난소 적출 쥐의 뼈 손실에 대한 Cistanches Herba Aqueous Extract의 효과

연락처: 오드리 후audrey.hu@wecistanche.com

Haidong Liang 1,*, Fang Yu 2, Zhihong Tong 1 및 Zaiguo Huang 3

1 Hands and feet microsurgery, Dalian Municipal Central Hospital, Dalian 116033, China; E-Mail: tongzhih37@sina.cn

2 School of Medicine, Dalian University, Dalian 116033, China; E-Mail: yufangk7@sina.cn

3 Orthopedics Department, Dalian Municipal Central Hospital, Dalian 116033, China; E-Mail: huangzg41@sina.com

추상적인:난소 절제술(OVX) 쥐의 뼈 손실을 예방하는 중국 전통 의학 Cistanches Herba 추출물(CHE)의 능력을 평가하기 위해 Cistanches Herba 추출물(CHE)을 쥐에게 위내 투여했습니다. 암컷 쥐를 펜토바르비탈 나트륨(40 mg kg-1, ip)으로 마취하고 양쪽 난소를 제거했습니다. 가짜 수술 그룹의 쥐는 마취, 개복술 및 난소 제거 없이 봉합되었습니다. 수술 후 1주일 후, OVX 쥐를 무작위로 세 그룹으로 나누고 3개월 동안 H2O(OVX 그룹) 또는 CHE(매일 100 또는 200 mg kg-1)로 경구 치료했습니다. 가짜 수술 그룹(n=8)은 H2O로 경구 처리되었습니다. 3개월 후, 가짜 수술, 난소 적출 및 Cistanches Herba 추출물을 처리한 쥐에서 총 체골 무기질 밀도(BMD), 골 무기질 함량(BMC), Bone biomechanical index, 혈액 무기질 수준 및 혈액 항산화 효소 활성을 조사했습니다. 결과는 Cistanches Herba 추출물 처리가 용량 의존적으로 골밀도(BMD), 골미네랄 함량(BMC), 최대 하중, 최대 하중에서의 변위, 최대 하중에서의 응력, 자동 파단에서의 하중, 자동 파단에서의 변위를 유의하게 향상시키는 것으로 나타났습니다. , 자동 휴식 시 스트레스, 혈액 항산화 효소 활성, OVX 그룹에 비해 혈중 Ca, Zn 및 Cu 수치 감소. 이 실험은 난소 절제된 쥐에 Cistanches Herba 추출물을 투여하면 뼈 손실을 역전시키고 골다공증을 예방한다는 것을 보여줍니다.

키워드:난소 절제술; 쥐; 뼈; 항산화제; 시스탄체스 허바

시스탄체스 허바

1. 소개

골다공증은 골밀도의 감소가 뼈의 완전성에 필요한 수준 이하로 감소하는 지점에서 예외 없이 미세구조의 악화가 심해져서 골절이 발생할 때까지 무증상으로 흔히 발생하는 골 소실과 관련된 노화 질환이다. 골다공증은 건강 관리에서 매우 중요합니다. 비록 질량은 감소했지만 뼈는 광물화에 있어 정상이지만 조직학적으로 거친 해면골의 피질 두께와 소주 수 및 크기의 감소가 있다[1-3].

이 질병에 대한 많은 연구가 최근 몇 년 동안 수행되었습니다. 축적된 데이터에 따르면 폐경기의 에스트로겐 손실은 이 호르몬이 파골세포 활성의 주요 음성 조절자이고 [4-6], 파골세포가 골다공증에서 뼈 리모델링을 담당하는 주요 세포이기 때문에 질병의 발병기전에 주요 기여자임을 나타냅니다. [7].

폐경 후 골다공증은 가장 흔한 대사성 골질환으로, 급속한 무기질화된 골조직의 소실, 골소주 구조의 붕괴, 무기질 침착물의 결정질 특성의 변화를 특징으로 하며, 이는 골조직의 구조적 실패(골절)를 초래한다. 척추뼈, 엉덩이 및 원위 팔뚝과 같은 해면골이 풍부한 부위 [8-11]. 에스트로겐 결핍은 폐경 후 여성의 골 손실의 주요 결정 요인으로 간주됩니다. 난소 절제된 쥐와 개는 골다공증 모델에서 광범위하게 사용되었습니다. 1996년에 난소 절제된 개에 대한 ibandronate의 효과가 보고되었습니다[12].

Cistanche Deserticola YC Ma의 홀로 기생 식물인 Cistanches Herba (CH)는 한방에서 긴장 완화제로 분류되며 일반적으로 건망증, 청력 상실, 불임 및 만성 변비 치료에 사용됩니다. CH는 항통각수용성, 항염증성 및 면역증강 효과를 포함한 다양한 약리 활성을 갖는다[13,14]. 이전 연구에 따르면 Cistanches Herba는 골간엽줄기세포(BMSC)가 조골세포로 분화하도록 유도할 수 있으며, 이는 골다공증 및 골절 불유합 치료에 유리한 전망을 약속합니다[15]. Chen et al. [16]은 Cistanches Herba 다당류가 골수 저하된 빈혈 생쥐에서 골수 세포 주기 전환 및 조혈 기능 회복을 촉진하고 rubrum 계통 및 macronucleus 계통에서 조혈을 촉진할 수 있다고 보고했습니다.

이 연구에서는 가짜 수술, 난소 절제술 및 Cistanches Herba 처리 쥐에서 뼈 미네랄 밀도(BMD), 뼈 미네랄 함량(BMC), 뼈 생체 역학적 지수, 혈액 미네랄 수준 및 혈액 항산화 효소 활성을 조사하여 치료 효과를 연구했습니다. 뼈 품질에 Cistanches Herba 추출물과 함께.

중국 전통 의학 Cistanches Herba 추출물 (CHE)

2. 재료 및 방법

2.1. Cistanches Herba 수성 추출물의 제조

Cistanches Herba는 2010년 Nei Monggol(내몽골) 자치구의 alxa 리그의 사막에서 채집되었습니다.

Cistanches Herba의 건조된 줄기를 100도에서 2시간 동안 증류수로 추출하였다. 용액을 10분 동안 4000 r/min에서 원심분리하였다. 잔류물을 여과로 제거하고 합한 여액을 가열하여 증발시켜 원하는 농도(2.1g 건조 식물 등가 추출물/mL)를 얻었다. 추출 수율은 13.7%(w/w)였다. 수성 추출물은 2-8도에서 보관되었습니다.

2.2. 동물

실험 시작 시 체중이 240~270g인 3개월 된 암컷 Wistar 쥐 32마리를 연구에 사용했습니다. 그들은 표준 실험실 쥐 음식과 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간 명암 주기의 표준 실험실 조건에서 유지되었습니다.

2.3. 동물 실험.

암컷 쥐를 펜토바르비탈 나트륨(40 mg kg-1, ip)으로 마취하고 양쪽 난소를 제거했습니다. 가짜 수술 그룹의 쥐는 마취, 개복술 및 난소 제거 없이 봉합되었습니다. 수술 후 1주일 후, OVX 쥐를 무작위로 세 그룹(각 그룹에서 n=8)으로 나누고 H2O(OVX 그룹), Cistanches Herba extract(CHE)(100 또는 200 mg/kg)로 위 내 처리했습니다. 매일 -1) 3개월 동안. 가짜 수술 그룹(n=8)은 H2O로 경구 처리되었습니다.

연구 마지막 날에 동물의 체중을 측정하고 희생시켰으며 혈액 샘플을 동시에 수집했습니다. 대퇴골을 해부하고 생체 역학 테스트의 측정을 위해 연조직을 제거했습니다.

모든 실험은 중국 동물 관리 위원회에서 수립한 연구 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

2.4. 골밀도 측정법

Hologic QDR{0}}W DXA를 사용하여 대퇴골 골밀도(BMC)와 골밀도(BMD)를 측정했습니다. 기기는 0.{6}}254cm의 줄 간격, 0.0127cm의 해상도, 0.9cm 직경의 콜리메이터를 사용하여 초고해상도 모드에 맞게 조정되었습니다. 뼈를 페트리 접시에 넣었습니다. 뼈 주변의 연조직 밀도를 시뮬레이션하기 위해 뼈 주위에 수돗물을 부어 깊이가 1cm가 되도록 했습니다. BMC 및 측정된 면적에 대한 결과가 제공됩니다. 이 면적의 BMD는 BMC를 면적으로 나누어 계산합니다. 전체 대퇴골에 대한 결과 외에 대퇴골의 원위부와 중간부를 소영역으로 분석하였다[17].

2.5. 뼈 생체역학 테스트

대퇴골 뼈는 3점 굽힘 시험용으로 구성되고 10- kN 로드 셀(Instron, Canton, MA, USA), 앞서 설명한 대로 [18]. 크로스헤드 속도는 50mm/분이었고 데이터 샘플링 속도는 10샘플/초였습니다. 최대 하중, 최대 하중 시 응력, 파손 시 하중 및 파손 시 응력은 Series IX, v 8.08.{11}} 소프트웨어(Instron)를 사용하여 대퇴골에서 결정되었습니다.

2.6. 생화학적 분석

혈액의 Ca, Zn 및 Cu 수준은 원자 흡수 분광광도법으로 측정되었습니다.

King and Armstrong[19]의 방법에 기초하여, 기질로 이나트륨 페닐 포스페이트를 사용하여 알칼리성 인산분해효소(ALP) 활성을 분석했습니다. 10분 후 UV-vis 분광광도계에서 510 nm에서 현상된 색상을 판독했습니다. ALP의 활성은 IU/L로 표시하였다.

혈액 malondialchehyche(MDA) 농도는 Jain et al. [20], TBA 반응성 기준. 간단히 말해서, 0조직에서 얻은 적혈구 펠렛 또는 상청액 .2mL, 0인산염 완충액(pH 7.4) .8mL, 0.{17}}BHT 25mL 및 { {19}} 0.5mL 30% TCA를 튜브에 첨가하고 혼합했습니다. -20도에서 2시간 인큐베이션 후, 혼합물을 15분 동안 원심분리(4000×g)하였다. 그 후, 1mL의 상등액을 취하여 각 튜브에 첨가한 다음, 0.1M EDTA 및 0.075mL를 첨가하였다.

0.25mL의 1% TBA를 첨가했습니다. 테프론 라이닝된 나사 캡이 있는 이 튜브를 수조에서 90도에서 15분 동안 인큐베이션하고 실온으로 냉각했습니다. 광학 밀도는 혈액 MDA 농도에 대해 532에서 측정되었습니다.

glutathione peroxidase(GSH-Px)의 활성은 Lawrence와 Burk의 방법에 따라 결정되었다[21]. 분석 혼합물은 2.{3}} mL의 75mM 인산염 완충액(pH 7.0), 50μL의 60mM 글루타티온, {{15} }.1mL의 3{19}}단위/mL 글루타티온 환원효소, 015mM EDTA 0.1mL, 3mM NADPH 0.1mL 및 3.0mL의 최종 부피에 대한 적절한 양의 조직 상청액 . 0.1mL의 7.5mM H2O2를 첨가하여 반응을 시작하였다. NADPH를 NADP plus로 전환하는 동안 흡광도 변화율을 340 nm에서 3분 동안 분광광도계로 기록했습니다. 조직에 대한 GSH-Px 활성은 NADP로 산화된 NADPH의 μmole + min-1 mg-1 단백질로 표현되었습니다.

SOD(Superoxide dismutase)의 활성은 Sun et al. [22]. 이 방법의 원리는 크산틴-크산틴 산화효소 시스템을 과산화물 발생제로 사용하여 니트로블루 테트라졸륨(NBT) 환원을 억제하는 것에 기반합니다. 활성은 조직 균질물(10%)의 메탄올/클로로포름(5/3, v/v) 추출물 10000g의 상등액에서 평가되었습니다. SOD의 1단위는 NBT 감소율을 50% 억제하는 효소량으로 정의하였다.

카탈라아제(CAT) 활성은 Abei의 방법을 사용하여 측정되었습니다[23]. 혈청을 2.89mL의 50mmol/L 인산염 완충액(pH 7.{6}})이 들어 있는 큐벳에 첨가했습니다. 반응은 25도에서 3.0mL의 최종 부피를 만들기 위해 새로 준비된 30mmol/L H2O2 0.1mL를 첨가하여 시작되었습니다. H2O2의 분해 속도는 분광 광도계에서 5분 동안 240 nm에서 측정되었습니다. CAT의 1단위(U)는 25도 및 pH 7.8에서 분당 1nmol의 H2O2를 분해하는 데 필요한 효소의 양으로 정의되었습니다.

2.7. 통계 분석

실험 결과는 각 그룹의 8마리 동물에 대한 평균 ± SD로 표현되었습니다. 생화학적 매개변수는 분산 ANOVA의 일원 분석에 이어 Dunnett의 다중 비교 테스트(DMCT)를 사용하여 통계적으로 분석되었습니다. 의 p-값<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. 결과

연구 과정에서 두 마리의 동물이 만료되었습니다. 결과적으로, 연구 결론에서 그룹의 숫자는 다음과 같습니다. 가짜 대조군에서 8개; OVX 그룹의 7개; CHE 처리군에서 7명(매일 100mg kg-1), CHE 처리군에서 8명(매일 200mg kg-1). 수술 2일 후 쥐의 음식과 물 섭취량은 수술 전보다 약간 낮았다. 어떤 동물도 감염과 아나비오시스로 고통받지 않았습니다. 임상적으로 명백한 부작용은 쥐에서 관찰되지 않았습니다.

수술 전 쥐의 체중에는 그룹 간 유의한 차이가 없었습니다(p > {{0}}.01). OVX 그룹의 체중은 가짜 그룹보다 유의하게 낮았습니다(p < 0.{16}}1)(표="" 1).="" cistanches="" herba="" 추출물을="" 매일="" 1{18}}0="" 및="" 200mg/kg의="" 용량으로="" 투여하면="" che="" 처리="" 그룹(매일="" 100="" 및="" 200mg/kg)에서="" 쥐의="" 체중이="" 유의하게="" 증가했습니다(p="">< 0.05).="" 동물에서="" 얻은="" 데이터는="" ovx="" 그룹과="" 가짜="" 대조군의="" bmd와="" bmc="" 사이에="" 통계적으로="" 유의한="" 차이가="" 있음을="" 보여주었습니다(p="">< 0.01).="" 예상대로="" 200="" mg/kg의="" 참깨="" 추출물="" 투여는="" che="" 처리군의="" bmd와="" bmc를="" 유의하게="" 증가시켰다(p="">< 0.05;="" p=""><>

4. 토론

골다공증은 에스트로겐 결핍 및 노화와 관련된 가장 흔한 장애 중 하나입니다. 폐경은 증가된 골 회전율, 골 형성과 골 흡수 사이의 불균형, 순 골 손실을 초래합니다. 에스트로겐 결핍으로 인한 골 손실은 주로 인간과 실험 동물 모두에서 파골 세포 골 흡수의 증가로 인한 것입니다[24].

골다공증은 노인 남성과 여성 모두에게 영향을 미치지만, 폐경 후 여성이 골다공증의 주요 초점이었습니다[25,26]. 여성 호르몬의 급격한 결핍은 폐경 후 여성의 골다공증에 가장 중요한 요인입니다. OVX 쥐 모델은 난소 절제술이 초기에 뼈 형성보다 과도한 뼈 흡수를 초래하고 뼈 손실을 유발하는 폐경 후 골다공증에 대한 연구에서 가장 일반적으로 사용됩니다[27,28]. OVX 수술은 수술의 성공을 평가하는 이정표가 될 수 있는 상당한 체중 증가를 유발합니다[29]. 본 연구 말미에 OVX 그룹의 체중은 sham 그룹에 비해 현저하게 감소했으며 Cistanches Herba 추출물 처리는 이러한 감소를 완전히 방지했습니다. 우리는 OVX가 쥐의 음식 섭취에 영향을 미치는 심각한 생리학적 불편을 야기했다고 가정합니다. 그 후, OVX 그룹의 체중이 현저히 감소했습니다.

골밀도는 단순히 골강도의 대리 척도로 설명되어 왔다[30]. 그러나 미세구조적 특성은 소주골의 품질에 대한 치료의 진정한 영향을 평가하기 위해 새롭게 등장한 지표입니다. 낮은 골량은 골절의 주요 위험 요소이지만[31], 미세 구조 사이의 밀접한 상관 관계가 보고된 많은 연구에서 입증된 바와 같이 소주골 구조의 보존은 골 강도에 크게 기여하고 BMD와 BMC를 넘어 골절 위험을 줄일 수 있습니다. 뼈의 특성과 생체역학적 강도 [32,33]. 이 연구에서 BMD와 BMC는 가짜 그룹과 난소 절제 그룹 간에 유의하게 다른 것으로 나타났습니다. Cistanches Herba 추출물로 치료하면 OVX 쥐에서 BMD와 BMC가 크게 향상되었습니다. 또한 Cistanches Herba 추출물의 투여는 최대 하중, 최대 하중에서의 변위, 최대 하중에서의 응력, 자동 파괴에서의 하중, 자동 파괴에서의 변위 및 자동 침입에서의 응력을 CHE 처리군에서 용량 의존적으로 여전히 유의하게 증가시켰다. OVX 그룹에 비해 이러한 결과는 Cistanches Herba 추출물을 먹인 쥐의 대퇴골 뼈가 실패 시 더 높은 하중을 가짐으로써 스트레스 골절에 더 저항할 수 있음을 나타냅니다. 또한 OVX 그룹의 쥐는 가짜 그룹의 쥐보다 혈중 Ca, Zn 및 Cu 수치가 더 높았습니다. Cistanches Herba 추출물의 투여는 OVX 쥐의 혈중 Ca, Zn 및 Cu 수치를 감소시켰습니다.

골다공증에서 산화 상태가 중요하다는 개념은 산화 스트레스가 중요한 역할을 하는 질병인 골다공증과 죽상동맥경화증 사이의 강력한 역학적 연관성과 일치합니다. 더욱이, 최근에 여성에서 산화 스트레스(산화 스트레스의 바이오마커, 8-iso-PGF2-로 측정됨)[34], 항산화 수준[35] 사이에 연관성이 있는 것으로 관찰되었습니다. 골밀도. 식이 및/또는 보충 아스코르브산염과 인간의 골량 사이의 관계를 조사한 임상 연구에서도 골량 증가와 관련이 있음을 시사합니다[36].

MDA는 아미노기에 대한 반응성이 높기 때문에 핵산과 단백질의 합성을 억제하고 효소도 비활성화시킨다[37,38]. 따라서 OVX 후 관찰되는 대퇴골 항산화 효소의 감소는 지질 과산화의 증가로 인한 것일 수 있습니다. 항산화 효소는 자유 라디칼 매개 조직 또는 세포 손상에 대한 방어 시스템에 관여합니다. 그들은 자유 라디칼 또는 반응성 산소 중간체를 비 라디칼 제품으로 대사합니다. 이러한 효소에는 글루타티온 의존성 효소 계열이 포함됩니다[39]. 이 연구에서 우리는 항산화 효소 수준의 현저한 감소를 보고합니다. 난소 절제된 쥐의 혈액 내 SOD, GSH-Px, CAT. 이러한 발견은 난소 호르몬의 결핍이 산화 스트레스에 대처하지 못하는 것과 상관관계가 있음을 시사합니다. Cistanches Herba 추출물의 투여는 OVX 쥐의 혈액 SOD, GSH-Px 및 CAT 활성을 용량 의존적으로 크게 향상시켰습니다. 이러한 결과는 OVX 동안 유발된 산화 스트레스에 대한 참나물 추출물의 더 나은 보호 효과를 나타내는 것으로 보입니다.

요약하면, Cistanches Herba 추출물은 대퇴골 BMD, BMC 값 및 혈액 Ca, Zn 및 Cu 수치에서 볼 수 있듯이 난소 호르몬 결핍으로 인한 골 손실 예방에 효과적입니다. 골다공증은 산화 스트레스와 관련이 있기 때문에 이러한 종류의 연구는 항산화제의 치료적 가치의 중요성을 입증합니다. 우리는 Cistanches Herba 추출물이 OVX 쥐의 항산화 효소 활성을 향상시키고 뼈 미네랄 성분을 감소시켜 부분적으로 뼈의 질을 향상시킬 수 있다고 가정합니다.

Cistanches Herba 추출물: 뼈 손실 방지

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