF의 중요한 병리학 적 기초이며 심근 비대, 세포 사멸, 간질 섬유증, 심근 세포가 와해되어 있으며 박출률 (LVEF)의 감소, 좌심실 확장기 및 수축기 치수의 증가를 특징으로합니다. (LVIDd 및 LVID), 좌심실 단편 단축(LVFS) 감소.2 그러나 기본 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 최근 몇 년 동안 많은 연구에서 산화 스트레스가 심근 재형성의 중요한 촉진제임을 확인했습니다.3-7
산화 스트레스는 활성 산소종(ROS) 또는 자유 라디칼이 과도하게 생성되어 세포 구성 요소의 산화적 손상을 초래하고, 이는 차례로 세포 기능 장애를 일으키는 상태입니다.8 미토콘드리아는 호흡 전자 전달 사슬로부터의 누출과 미토콘드리아는 ROS 효과에 가장 민감한 위치입니다.9 HF에 대한 연구는 호흡 사슬의 복합체 I에서 ROS 생성 증가가 확인되었습니다.8 ROS 생성 증가는 미토콘드리아 구성 요소를 먼저 공격하고 과도한 산화 스트레스를 초래합니다. , 단백질의 카르보닐화, 지질 과산화, DNA 손상,10 미토콘드리아의 기능 장애로 나타나 결과적으로 ROS의 과도한 형성으로 이어지는 악순환을 형성합니다. 지속적인 산화 스트레스는 심근 비대 및 심근 섬유증을 유발할 수 있고11-13 미토콘드리아 막 단백질의 카르보닐화 및 미토콘드리아 막 전위 손실의 결과로 미토콘드리아 의존성 세포자멸사의 활성화를 통해 심근 세포의 세포자살을 유발할 수 있음이 입증되었습니다.14 그래서 , 미토콘드리아 산화 스트레스의 억제는 심근 재형성 및 심부전을 예방하는 새로운 전략일 수 있다고 생각됩니다.15-17
천연 페닐에타노이드 배당체인 Echinacoside(ECH)는 한약재인 Cistanches Herba의 주요 활성 성분입니다. 최근 몇 년 동안 ECH는 신경계 및 종양에서 광범위하게 연구되었으며 항산화, 항염, 항 세포 사멸 및 항 종양 특성과 같은 다양한 약리학 적 효과를 갖는 것으로보고되었습니다.18,19In 신경 세포, ECH는 항산화 능력을 크게 향상시키고 ROS 생성을 감소시키며 미토콘드리아 막 전위(MMP)를 개선하고 세포 생존력을 증가시킵니다. neurodegeneration.21,22 ECH는 또한 SOD의 활성을 증가시키고 뇌 조직과 망막 조직에서 보호 역할을 하지만19,23 항산화 효과에 대한 구체적인 기전은 불분명합니다.
SIRT1은 산화 스트레스와 밀접한 관련이 있으며 SIRT1/FOXO3a/MnSOD 신호 축은 가장 중요한 항산화 축으로 미토콘드리아 산화 스트레스 억제를 담당하며 MnSOD는 미토콘드리아에 널리 분포하며 주로 미토콘드리아 ROS 제거를 담당하므로 산화 스트레스 억제, 이 항산화 축을 활성화하는 화합물은 산화 스트레스를 억제할 수 있습니다.24,25 최근 연구에 따르면 ECH는 p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-베타 1/Smads와 같은 여러 신호 전달 경로를 조절하여 약리학적 효과를 발휘합니다. , 및 SIRT1 신호 전달 경로.{10}} 새로운 연구에 따르면 ECH가 리간드로서 SIRT1에 공유 결합하고 뇌 세포에서 SIRT1의 발현을 상향 조절합니다.26 ECH가 심근세포에서 미토콘드리아 산화 스트레스를 억제하고 심근을 역전시킬 수 있음을 시사합니다. 재 형성. 그러나 ECH의 효과에 대한 연구는 신경계 또는 종양에 초점을 맞추었으며 심근세포의 미토콘드리아 산화 스트레스 및 심근 리모델링에 대한 ECH의 효과 및 기전은 아직 알려지지 않았습니다. 여기에서 우리는 먼저 ISO에 의해 산화 스트레스의 세포 모델을 유도하고 시험관 내에서 미토콘드리아 산화 스트레스 및 기능에 대한 ECH의 효과를 확인합니다. 그런 다음, 우리는 ISO에 의해 유도된 HF 쥐 모델을 설정하고 ECH가 심근 리모델링을 역전시키고 SIRT1/FOXO3a/MnSOD 신호 축을 상향 조절하고 HF 쥐에서 미토콘드리아 산화 스트레스를 억제하여 심장 기능을 개선함을 보여줍니다. 결과는 심부전을 예방하는 신약 개발에 대한 실험적 증거를 제공하기 위한 것이다.
2|재료 및 방법
2.1|세포 배양 및 치료
AC16 세포는 Bena Culture Collection에서 구입합니다. 세포는 T{3}} 플라스크(Corning Glassworks, Corning, 뉴욕, 미국). 조건은 5% CO2를 포함하는 가습된 대기에서 37도로 유지됩니다. 세포가 70% -80% confluence에 도달하면 ISO(Sigma, USA) 그룹 세포를 10uM ISO(Sigma, USA)를 포함하는 배지와 함께 24시간 동안 인큐베이션하고, ECH 그룹 세포를 50uM ECH(MCE , USA) ISO 노출 전 30분 동안. 컨트롤 셀(Ctrl)은 아무 것도 처리되지 않습니다.
판매용 시탕슈발췌
2.2|루미놀 화학발광을 이용한 미토콘드리아 ROS 수준 검출
제조사의 지침에 따라 Mitochondria Isolation Kit(Sigma, USA)를 사용하여 AC{0}} 세포에서 미토콘드리아를 분리하고 정제합니다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Biotech)에 의해 결정됩니다. 미토콘드리아 ROS 수준은 Elisa 키트를 사용하여 관강(3-아미노프탈산 히드라지드 5-아미노-2,3-디히드로-1,{6}}프탈라진디온)에 의해 감지됩니다. (GERMED SCIENTIFIC INC, USA), ROS와 반응하여 약 460nm에 피크를 갖는 밴드 스펙트럼인 광자를 방출하며, 화학발광 측정기로 RLU(Relative Light Unit)를 검출하여 RLU/ug로 환산한다. 미토콘드리아 단백질.
2.3|8-OHdG는 미토콘드리아 DNA의 산화적 손상을 평가하는 데 사용됩니다.
미토콘드리아 DNA 산화 손상은 8-하이드록시{1}}데옥시구아노신(8-OHG)의 함량을 감지하여 평가합니다. 세포에서 정제된 미토콘드리아는 위와 같은 미토콘드리아 분리 키트(Sigma)를 사용하여 분리됩니다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Biotech)에 의해 결정됩니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 Elisa 키트(GERMED SCIENTIFIC INC, USA)를 사용하여 8-OHdG 수준을 결정하기 위해 해리됩니다. 색 변화의 흡광도는 450 nm의 파장에서 분광 광도계로 측정됩니다. 그런 다음 샘플의 8-OHdG 농도는 샘플의 OD를 표준 곡선과 비교하여 결정하고 ng/ml로 변환합니다.
2.4|JC에 의한 MMP 측정-1
미토콘드리아는 AC{0}}에서 분리되고 정제되며 단백질 농도는 위에서 언급한 대로 결정됩니다. 그런 다음 미토콘드리아를 1mg/ml 농도로 재현탁하고 제조업체의 지침에 따라 JC{2}} 분석 키트를 사용하여 MMP를 측정합니다. 형광 강도는 분광 광도계 기기로 여기 파장: 490nm, 슬릿 5nm, 방출 파장: 590nm, 슬릿 5nm에서 측정되며,30 결과는 FLU/ugP로 표시됩니다.
2.5|AC-16 세포에서 유세포 분석에 의한 세포자멸사 세포 검출
유세포 분석은 세포 사멸을 평가하는 데 사용됩니다. Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit(CWBIO, China)는 공급자의 지시에 따라 apoptotic 및 necrotic cell을 검출하는데 사용된다. 초기 단계의 세포 사멸, 후기 단계의 세포 사멸 또는 괴사, 세포 파편 및 생존 세포는 annexin V ( plus )/PI (-), annexin V ( plus )/PI ( plus ), annexin V (-)/PI 로 식별됩니다 . ( 플러스 ) 및 아넥신 V(-)/PI(-). 형광 강도는 유세포 분석기(BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 분석됩니다. 각 실험은 3회 반복됩니다.
2.6|유세포분석기에 의한 세포내 ROS 평가
처리 후 세포를 트립신 처리하고 PBS로 2회 세척합니다. 그런 다음 세포를 PBS에 재현탁하고 1μM의 최종 농도에서 DCFH-DA(Beyotime, China)로 염색하고 CO2가 있는 인큐베이터에서 37도에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 488nm 여기에서 유세포 분석기에서 테스트합니다. . 형광 강도는 세포 내 ROS의 수준을 나타냅니다.
2.7|AC{2}} 세포의 미토콘드리아에서 카르보닐 단백질 함량 테스트
처리 후, 정제된 미토콘드리아를 분리하고 얼음 위에서 초음파 처리하고 1% 스트렙토마이신 설페이트로 처리하여 미토콘드리아 핵산을 침전시키고 단백질 농도를 측정합니다. 카르보닐 단백질 함량은 키트의 지침에 따라 디니트로페닐히드라진(DNPH)을 사용한 카르보닐기의 유도체화를 기반으로 하는 Elisa 키트(GERMED SCIENTIFIC INC, USA)를 사용하여 테스트되며, OD는 마이크로플레이트 판독기로 측정되고 nmol/로 변환됩니다. mg 단백질을 표준 곡선과 비교합니다.
2.8|AC{2}} 세포의 미토콘드리아에서 지질 과산화 수준 측정
처리 후, 세포를 채취하여 용해하고, 미토콘드리아를 분리 및 정제하고, 초음파로 분해하고, 단백질 농도를 BCA protein assay kit(Biotech)로 측정하고, lipid peroxidation을 TBARS assay를 통해 malondialdehyde(MDA) 수준으로 측정합니다. , 키트(Nan jing Jian cheng, 중국)를 사용하여 MDA 수준을 제조업체의 프로토콜에 따라 측정합니다. OD는 마이크로플레이트 리더에 의해 586 nm에서 검출되고 표준 곡선과 비교하여 μmol/g 단백질로 변환됩니다.
2.9|동물과 치료
체중이 120-140g인 젊은 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 Xi'an Jiaotong University Laboratorial Animal Center(중국 산시)에서 입수했습니다. 조사는 미국 국립보건원(NIH 간행물 번호85-23, 1996년 개정)에서 발행한 The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals를 따르고 실험 프로토콜은 지방 당국의 승인을 받았습니다( Xi 'a Jiao Tong University 의학부의 생물의학 윤리위원회). HF의 쥐 모델은 우리가 이전에 설명한 대로 설정되었습니다.31 간단히 말해서, Isoproterenol(1{10}} mg/kg)은 2주 동안 복강 내 주사로 매일 1회 투여되고(HF 그룹으로 정의됨), ECH는 20 ug/g 1일 1회 ISO 치료 30분 전 복강내 주사(ECH군으로 정의), 투여는 2주간 지속된다. 대조군 동물에는 0.9% NaCl(Ctrl 그룹으로 정의됨)이 투여됩니다. 심장 기능을 평가하기 위해 심장초음파 측정이 수행됩니다.
2.10|심장초음파 측정
300 mg/kg의 클로랄 수화물을 복강내 주사하여 동물을 마취시켰다. 7.5MHz의 초음파 변환기가 있는 SONOS{1}} 초음파 시스템(HP, USA)은 심장초음파 검사에 사용됩니다. 좌심실 박출률(LVEF), 좌심실 단편 단축(LVFS), 좌심실 확장기말 치수(LVIDd), 좌심실 수축기말 치수(LVID), 심박수(HR), 이완기 심실 중격 두께(IVSTd) ), 확장기의 좌심실 후벽 두께(LVPWTd)는 이전에 설명한 대로 측정됩니다.32
그림 1 50μmol ECH는 10μmol/L ISO에 의해 유도된 AC{1}} 세포의 미토콘드리아 산화 스트레스를 효과적으로 억제하고 미토콘드리아 기능을 보호하고 세포자멸사를 감소시킵니다.
2.11|심장 중량 대 체중 비율(HW/BW)이 측정됩니다.
마취 전에 쥐의 무게를 측정하고 신선한 심장을 분리하고 0.1mol/L PBS로 혈액을 씻어내고 혈관 및 기타 중복 조직을 잘라내고 심장의 무게를 측정한 다음 HW/BW(mg/100g)를 계획된.
2.12|조직학적 염색
쥐의 심장을 해부하고 4% 파라포름알데히드에 고정하고 파라핀에 포매하고 5μm 두께의 조각으로 절단합니다. Haematoxylin-Eosin(HE) 염색은 병리학적 변화를 관찰하는 데 사용되며 Masson's trichrome은 쥐 심근 조직의 콜라겐 섬유를 평가하는 데 사용됩니다. 심장 콜라겐 부피 분율(CVF) 및 심근세포 단면적은 Image-Pro Plus 6.{7}}(Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA)으로 측정됩니다.
2.13|TUNEL 염색
좌심실에서 심근 조직을 수집하고 이전에 설명한 대로 TUNEL 분석을 수행합니다32
2.14|투과전자현미경
신선한 심장 조직을 4도에서 2.5% 글루타르알데하이드에 고정한 다음 조직을 1mm3 부피로 절단하고 다시 2.5% 글루타르알데하이드에 4도에서 2시간 동안 고정한 다음 0.1mol/L PBS로 세척하고 고정합니다. 1% 오스믹산에서 아세톤으로 탈수하고, 에폭시 수지로 매립하여 약 8{17}0nm 두께의 초박편을 만들고, uranyl acetate와 lead citrate로 염색한 후 투과전자현미경(H{ {13}}, Hitachi Limited, 일본). 미토콘드리아 형태에서 ECH의 보호 효과를 정량화하기 위해 미토콘드리아 평균 둘레, 평균 미토콘드리아 단면적, 변성 백분율 및 미토콘드리아 공포화 백분율을 Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics, USA)을 사용하여 통계적으로 분석합니다.
2.15|정량적 PCR
Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, USA)을 사용하여 좌심실 조직에서 총 RNA를 준비합니다. cDNA는 TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara, Japan)를 사용하여 합성됩니다. Real-Time PCR에 사용된 콜라겐 I의 특정 프라이머 서열은 다음과 같습니다. 정방향: 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3', 역방향: 5'-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3'. GAPDH 순방향 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', 역방향 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. 실시간 정량 PCR(qPCR)은 SYBRPremix Ex로 수행됩니다. Taq(완벽한 실시간)(다카라, 일본). mRNA의 상대 수준은 2-ΔΔCT 방법에 따라 GAPDH로 정규화하여 계산됩니다.
2.16|SIRT1, FOXO3a, MnSOD 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석
좌심실 조직의 총 단백질은 Protease Inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich)과 함께 차가운 RIPA Buffer(BioRad, USA)를 사용하여 얼음 위에서 추출됩니다. 농도는 BCA 방법에 의해 결정됩니다. Western blot의 절차는 이전에 설명되어 있습니다.33 간단히 말해서, 단백질 샘플을 15% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 분획화하고 PVDF 멤브레인(BioRad, USA)으로 옮기고 5% 탈지유로 차단하고 마우스의 MYH 항체와 함께 배양합니다. (1:200 희석, Santa Cruz, USA). 그런 다음 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 염소 마우스 항체(1:2로 희석됨,{10}}, Santa Cruz, USA)와 함께 인큐베이션했습니다. 단백질의 상대적 수준은 평균 광선 값을 -액틴으로 정규화하여 계산됩니다. 단백질 밴드는 화학발광 시스템(ChemiDoc XRS, BioRad)에 의해 검출됩니다.
2.17|쥐 심근의 미토콘드리아 산화 스트레스 측정
정제된 쥐 심근의 미토콘드리아는 Mitochondria Isolation Kit(Sigma, USA)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 분리하였으며, 미토콘드리아 ROS, MMP, mtDNA의 산화적 손상, 카르보닐화 단백질 함량, 미토콘드리아 내 지질 과산화 정도는 모두 동일한 방법으로 검출하였다. 위에서 설명한 세포 실험. 참고로, 심근 조직의 ROS는 DCFH-DA 형광 프로브로 검출되고, 형광 강도는 효소 표지 측정기로 검출되며, 그 결과는 RLU/ug 미토콘드리아 단백질로 표시됩니다.
2.18|통계 분석
모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 일원 ANOVA는 여러 그룹 간의 차이를 비교하는 데 사용되며 그 다음에는 유의성에 대한 Tukey 사후 테스트가 사용됩니다. 모든 통계는 SPSS15.{2}} 소프트웨어(SPSS Inc, IL, USA)를 사용하여 결정됩니다. P < .05의="" 확률="" 값은="" 유의미한="" 것으로="">
3|결과
3.1|50μM ECH는 AC{3}} 세포에서 미토콘드리아 산화 손상 및 세포자멸사를 효과적으로 억제합니다.
처리되지 않은 셀은 Ctrl 그룹으로 설정됩니다. 첫째, 그림 1A에서 볼 수 있듯이 ECH는 ISO에 의해 유도된 미토콘드리아 ROS를 억제합니다. ISO 처리된 세포는 Ctrl과 비교하여 미토콘드리아 ROS의 상당한 증가를 나타내며 이 증가는 50μM ECH로의 전처리에 의해 상당히 약화됩니다. 둘째, ECH는 ISO에 의해 유도된 mtDNA의 산화적 손상을 억제할 수 있습니다. 8-OHdG는 산화 스트레스로 인한 가장 풍부한 DNA 병변 중 하나로 여겨지며 산화 DNA 손상 및 복구의 바이오마커입니다. 그림 1B에서 볼 수 있듯이 AC-16 세포의 정제된 미토콘드리아에서 8-OHdG의 함량이 검출되었으며, 그 결과 ISO 처리된 세포의 미토콘드리아에서 8-OHdG의 수준이 급격히 증가했으며, 그러나 변화는 50μM ECH에 의해 역전되었습니다. 셋째, ECH는 ISO에 의해 손상된 MMP를 보호하는데 효과적이다. 형광 강도는 Ctrl 세포와 비교하여 ISO로 처리된 세포에서 크게 감소하는 반면, 50 μM ECH로 전처리하면 그림 1C에서 볼 수 있듯이 MMP의 감소가 현저하게 약화됩니다. 넷째, ECH는 AC{12}} 세포에서 미토콘드리아 단백질의 산화적 손상으로부터 보호합니다. 그림 1D에서 볼 수 있듯이 ISO 처리 세포의 미토콘드리아에서 카르보닐 단백질 함량은 크게 증가하고 ECH는 효과를 약화시킵니다. 다섯째, ECH는 또한 ISO에 의해 유도된 AC{14}} 세포에서 미토콘드리아 지질 과산화를 억제합니다. 그림 1E에서 볼 수 있듯이 ISO 세포의 미토콘드리아에서 지질 과산화물 수준은 Ctrl 세포의 수준보다 분명히 높지만 이 증가는 50μM ECH 전처리에 의해 크게 감소합니다. 궁극적으로 ECH는 세포 내 ROS의 축적을 억제합니다. 그림 1F에서 볼 수 있듯이 ISO 세포에서 세포 내 ROS의 수준은 현저하게 증가하고 ECH 전처리된 세포에서는 현저하게 감소합니다. 그림 1G는 AC{21}} 세포의 아폽토시스 비율이 Ctrl 세포와 비교하여 10μM ISO로 24시간 인큐베이션한 후 크게 증가한 반면, 50μM ECH를 사용한 전처리 세포는 ISO 유도 아폽토시스를 유의하게 감소시키는 것을 보여줍니다.
그림 2 ISO에 의해 유도된 HF 쥐의 심장 비대는 완화되고 심장 기능은 ECH 치료에 의해 크게 개선됩니다.
3.2|ECH는 심근 리모델링을 역전시키고 ISO 유발 HF 쥐의 심장 기능을 향상시킵니다
그림 2A에나타난 바와 같이, HF 쥐의 심장은 명백한 비대이며 ECH로 치료하면 역전됩니다. 그림 2B-D 및 L에서 알 수 있듯이 ECH는 HW/BW를 줄입니다. 심장초음파 검사 결과 LVEF와 LVFS는 HF 그룹에서 유의하게 감소했으며 LVIDd, LVID 및 IVSTd는 HF 그룹에서 유의하게 증가했습니다. 그러나 ECH는 LVIDd, LVIDs, IVSTd를 유의하게 감소시키고 LVEF 및 LVFS를 개선하며 세 그룹 간에 HR에 유의한 차이가 없으며 HF에서 LVPWTd가 증가하지만 ECH와 Ctrl 또는 ECH와 HF 간에 차이가 없습니다. 도 2E-K는 HF 래트에서 심근 비대, 배열 장애 또는 변성 괴사, 염증 세포 침윤 및 간질 충혈 및 부종을 나타내고, ECH는 이러한 손상을 유의하게 완화하고, 심근 비대 및 배열 장애를 완화시키는 HE 염색 결과를 나타낸다. 그림 3A와 같이 퇴행성 괴사와 염증성 침윤이 감소합니다. 심근세포의 단면적을 측정한 결과, 그림 3E와 같이 ISO 후 상당히 증가하고 ECH 처리군에서 감소합니다. Masson 염색에 의한 콜라겐 침착의 평가는 HF 쥐의 좌심실 콜라겐 함량이 ECH로 치료한 후 명백하게 증가하고 명백하게 감소되어 CVF를 분명히 감소시키는 것으로 나타났습니다. 실시간 PCR 분석은 프로콜라겐 유형 Ⅰ 전사체가 ISO 쥐에서 상향 조절되고 ECH 쥐에서 하향 조절된다는 것을 보여줍니다. 이러한 결과는 그림 3B와 FG에서 볼 수 있듯이 서로 일치합니다. 데이터는 ECH가 콜라겐 침착을 효과적으로 감소시킨다는 것을 나타냅니다 . 심근 세포의 TUNEL 양성 세포의 수는 Ctrl과 비교하여 HF 쥐에서 크게 증가했으며 ECH는 심근 세포 사멸을 현저하게 감소 시켰으며 그림 3C-D는 저전력 및 고전력 필드 각각에서 TUNEL 양성 세포의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 도 3h는 심근 세포의 아폽토시스 속도를 나타낸다. 이러한 결과는 ECH가 심근 비대, 심근 간질 섬유증 및 세포자멸사를 효과적으로 역전시키고 ISO에 의해 유도된 HF 쥐의 심장 기능을 개선함을 나타냅니다.
그림 3 조직학적 염색 결과는 ECH가 ISO에 의해 유도된 HF 쥐의 좌심실 리모델링을 역전시킨다는 것을 보여줍니다.
3.3|ECH는 HF 쥐의 심근 미세구조를 보호합니다.
투과 전자 현미경 결과는 심근 미세구조의 손상이 그림 4A-B와 같이 ECH에 의해 감쇠될 수 있음을 보여줍니다. 근원섬유는 수직으로 배열되어 있고 근절 구조가 뚜렷하며 근원섬유는 가지런히 배열되어 있으며 Z선이 뚜렷하다. 미토콘드리아는 깔끔하게 배열되어 있고 구조는 Ctrl 쥐에서 명확합니다. 그러나 근원섬유가 와해되어 파열되어 용해되고 근절 구조가 흐릿하고 Z선이 없고 심근수축대가 보이고 미토콘드리아의 수와 부피가 증가하고 미토콘드리아의 모양과 크기가 다양하고 무질서하게 배열되어 있다. 구조가 불분명하고, 팽창 및 크리스타 단편화, 붕괴 또는 덩어리가 HF 래트에서 액포로 용해됩니다. ECH는 분명히 이러한 변화를 약화시키고, 대부분의 심근 섬유가 깔끔하게 배열되고 심근 필라멘트가 명확하며, Z 라인이 존재하지만 필라멘트의 일부 용해가 명백하지만 근절 구조가 명확하고 미토콘드리아 밀도가 감소하고 모양 크기가 완화되고 더 깔끔하게 배열되며 미토콘드리아 팽창 및 크리스타 분열, 붕괴 또는 덩어리, 공포화는 HF와 비교하여 ECH에 의해 분명히 감소됩니다. 미토콘드리아 팽창 및 크리스타 단편화, 붕괴 또는 덩어리, 부분 공포화는 미토콘드리아 변성으로 확인됩니다. 결과는 그림 4C-F와 같이 ECH가 심근 미세구조를 효과적으로 보호하고 특히 HF 쥐의 미토콘드리아 형태를 보호한다는 것을 보여줍니다.
그림 4 ECH는 ISO에 의해 유도된 HF 쥐의 심근세포 미세구조와 미토콘드리아 형태를 보호합니다.
3.4|ECH는 SIRT1, FOXO3a 및 MnSOD의 단백질 발현을 상향 조절합니다
Western Blot 분석은 SIRT1, FOXO3a 및 MnSOD의 단백질 발현 수준이 HF 쥐에서 상당히 하향 조절된다는 것을 보여주지만, ECH는 감소된 단백질 발현을 분명히 상향 조절합니다. 면역 블로팅의 대표적인 단백질 밴드 및 통계 분석 결과는 그림 5에 나와 있습니다. 데이터의 일부는 ECH가 SIRT1, FOXO3a 및 MnSOD의 단백질 발현을 증가시킴을 나타냅니다.
3.5|ECH는 좌심실 심근 조직에서 미토콘드리아 산화 스트레스를 억제합니다
이 부분에서는 쥐의 좌심실 심근 조직에서 미토콘드리아 ROS, MMP, 미토콘드리아 DNA의 산화적 손상, 카르보닐 단백질 함량 및 미토콘드리아 내 지질 과산화 수준을 모두 측정하고 그 결과는 세포 실험, 즉, ECH는 미토콘드리아 ROS를 감소시키고, MMP를 보호하고, mtDNA의 손상 정도를 완화하고, 미토콘드리아에서 카르보닐 단백질 함량 및 지질 과산화를 감소시킵니다(그림 6 참조).
그림 5 ECH는 HF 쥐에서 하향 조절되는 SIRT1, FOXO3a 및 MnSOD의 단백질 발현 수준을 상향 조절합니다.
4|논의
이 연구는 ECH가 SIRT1/FOXO3a/MnSOD 신호 축을 상향 조절하고 미토콘드리아 산화 스트레스를 억제함으로써 심근 리모델링을 예방하고 심장 기능을 개선하는 데 효과적인 역할을 한다는 것을 보여줍니다.
미토콘드리아는 산화적 인산화의 부산물로서 ROS를 생성하는 주요 부위이며, ROS에 근접하기 때문에 미토콘드리아 단백질, 지질 및 mtDNA는 미토콘드리아 ROS의 과도한 방출 후 산화적 손상의 주요 표적으로 여겨집니다34,35 이 손상은 ROS의 추가 생산을 자극하고 악순환이 계속되며 ROS와 산화 스트레스는 다중 신호 경로의 활성화를 통해 심근 비대, 세포 사멸, 간질 섬유증 및 HF를 유발할 수 있습니다. 스트레스는 심근 재형성 예방에 효과적입니다. ECH는 중국 전통 허브인 Cistanche tubulosa의 성분인 천연 페닐에타노이드 배당체입니다. 그것은 널리 연구되었으며 최근 몇 년 동안 항 종양, 항 세포 사멸, 항 노화, 신경 보호 작용 등과 같은 종류의 약리 활성을 갖는 것으로 입증되었습니다. 연구에 따르면 ECH의 약리학적 작용은 주로 항산화 및 항염증 활성 특성에 의존하며,18,21 ECH는 미토콘드리아 ROS를 감소시키고 신경 세포의 산화적 손상으로부터 미토콘드리아 기능을 보호합니다. ECH는 심근세포의 미토콘드리아 ROS를 감소시켜 MMP를 개선하고 mtDNA, 단백질 및 지질의 산화적 손상을 감소시키고 미토콘드리아 산화 손상을 효과적으로 억제하고 시험관 및 생체 내 세포자멸사를 감소시켜 심근 리모델링을 역전시키고 심장 기능을 향상시킵니다. 이는 ECH가 심근 재형성 및 HF 예방을 위한 잠재적인 신약임을 의미합니다.
정상적인 조건에서 미토콘드리아 ROS는 주로 미토콘드리아에 분포하고 미토콘드리아 산화 손상으로부터 보호하는 MnSOD에 의해 제거됩니다. Ang II는 심근세포의 MnSOD 발현을 유의하게 감소시키고 심근 비대를 유도하지만, 레스베라트롤은 MnSOD의 발현을 증가시키고 Ang II에 의해 유발된 심근 비대를 억제할 수 있다.36 HF에서 MnSOD의 활성은 현저히 감소하고 미토콘드리아 ROS 생성은 증가한다 .37,38 심장 특이적 MnSOD 유전자 녹아웃 마우스에서 미토콘드리아 ROS가 제거되지 않고 심근 세포에서 ROS가 증가하여 미토콘드리아 기능 장애와 진행성 심장 비대가 이어져 결국 심부전으로 이어졌습니다.39 본 연구에서 우리는 확인합니다. ECH 처리에 의해 약화되는 MnSOD의 발현이 현저하게 감소되어 미토콘드리아 ROS가 감소되고 미토콘드리아 산화 스트레스가 억제된다는 것이다. 이는 ECH가 MnSOD 발현의 상향 조절을 통해 산화적 손상으로부터 심근세포를 보호한다는 것을 의미하며, 우리는 이러한 효과의 기초가 되는 분자 메커니즘을 더 탐구합니다.
MnSOD의 발현은 전사 인자인 FOXO3a에 의해 조절되며, MnSOD의 유전자 프로모터 영역에 결합하여 유전자 전사를 촉진시킨다.40 SIRT1은 FOXO3a의 상류 분자이며 탈아세틸화에 의해 FOXO3a를 활성화할 수 있다. SIRT1/FOXO3a/MnSOD 신호 축은 세포 유형의 산화 스트레스로부터 보호하는 데 중추적인 역할을 하며, 에스트라디올에 의한 신호 축의 활성화는 산화 스트레스를 억제하고 심장 보호를 발휘합니다. 레스베라트롤에 의한 신호 축의 활성화는 산화 스트레스로 인한 세포 사멸을 억제합니다. 그렇지 않으면, 안지오텐신 II는 SIRT1/FoxO3a/MnSOD 경로를 억제하고 미토콘드리아 산화 스트레스, 조골세포의 mtDNA 손상을 유도하며,41types 5 adenylyl cyclase는 Sirt1/FoxO3a를 통한 MnSOD의 발현을 억제하여 산화 스트레스를 증가시킨다는 연구 결과가 있습니다. SIRT1, FoxO3a 및 MnSOD의 발현은 모두 HF 쥐에서 크게 감소하고 미토콘드리아 ROS가 증가하고 산화 스트레스가 향상되지만 변화는 ECH에 의해 역전됩니다. 새로운 연구에 따르면 ECH는 리간드로서 SIRT1에 직접 결합하여 9개의 공유 결합과 복합체를 형성하고 신경 세포에서 SIRT1의 발현을 상향 조절합니다. 이 연구와 일치하게, 본 연구는 ECH가 SIRT1의 발현도 상향 조절한다는 것을 보여줍니다. 심근세포에서 SIRT1은 FoxO3a를 통해 MnSOD의 유전자 발현을 상향 조절하고 미토콘드리아 ROS와 산화 스트레스를 억제합니다.
장기간의 만성 허혈은 심근 동면을 유발할 수 있으며, 이러한 동면 심근 세포는 일반적으로 수축성 필라멘트의 손실을 나타내며, 세포질, 근형질 세망, 가로 세관의 손실,43또한 미토콘드리아 크기와 모양에 이상이 있습니다. , 반응성 심근 비대 및 간질 섬유증(근세포 손실에 이차적). 심근 동면의 특징,45 심근 글리코겐 수준도 측정한 결과, 그림 7J에 표시된 것처럼 세 그룹 간에 유의한 차이가 없음을 나타냅니다.
이전 연구는 또한 비허혈성 심부전 돼지 모델에서 고주파로 좌심실 자유벽을 페이싱하여 심근 동면을 감지했는데,46 이는 미세혈관 폐쇄가 심근 동면과 그로 인한 수축 기능 장애에 중요한 역할을 하기 때문입니다. 미세혈관 폐쇄는 약물에 의해 역전됩니다.47 현재 일부 연구에서는 HE 및 Masson 염색을 사용하여 혈관재생 요법이 심근을 동면시키는 데 효과적이라는 결론을 내렸습니다. 그림 7A-H와 같이 ECH에 의해. 이전 연구에서는 보리 베타-글루칸과 같은 다른 천연 화합물이 MnSOD의 발현을 증가시켜 심장 보호 효과를 발휘하고,48,49 MnSOD의 증가는 심근 모세혈관 밀도 및 VEGF 발현 증가와 관련이 있음을 보여주었습니다. 우리는 VEGF의 발현을 검출하기 위해 RT-PCR을 수행했으며, 데이터는 조직학적 염색의 발견과 일치하며, 이는 그림 7I에 나타난 바와 같이 ECH가 혈관신생을 촉진하고 VEGF 발현 조절을 통해 심근 모세혈관 밀도를 증가시킬 수 있음을 의미합니다. 본 연구에서는 ECH가 SIRTI/FOXO3a/MnSOD 경로와 VEGF의 발현을 상향 조절함으로써 심근 모세혈관과 세동맥을 보호하고 증가시킬 수 있어 동면 심근을 억제하고 심장 기능 개선에 기여할 수 있음을 발견했습니다.
참고로 심근세포의 세포사멸은 심부전의 중요한 병리학적 변화로 잘 알려져 있으며, 본 연구에서는 실제로 HF 쥐와 ECH에서 다량의 세포사멸 세포가 SIRTI/FOXO3a/MnSOD 경로를 조절하고 위에서 언급했듯이 미토콘드리아 산화 스트레스.
무엇보다도 ECH는 SIRT1/FoxO3a/MnSOD 신호 축을 상향 조절하여 심근 리모델링을 역전시키고 심장 기능을 개선하여 미토콘드리아 산화 스트레스를 억제하고 동면 심근을 감소시킵니다. 따라서 ECH는 심근 재형성 및 HF의 예방 또는 치료에 대한 잠재적인 약물임을 시사한다.
