Echinacoside는 형질전환 성장 인자- 1 발현의 상향 조절을 통해 장 상피 MODE-K 세포에서 세포 증식을 자극하고 세포 사멸을 방지합니다

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

Yamin Jia, Qiunong Guan, Yuhai Guo 및 Caigan Du

추상적인

시스탄체 데저티콜라 MA(C. Deserticola)는 과민성 대장 증후군이나 변비의 치료를 위한 한약에서 완하제로 널리 사용되어 왔으며,시스탄체의 에키나코사이드(ECH)는 이 허브의 주요 생리 활성 성분 중 하나입니다. 우리의 목표는 장 상피 세포 성장과 죽음에 대한 ECH의 효과를 조사하는 것이 었습니다. 장 상피 세포주인 MODE-K를 장의 시험관내 모델로 사용하였다. 세포 증식은 메틸 티아졸 테트라졸륨(MTT) 분석에 의해 측정되었습니다. 세포 사멸은 Annexin-V 염색으로 결정되었습니다. 여기에서 우리는 배양된 MODE-K 세포에서 ECH가 성장 인자(TGF)를 변형시키면서 H2O2 또는 전염증성 사이토카인의 혼합물이 존재할 때 세포 사멸을 감소시켜 세포 증식을 유의하게 자극하고 세포 생존을 향상시킴을 보여주었습니다.{6}} 발현은 용량 의존적 방식으로 상향 조절되었다. TGF{9}} 발현의 억제는 ECH의 증식 및 세포 보호 활성을 모두 방해했으며, 이는 항-TGF{11}} 항체를 사용한 TGF{10}} 활성의 중화에 의해 추가로 확인되었습니다. 이러한 데이터는 C. Deserticola 및 기타 허브의 생리 활성 성분 중 하나인 ECH가 TGF-의 상향 조절을 통해 장 상피 세포 증식을 자극하고 세포 사멸을 방지함으로써 점막 조직 복구를 개선할 수 있음을 시사합니다.

키워드: Cistanche Deserticola, 장상피, 세포증식, 세포사멸, 형질전환성장인자(TGF)-

소개

시스탄체 데저티콜라 MA(C. Deserticola)는 한약에서 Rou Cong Rong으로 일반적으로 알려져 있으며 의약 용도로 인해 중국에서 새로운 작물이 되었습니다(1). 그것의 임상적 이점은 만성 변비(2, 3)를 포함한 많은 건강 문제의 치료에서 보고되었으며 유익한 효과는 장에서의 완하제 활성과 관련이 있습니다. 대변을 촉촉하게 만들어 환자(4, 5)와 동물 모델(6, 7)의 배변을 촉진합니다. 우리의 최근 연구는 C. Deserticola의 물 추출물의 경구 투여가 결장직장암에 걸리기 쉬운 마우스의 장에서 염증성 증식의 수를 유의하게 감소시킨다는 것을 보여줍니다(8).

시스탄체의 에키나코사이드 (ECH) is a major component of phenylethanoid glycosides (PhG) (>C. Deserticola(9)에서 분리된 총 PhG의 50%)는 C. Deserticola 함유 완하제 Ronggui Tongbian Capsule(10)의 품질 관리 또는 재배된 C. Deserticola의 생산 품질 관리를 위한 바이오마커로 사용되었습니다. (11). ECH는 파킨슨병의 동물 모델(12, 13)과 폐 손상 모델(14) 및 배양된 갈색세포종 세포(PC12)(15, 16) 모두에서 세포 보호 효과가 있는 것으로 입증되었습니다. 인간 섬유아세포(MRC{10}})의 세포 분열을 향상시키는 것으로 나타났습니다(17). 본 연구에서는 C. Deserticola를 함유한 한약재의 장질환 치료에 대한 약리학적 작용을 이해하기 위해 C. Deserticola의 주요 생리활성 성분인 ECH가 배양된 장 상피세포의 세포 증식 및 생존에 미치는 영향을 조사하였다. .

재료 및 방법

세포 배양

MODE-K는 Dr Theodore Steiner(Vancouver Coastal Health Research Institute, Vancouver, Canada)가 친절하게 제공한 C3H/HeJ 마우스(18)에서 파생된 장 상피 세포주입니다. MODE-K 세포는 공기 대기 중 5% CO2 하에 37도에서 10% FBS(fetal bovine serum)가 보충된 Dulbecco의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 배양되었습니다.

시스탄체의 에키나코사이드(ECH) 준비

ECH(시스탄체의 에키나코사이드)은 상업적인 C. tubulosa 추출물(ECH 70% 이상 함유, Tianlife TLCT-E70; Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, China)에서 반복적인 에탄올 추출에 의해 추가로 정제한 후 공기- 화학 흄 후드에서 건조. 나머지 물질을 동결건조에 의해 더 건조시켰다. 최종 생성물의 ECH는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 확인되었습니다(그림 1).

변형 성장 인자(TGF)- 1 발현의 녹다운

MODE-K 세포에서 TGF{0}} 발현은 TGF{3}} 전사체에 대해 특이적으로 shRNA의 안정적인 발현에 의해 녹다운되었다(19). 요약하자면, 마우스 TGF- 1 mRNA(5'-AAC CAA GGA GAC GGA ATA CAG-3') 및 비특이적 대조군(스크램블)(5'-AAT CGC)을 표적으로 하는 shRNA 생성을 위한 올리고뉴클레오티드 서열 ATA GCG TAT GCC GTT{12}}')는 이전에 기술되었으며(19, 20), Integrated DNA Technologies Inc.(미국 아이오와주 코랄빌)에서 합성했습니다. 각 서열을 pHEX-siRNA 벡터에 연결하였다(21). 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine2000(Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 벡터를 MODE-K 세포에 형질감염시켰다. 항-TGF{20}} shRNA-형질감염된(MODE-Ktgfb) 및 스크램블된 shRNA-형질감염된(MODE-Kscr) 세포는 모두 Zeocin(최대 500ug/mL)(Invitrogen-Gibco)의 존재 하에 성장되고 선별되었습니다. 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 유세포 분석을 사용한 세포 분류에 의해. 형질감염된 세포의 95% 이상이 유세포 분석 또는 현미경 검사에서 강한 녹색 형광을 보였습니다.

메틸티아졸 테트라졸륨(MTT) 분석

MTT 분석은 배양물에서 세포 증식 또는 생존력을 측정하는 데 사용되었습니다. 세포를 {{1}웰 마이크로플레이트에 웰당 2500개로 시딩하고 각 조건을 최소 4회 테스트했습니다. 간단히 말해서, 3-(4,5-디메틸티아졸{8}}일)-2,{10}}디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT, Sigma- Aldrich Canada, Oakville, ON, Canada)를 각 웰에 첨가하고 37도에서 4시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 생존 세포의 포르마잔 결정을 100 μL/웰의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma-Aldrich Canada)에 용해시켰다. 각 웰의 색상 흡광도는 ELx808 Ultra Microplate Reader(BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 560 nm 파장에서 흡광도 단위(AU)로 정량화되었습니다. 비약물 처리된 대조군에 대한 약물 처리된 배양물의 세포 증식 변화 백분율을 다음과 같이 계산하였다: 퍼센트 =(약물 처리 - 대조군) / 대조군 × 100%. 성장 속도는 다음과 같이 계산되었습니다. 성장 속도(AU/일)=(AUend - AUbegin) / 시간(일), 여기서 시간은 검사 기간을 나타내고, AUend는 검사 종료 시의 흡광도 단위를 나타냅니다. , AU 시작은 검사 시작 시 흡광도 단위를 나타냅니다.

아폽토시스의 형광 활성 세포 분류(FACS) 분석

Annexin-V-phycoerythrin( Annexin-V-PE) 및 7-amino-actinomycin D(7-AAD) 염색을 사용한 FACS 분석은 세포 사멸(Annexin-V 양성: 조기 세포 사멸 ; 7-AAD: 후기 아폽토시스/괴사) 제조사의 프로토콜(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 따름. 따라서 FACS 그래프에서 생존 가능한 세포는 왼쪽 아래 사분면에 있었고 후기 세포자멸사는 왼쪽 위 사분면에 있었고(7-AAD 양성만), 오른쪽 위 사분면에는 아폽토시스 세포(Annexin-V 및 {{ 10}}AAD 양성), 우측 하단 사분면의 조기 세포사멸 세포(Annexin-V 양성만 해당). 간단히 말해서, 처리 후 세포는 트립신-EDTA 용액(Sigma Aldrich Canada)과 함께 짧은 인큐베이션에 의해 방출된 다음 15분 동안 1X 결합 완충액에서 Annexin-V-PE와 함께 인큐베이션되었습니다. PBS로 세척한 후 세포를 7-AAD로 염색했습니다. 세포 사멸 세포의 형광 강도는 유세포 분석기를 사용하여 측정하고 CELLQUEST(BD Biosciences) 또는 FlowJo(Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) 소프트웨어를 사용하여 배경 대조군과 비교하여 분석했습니다.

반정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)

TGF{0}}의 mRNA 수준은 RT-PCR 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) 이전에 설명한 대로(19). 동일한 cDNA 준비에서 TGF- 1 및 GAPDH 전사체 모두 초기 후 1분 동안 94도, 1분 및 15초 동안 57도, 1분 및 30초 동안 72도의 35주기로 PCR에 의해 증폭되었습니다. 94도에서 1분 동안 변성 단계. 72도에서 10분 동안 최종 확장 단계를 추가했습니다. TGF- 1 및 GAPDH에 대한 특정 프라이머 쌍은 이전 보고서(19)(mTGF- 1: 센스, 5'-TAC TAT GCT AAA GAG GTC ACC CGC 및 안티센스, 5 '- CTG TAT TCC GTC TCC TTG GTT CAG, mGAPDH: 센스, 5'-ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT G 및 안티센스, 5'-CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT C). 생성된 PCR 생성물(25 μL)을 0.5 ug/mL의 에티듐 브로마이드를 함유하는 Tris-acetate-EDTA(TAE) 완충액에서 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고 UV 광 하에서 가시화하였다. TGF{37}}의 발현 수준은 GAPDH의 발현 수준과 반정량적으로 비교되었다.

웨스턴 블롯

TGF{0}}의 세포 수준은 이전에 설명한 대로 웨스턴 블로팅으로 조사되었습니다(19). 블롯에서 TGF- 1 단백질 밴드는 단일클론 항-TGF- 1(A75-3)(BD Biosciences)로 확인되었습니다. 각 샘플에 로딩된 단백질을 확인하기 위해 항-액틴 IgG(Sigma-Aldrich Canada)를 사용하여 동일한 블롯을 다시 조사했습니다.

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 배양 상청액에서 분비된 TGF{1}}의 수준을 ELISA로 측정했습니다. 24-웰 플레이트의 MODE-K 세포(0.5mL DMEM 배지 중 1.8 × 105개 세포)를 3중으로 밤새 성장시킨 후 ECH의 부재 또는 존재 하에 배양(시스탄체의 에키나코사이드). 처리 24시간 후 배양 상청액을 수집하고 TGF{1}} 방출량을 제조사의 프로토콜(Promega, Madison, WI, USA)에 따라 TGF 1 Emax® ImmunoAssay System을 사용하여 측정했습니다.

통계 분석

일원 또는 이원 분산 분석(ANOVA)이 그룹 간의 비교에 적절하게 사용되었습니다. 통계 분석을 위해 각 연구에서 3-4개의 개별 실험에서 데이터를 수집했습니다. 0.05 이하의 P-값은 유의미한 것으로 간주되었습니다.

결과

MODE-K 세포 배양에서 세포 증식의 자극

세포 증식은 조직 복구에 필수적입니다. ECH의 효과(시스탄체의 에키나코사이드)배양된 MODE-K 세포에서 세포 증식에 ​​대해 조사하였다. 도 2A에 도시된 바와 같이, ECH의 첨가는 MTT 분석을 사용하여 세포 생존율의 증가에 의해 측정된 용량 의존적 방식으로 세포 증식을 자극하였다. 비 약물 처리 배양물의 세포 수와 비교하여 ECH 처리 배양물의 세포 수는 6.26ug/mL의 ECH가 있는 배양물에서 25.6% ± 14.82%, 25에서 33.6% ± 14.{14}}% 증가했습니다. ug/mL의 ECH, 64.4% ± 9.{19}}%(50 ug/mL의 ECH 포함), 99.4% ± 11.7%(100 ug/ 48-시간 배양 후 ECH의 mL(P < 0.0{{50}}01).="" 이="" 관찰을="" 추가로="" 확인하기="" 위해="" {{3{61}}}}일="" 기간의="" mode-k="" 세포="" 성장="" 곡선에="" 대한="" ech의="" 영향을="" 조사했습니다.="" 도="" 2b에="" 나타난="" 바와="" 같이="" 최적화된="" 1{64}}="" ug/ml의="" ech를="" 첨가하면="" 비약물="" 처리="" 배양액(기본="" 대조군)에="" 비해="" 배양="" 후="" 생존="" 세포="" 수가="" 크게="" 증가했으며,="" 이는="" 다음과="" 같이="" 표시됩니다.="" ech="" 치료="" 시작(0-시점)에서="" 0.3{{7{74}}}}="" ±="" 0.02에서="" ech가="" 있는="" 배양에="" 대한="" au="" 증가="" 배양="" 2일="" 후="" 1.49="" ±="" 0.08="" 및="" 배양="" 4일="" 후="" 2.20="" ±="" 0.11인="" 반면,="" 비약물="" 처리="" 배양물(배지="" 전용)의="" 경우="" 증가는="" 초기="" 0.24="" ±="" 0.01에서="" 2일="" 후="" 및="" 1.1118="" ±="" 0.="" 4일="" 후(중간="" 대="" ech,="" p="">< 0.0001).="" 성장="" 곡선(그림="" 2b)을="" 기반으로="" 계산된="" 이="" 두="" 배양물의="" 성장률은="" ech가="" 2일째="" 배양물에서="" 성장률을="" 유의하게="" 향상시켰음을="" 나타냅니다(ech="" 처리된="" 배양물에서="" 0.56="" vs.="" 비약물="" 처리된="" 대조군에서="" 0.35)="" 및="" 3일째(ech="" 처리="" 배양에서="" 0.43="" 대="" 약물="" 처리되지="" 않은="" 대조군에서="" 0.22)(그림="" 2c).="" 종합하면,="" 이러한="" 데이터는="" ech가="" 배양된="" 장="" 상피="" 세포에서="" 세포="" 증식을="" 자극한다는="" 것을="">

그림 2. ECH에 의한 배양된 장 상피 세포의 세포 성장 자극. MODE-K 세포(2,500개 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 밤새 접종한 다음 ECH의 존재 또는 부재 하에 배양했습니다. 배양물에서 생존 세포의 수는 MTT 분석에 의해 측정되었습니다. A) 배양물을 48시간 동안 다양한 농도의 ECH로 처리했습니다. ECH 처리된 배양물에서 세포 수의 증가(%)는 기본 기준으로서 비약물 처리된 배양물을 기반으로 계산되었습니다. P < 0.0001(편도="" anova).="" b)="" 배양물을="" 4일="" 동안="" 10ug/ml의="" ech로="" 처리했습니다.="" ech="" 처리="" 대="" 비약물="" 처리="" 배양물(배지만)의="" 성장="" 곡선은="" mtt="" 분석에서="" 560="" nm에서="" 흡광도="" 단위(au)에="" 의해="" 결정되었습니다.="" p="">< 0.0001(중간="" 대="" ech,="" 양방향="" anova).="" 데이터는="" 독립적인="" 실험의="" 평균="" ±="" 표준="" 유도(sd)로="" 표시됩니다.="" 다)="" 성장률(au="" 변화/일)은="" 성장률="" cu를="" 기반으로="">e, 매일의 평균 수.

아폽토시스로부터 MODE-K 세포의 보호

세포사멸로부터 세포를 보호하는 것은 추가 조직 손상을 방지하는 메커니즘입니다. ECH의 세포 보호 활성(시스탄체의 에키나코사이드)과산화수소(H2O2) 또는 전염증성 사이토카인 혼합물(TNF- 및 IFN-)로 자극된 배양된 MODE-K 세포에서 조사되었습니다. H2O2는 산화 대사에 의해 생성되는 활성 산소 종이며 산화 스트레스 시나리오를 나타내는 반면, TNF- 및 IFN-은 면역 매개 염증 하에서의 상황을 반영하는 활성화된 면역 세포에 의해 생성되는 두드러진 사이토카인입니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 ECH(5{34}} ug/mL)의 첨가는 H2O2로 처리된 배양액에서 기본 수준을 포함하여 세포자멸사를 유의하게 감소시켰으며, 이는 기본 수준 5.3에서 세포자멸사 감소로 입증되었습니다{{47 }} 퍼센트 ± 1.24%, 비약물 처리 배양액에서 3.76% ± 1.{51}}ECH 처리 배양액 1%, 비약물 처리 배양액 26.93% ± 1.{27}}퍼센트에서 14.08% ± 0.3μM의 H2O2가 있는 ECH 처리 배양액에서 1.30%, 비약물 처리 배양액의 38.90% ± 1.76%에서 0.6μM의 H2O2가 있는 ECH 처리 배양액의 19.88% ± 1.02%(P < 0.0001="" ,="" 배지/비약물="" 처리="" vs.="" ech="" 처리).="" ech의="" 유사한="" 세포="" 보호="" 효과가="" 사이토카인="" 혼합물로="" 자극된="" 배양물에서="" 관찰되었습니다(그림="" 4).="" ech를="" 첨가하지="" 않은="" 배양(배지/비약물="" 처리="" 대조군)에서="" 세포자멸사(51.5%="" ±="" 6.30%)는="" ech="" 처리="" 배양물(p="0.0204," 매체/비약물="" 처리="" vs.="" ech="" 처리),="" 이는="" ech가="" mode-k="" 세포를="" 전염증성="" 사이토카인="" 유도="" 세포자멸사로부터="" 보호함을="" 시사합니다.="" 종합하면,="" ech는="" h2o2="" 산화에="" 의해="" 유도된="" 세포="" 사멸="" 및="" 염증유발="" 사이토카인의="" 세포독성에="" 대한="" 세포="" 보호="" 활성을="">

배양된 MODE-K 세포에서 TGF-발현의 상향 조절

문헌의 증거에 따르면 TGF{0}}는 조직 손상 및 복구(22, 23) 및 대장염 또는 염증성 장 질환으로부터 위장관 회복(24)에 중요한 역할을 합니다. TGF- 1가 위에서 설명한 바와 같이 배양된 장 상피 세포에서 ECH 유도 세포 증식 및 세포 보호에 역할을 하는지 알아보기 위해 ECH의 효과(시스탄체의 에키나코사이드)배양된 MODE-K 세포에서 TGF{{0}} 발현에 대해 조사했습니다. TGF- 1의 전사체 수준은 반정량적 RT-PCR에 의해 조사되었으며, 단백질 수준은 웨스턴 블롯팅(총 세포 수준) 또는 ELISA(분비 단백질 수준)에 의해 결정되었습니다. 그림 5A에서 볼 수 있듯이, ECH를 첨가한 후 24시간과 48시간에 ECH를 처리한 배양액에서 TGF{7}} mRNA 수준의 용량 ​​의존적 상향 조절이 나타났습니다. 세포 내부의 TGF{{10}} 단백질 수준의 유사한 증가 경향은 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 입증되었습니다(그림 5B). 다양한 농도의 ECH를 함유하는 0.5mL의 배양 배지에서 24-시간 배양한 후 TGF의 분비 수준{15}}도 용량 독립적인 방식으로 증가했습니다. 비약물 처리 배양액(기저 수준)에서 186.4 ± 18.39pg/mL에서 25ug/mL의 ECH가 있는 배양물에서 186.4 ± 18.39pg/mL, 50ug/mL의 ECH가 있는 경우 263.4 ± 14.14pg/mL 및 266.4 ± 14.14pg/mL 15.56pg/mL, 100ug/mL의 ECH 포함(P < 0.0001).="" 이러한="" 모든="" 데이터는="" ech가="" 배양액의="" 장="" 상피="" 세포에서="" tgf{39}}="" 생산을="" 증가시킨다는="" 것을="" 분명히="">

TGF{0}} 발현의 유전적 녹다운에 의한 Echinacoside의 성장 자극 및 세포 보호 상실

TGF{0}}가 ECH의 성장 자극 및 세포자멸사 감소에 기여했는지 확인하기 위해(시스탄체의 에키나코사이드)-처리된 세포에서 MODE-K 세포에서 TGF- 1 발현은 anti-TGF- 1 shRNA를 안정적으로 발현하여 knockdown되어 새로운 세포주 MODE-Ktgfb가 생성되었습니다. TGF- 1 단백질 발현은 scrambled shRNA를 안정적으로 발현하는 MODE-Kscr 세포와 비교하여 MODE-Ktgfb 세포에서 크게 감소하였다(도 6A). 도 6B에 도시된 바와 같이, ECH의 증식 자극은 MODE-Ktgfb 세포에서 유의하게 손상되었고; 모 MODE-K 세포에서 ECH에 대한 증식 반응과 유사하게(그림 2), 생존 세포 수는 ECH 자극 후 MODE-Kscr 세포에서 증가했으며, 25ug/mL의 ECH를 사용한 배양에서는 28.3% ± 12.4% 증가, 5{{30}} ug/mL의 ECH에서 54.2% ± 6.8% 증가, 100ug/mL의 ECH로 배양에서 122.7% ± 2{45}}.8% 증가. 대조적으로, 세포 수는 MODE Ktgfb 세포 배양에서 ECH의 존재하에 감소, 25ug/mL의 ECH가 있는 배양에서 12.0% ± 5.0% 감소, 50ug/mL의 ECH에서 18.3% ± 4.1% 감소 및 30.4% ± 3.3%는 100ug/mL의 ECH로 감소했습니다. 양방향 ANOVA를 사용한 통계 분석은 이 두 그룹 간에 ECH에 대한 증식 반응의 유의한 차이를 나타냈습니다(P < 0.0001).="" 이러한="" 데이터는="" 장="" 상피="" 세포에서="" tgf{47}}="" 발현의="" 손실이="" ech의="" 성장="" 자극을="" 손상시킨다는="" 것을="">

ECH에서 상향 조절된 TGF{1}} 발현 여부를 추가로 조사하려면(시스탄체의 에키나코사이드)-처리된 세포는 아폽토시스 감소를 초래하였고, ECH의 항-아폽토시스 활성은 MODE-Ktgfb 세포 대 MODE-Kscr 세포에서 조사되었다. 도 6C에 나타난 바와 같이, MODE-Kscr 세포 배양과 비교하여, 세포자멸사 수준은 사이토카인이 없는 MODE-Ktgfb 세포 배양에서 더 높았다(MODE-Ktgfb vs. 11.2% ± 0.42% . 9.6% ± 0.99% in MODE-Kscr) 및 사이토카인 존재 시(20.95% ± 0.0MODE-Kscr에서 7%) Ktgfb 대 MODE-Kscr에서 15.4% ± 1.56%)(P=0.{57}}{{6{61}}}}13), TGF- 1가 안티 -MODE K 세포의 세포자살 인자. MODE-Kscr 세포 배양에 ECH(5{72}} ug/mL)를 추가하면 세포자살의 기본 수준이 크게 감소했습니다(비약물 처리에서 9.6% ± 0.99% 대 8.3% ± 0.43%). ECH 처리) 및 세포자멸사 감소의 30.2%가 사이토카인 자극 배양에서 발견되었습니다(비약물 처리에서 15.4% ± 1.56% 대 ECH 처리에서 10.75% ± 1.05%). 그러나 MODE-Ktgfb 세포 배양에서 ECH는 기본 세포자살 수준을 감소시키지 않았고(비약물 치료에서 11.2% ± 0.42% vs. ECH 치료에서 12.0% ± 0.43%) MODE-Kscr 세포 배양에서 30.2%가 사이토카인 자극 배양에서 관찰되었습니다(비약물 처리에서 20.95% ± 0.07% 대 ECH 처리에서 17.45% ± 0.35%). 이러한 데이터는 장 상피 세포에서 TGF{79}} 발현의 녹다운이 세포자멸사를 악화시키고 ECH의 세포 보호 활성을 감소시킨다는 것을 나타냅니다.

ECH의 성장 자극 및 세포 보호의 손실(시스탄체의 에키나코사이드)항체를 사용하여 TGF{0}} 활성을 중화함으로써

TGF{0}}가 ECH의 성장 자극 및 세포 보호에 필요할 수 있음을 추가로 확인하기 위해(시스탄체의 에키나코사이드)위에서 설명한 대로 장 상피 세포에서(그림 6), ECH 매개에 대한 항-TGF{1}} 항체(Clone 9016; R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, USA) 중화 효과 MODE-K 세포 배양에서 세포 증식 및 생존을 조사했습니다. 그림 7A에서 볼 수 있듯이 ECH(25ug/mL)의 첨가는 항체를 처리하지 않은 대조군에서 세포 수의 44.3% ± 8.2% 증가를 자극했지만 항-TGF{13}} 항체가 있는 경우 , 11.3% ± 9.1{39}}% 세포 수 손실이 동일한 ECH 처리 배양에서 관찰되었으며, 이는 TGF{18}} 활성을 중화하면 장 상피 세포에서 ECH의 성장 자극이 감소함을 시사합니다. 추가 실험은 항-TGF{19}} 항체가 MODE-K 세포 배양에서 ECH의 세포 보호 활성을 중화시키는 것으로 나타났습니다. ECH의 추가는 24시간 배양 후 세포자멸사를 비약물 처리 배양액의 4.37% ± 1.19%에서 ECH 처리 배양액의 1.72% ± {{50}}.01%로, 11.13% ±에서 감소했습니다. 비약물 처리 배양물에서 1.12%에서 48시간 배양 후 ECH 처리 배양물에서 9.13% ± 0.02%(비약물/배지 대 ECH, 양방향 ANOVA, P=0.0001). 그러나 항-TGF{46}} 항체가 있는 경우 ECH 처리 배양에서 세포자멸사({52}}h 배양 후 2.88% ± 0.01%, 48-h 배양 후 12.58% ± 0.02%) ) 대조군 배양(비약물 처리)(two-way ANOVA, P=0.9427)에서와 크게 다르지 않았으며, 이는 항-TGF- 1 항체가 장내 ECH 매개 생존을 방해함을 암시합니다. 상피 세포.

논의

ECH(시스탄체의 에키나코사이드)허브 Cistanche spp.의 추출물에서 주요 PhG 뿐만이 아닙니다. Echinacea spp.와 같은 다른 많은 약용 식물에서도 발견됩니다. (25, 26). 이 천연 화합물은 시험관 내 및 생체 내에서 항산화 활성이 있는 것으로 보고되었습니다(13, 27, 28). 그러나 그 작용 메커니즘은 아직 알려지지 않았습니다. 본 연구의 결과는 처음으로 시험관 내 모델에서 ECH가 TGF- 1에 의존하는 장 상피 세포 증식과 생존을 자극한다는 것을 보여줍니다.

ECH의 추가(시스탄체의 에키나코사이드)H2O{1}} 또는 전염증성 사이토카인 혼합물(TNF- 및 IFN- ) 처리된 MODE-K 세포(그림 3 및 4) 및 다른 세포 유형(16, 29)에서 세포 사멸을 감소시키고, TGF{11}} 발현을 억제하거나 그 활성을 차단하면 항-세포자멸사 활성이 사라지고(그림 6 및 7), 이는 ECH의 세포 보호가 TGF{15}} 생산에 의존함을 나타냅니다(그림 5). 우리의 이전 연구에서는 TGF{17}}가 항세포자멸사 Bcl{19}} 발현을 유도하고 신세뇨관 상피세포에서 TNF 매개 세포자멸사를 예방한다는 것을 보여주었습니다(19). 다른 세포 유형에서도 유사한 결과가 보고되었습니다. 배양된 폐동맥 내피 세포에 TGF{22}}를 추가하면 Bcl{24}}의 기준 수준을 상향 조절하고 혈청 결핍 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-수용체 차단으로 인한 세포자멸사를 방지합니다(30). 배양된 신경 전구 세포(NPC)에서는 Bcl{31}} 발현의 상향 조절과 상관관계가 있는 H2O2 처리에 대한 세포 생존을 (약 76%까지) 향상시킵니다(31). MODE-K 세포에서 Bcl{33}} 발현에 대한 ECH의 영향은 이 연구에서 조사되지 않았지만, Bcl{35}} 상향 조절과 ECH의 항세포자멸사 활성의 상관관계는 TNF에서 보고되었습니다. - – 처리된 SHSY5Y 신경 세포(29) 또는 H2O{42}}처리된 PC12 세포(15). 종합하면, 이러한 데이터는 ECH의 항세포자멸사 활성이 Bcl{47}} 경로를 통해 TGF{46}}에 의해 매개될 수 있음을 시사합니다.

ECH의 세포 보호가 가능합니다.(시스탄체의 에키나코사이드)배양 종료 시 자발적인 세포 사멸을 감소시켜 생존 세포 수의 약간의 증가에 기여할 수 있지만 ECH(100 ug/mL)의 첨가는 48-시간 처리 후 생존 세포를 거의 두 배로 늘립니다(그림 2A). , 이는 ECH가 실제로 세포 증식을 자극함을 시사하며, 이는 그림 2, B 및 C의 데이터에 의해 추가로 확인됩니다. ECH의 유사한 효과가 인간 섬유아세포 MRC{4}}(17)에서 보고되었습니다: in MRC{ {6}} 세포 배양, ECH는 G1기에서 S기 및 G2기로의 세포 주기를 유도하여 세포 노화를 지연시킬 수 있습니다. ECH의 항세포사멸 활성과 마찬가지로 ECH의 증식 활성은 TGF{10}}(그림 6 및 7)에 의존하며, 이는 다기능 사이토카인으로 잘 문서화되어 있습니다(32, 33). TGF-는 세포 유형 또는 세포외 미세 환경에 따라 세포 증식을 자극하거나 성장 정지를 유도할 수 있습니다. Smads 및 non-Smad(예: mitogen-activated protein kinases)(34, 35)를 포함한 여러 신호 전달 경로를 활성화하지만 MODE-K 세포에서 ECH/TGF 자극 세포 증식을 매개하는 경로는 추가 조사가 필요합니다.

현재까지 ECH의 표적 단백질에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.(시스탄체의 에키나코사이드)또는 그것이 조절하는 신호 경로(들). 한 연구에 따르면 ECH 처리는 내피 세포에서 고리형 구아노신 모노포스페이트(cGMP)의 세포 수준을 증가시키고(36), 8-브로모-cGMP를 추가하면 심장 섬유아세포에서 TGF{3}} 발현이 약간 증가합니다(37 ). 그러나 ECH 처리가 cGMP를 상승시키고 ECH가 배양된 장 상피 세포에서 TGF{5}} 발현을 자극하는지 여부는 추가 조사가 필요합니다.

결론적으로, 우리의 연구는 ECH가(시스탄체의 에키나코사이드)배양된 장 상피 세포에서 세포 증식과 세포 생존을 매개하는 TGF{0}} 생산을 유도합니다. 장 상피의 TGF 신호 전달은 덱스트란 설페이트 나트륨 유발 대장염이 있는 생쥐의 점막 손상 복구 또는 치유에 필요하며(38), 이는 ECH, 아마도 ECH를 함유한 허브 C. Deserticola 또는 기타가 점막 손상을 촉진하는 치료 가능성을 가질 수 있음을 시사합니다. 환자의 수리.

승인

YJ는 중국 중국 장학 위원회의 대학원생 장학금으로 지원을 받았습니다.

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