혈관성 치매의 쥐 모델에서 미토콘드리아 전구체 단백질 및 케라틴 II형 세포골격 6A의 발현에 대한 Cistanche의 배당체 효과
Mar 02, 2022
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추상적인
소개
혈관백치두 번째로 흔한 치매 유형입니다(Neltner et al., 2014; Sachdev et al., 2014; Tatlisumak et al., 2014; Sinclair et al., 2015; Thomas et al., 2015; Reijmer et al., 2016). ). 혈관성 치매 환자에서 발생하는 지속적이고 비가역적인 기억 손상은 삶의 질을 심각하게 저하시키고 환자 가족에게 막대한 경제적 부담을 준다(Barker et al., 2014; Burke et al., 2014; Chen et al., 2014). al., 2014; Brandenburg et al., 2016). 질병의 예방과 치료는 인구 고령화 국가에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 따라서 혈관성 치매의 치료에 효과적인 약물에 대한 연구에 대한 관심이 높아지고 있다.
시스탄체중국 전통 의학 이론에서 방향성으로 사용되는 식물입니다(Chen et al., 2014; Szalárdy et al., 2015; You et al., 2015). 의 배당체시스탄체(GC)는 다음에서 추출한 제제입니다.시스탄체. GC가 축삭 재생을 개선할 수 있다는 아이디어를 뒷받침하는 상당한 증거가 있습니다(Procaccio et al., 2014; Love et al., 2015; Brandenburg et al., 2016; Gu et al., 2016). 수많은 동물 연구에서 GC가 인지 기능을 향상시키는 것으로 나타났습니다(Procaccio et al., 2014; Talarowska et al., 2014; Fischer and Maier, 2015).
우리는 이전에 양측 총경동맥 폐색을 사용하여 쥐 모델을 설정했습니다.혈관백치. 이 모델에서는 GC 개입 후 공간 학습과 기억력이 크게 향상됩니다(Chen et al., 2015). GC는 또한 조절하고 개선할 수 있습니다.면역그러나 신경 강장제 및 기억 강화제로 가장 잘 알려져 있습니다(Chen et al., 2014; Procaccio et al., 2014; Szalárdy et al., 2015; You et al., 2015; Brandenburg et al., 2016).
그러나 GC의 영향을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 조사한 연구는 거의 없습니다.혈관백치. 여기에서 우리는 단백질체학을 사용하여 단백질과 혈관성 치매 사이의 관계를 탐구하고 GC의 신경 보호 효과의 기본 메커니즘을 결정합니다.
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재료 및 방법
동물
체중 230–270g의 6주령 수컷 특이적 병원균이 없는 Wistar 쥐(n=37)는 중국 후베이성 실험 동물 센터에서 제공했습니다(라이센스 번호: SYXK(E) { {7}}). 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국가 지침과 국제 수의 편집인 협회에서 제작한 동물 윤리 및 복지에 대한 합의 저자 지침을 따랐습니다. 원고는 동물 연구: 생체 내 실험 보고(ARRIVE) 지침에 따라 준비되었습니다.
쥐는 25도에서 12 -시간의 명암 주기와 음식과 물에 대한 자유로운 접근으로 케이지당 3마리씩 그룹으로 수용되었습니다. 쥐(n=37)를 대조군(n=10), 혈관성 치매 그룹(n=12) 및 혈관성 치매와 GC 그룹(GC 처리, n=15).
혈관성 치매 쥐 모델 구축
10% chloral hydrate로 깊은 마취하에 혈관성 치매 및 GC 처리군 쥐의 양측 총경동맥을 주변 조직에서 조심스럽게 분리한 다음 양쪽 끝의 10-0 봉합사로 단단히 결찰한 후 총경동맥 동맥이 절단되었습니다. 대조군의 쥐는 총경동맥이 노출되었지만 결찰되지 않은 것을 제외하고는 동일한 수술 절차를 거쳤습니다. 이전에 설명한 방법에 따라 Morris 수중 미로를 수행하여 동물 모델이 성공적으로 확립되었는지 확인했습니다(Chen et al., 2015).
약리학적 치료
시탕슈 파우더(인증 번호 Z20050216, Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, China) 초순수와 혼합하고 TF{2}}C Ultrasonicator(Tuofen, Shanghai, China)로 추출(power 100%, 30 정도, 40분). GC 농도는 페닐에타노이드 배당체를 분석하여 측정했습니다. 손상 후, GC 처리 그룹의 모든 쥐에게 연속 14일 동안 GC(10mg/kg/일, 1mL, 복강 내, 1일 1회)를 제공했습니다. 대조군 및 혈관성 치매 그룹의 쥐는 식염수(1mL, 복강 내)를 받았습니다.
면역조직화학
GC(또는 식염수) 투여 14일 후, 각 그룹에서 7마리의 쥐를 참수하고 뇌를 적출했습니다. 대뇌 피질을 제거하고 해마 조직을 조심스럽게 절개하고 동결 마이크로톰을 사용하여 3-μm 두께로 절단했습니다. 해마 조직의 섹션을 30-60분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고 PBS로 세척하고 3% H2O2에서 10분 동안 배양한 다음 염소 혈청에서 15분 동안 모두 실온에서 배양했습니다.
그런 다음 섹션을 토끼 항-쥐 인산화 p-타우 1차 항체에서 인큐베이션했습니다.
(1:1,000 in PBS; Bioworld Technology, Inc., TX, USA) 및 토끼 항-쥐 아밀로이드-베타(A) 1차 항체(1:1,000, Bioworld Technology, Inc.) 2-3시간 동안 37도의 젖은 상자에서 2차 항체(염소 항-마우스 IgG; Bioworld Technology, Inc.)에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. 표본은 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Dako, Tokyo, Japan)로 시각화되었습니다. 이미지는 광학 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 캡처하고 Photoshop(버전 7.{17}}; Adobe, San Jose, CA, USA)을 사용하여 처리했습니다.
면역 양성 입자는 갈색이므로 세포질의 갈색 염색을 양성 반응으로 선택하고 HMIAS{1}} 이미지 분석 시스템(Qianpin Co., 무한, 중국)을 사용하여 반정량화를 수행했습니다. 각 표본에서 무작위로 5개의 시야를 선택하고 각 시야에서 5개의 양성 셀을 선택하고 평균 회색 값을 상대 값 집합으로 측정했습니다.
시스탄체향상시킬 수 있습니다면역방지하고심혈관그리고뇌혈관질병
2차원 겔 전기영동(2-DE)
GC 또는 식염수 투여 14일 후, 각 그룹의 8마리 래트를 마취시키고 목을 베고, 해마 조직을 신속하게 채취하여 즉시 액체 질소에서 동결시켰다. 모든 조직을 막자사발과 막자를 사용하여 액체 질소에서 균질화하고 용해 완충액(7M 우레아, 2M 티오우레아, 2% CHAPS, 20mM Tris)에 수집했습니다. 불용성 입자는 4도에서 20분 동안 13,{6}} × g에서 원심분리하여 제거했습니다. 오염된 핵산은 5분 동안 간헐적인 음파 진동에 의해 파괴되었습니다. 샘플을 동일한 조건에서 다시 원심분리하고 상층액을 수집하였다. 단백질 농도는 Bradford assay(Beyotime Inc., China)를 사용하여 측정하였고 샘플은 사용할 때까지 -80도에서 보관하였다.
해마에서 단백질 발현 프로필을 조사하기 위해 2-DE는 제조업체의 지침(GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)에 따라 수행되었습니다. 단백질 용액(120 ug/샘플)은 350 μL의 최종 부피를 위해 재수화 완충액으로 조정되었습니다. Ettan IPG 또는 II 시스템(모두 GE Ettan IPGphor3, GE Healthcare)에서 IPG 스트립(pH 4–7, 크기 22cm)을 사용하여 등전점 초점을 수행했습니다. 그 후, 스트립을 15분 동안 평형화시켰다.
{{0}}DE는 Ettan DALTSix 전기영동에서 0.5% 아가로스 밀봉 접착제와 함께 12.5% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔(24cm × 19.5cm × 1.{8}}mm)을 사용하여 수행되었습니다. 시스템(GE, Ettan DALTSix, GE Healthcare).
전기영동은 2W에서 45분간 수행한 후 bromophenol blue가 2-DE gel의 바닥에 거의 도달할 때까지 17W에서 4시간 동안 분리하였다.
젤은 질산은(Damao Chemical Reagent Factory, Tianjin, China)을 사용하여 염색되었고 이미지는 2-DE 이미지 스캐닝 시스템(VT, USA)에서 캡처되었습니다.
Image Master 2D Platinum 5.0 소프트웨어(GE, Inc., PA, USA)를 사용하여 2-DE 이미지를 스캔하고 분석했습니다.
4700 MALDI TOF/TOF 질량 분석기(GE, Inc.)를 사용하여 정보를 얻었습니다.
매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석기
펩타이드 질량 핑거프린팅 및 후속 분석을 위해 겔을 슬라이스하고 제조업체의 지침에 설명된 대로 겔 내 프로토콜을 약간 수정했습니다. 메탄올(Fisher M/4056/17), 아세토니트릴(Fisher A/0626/17), 트립신(Promega V5280), 트립신 분해 용액(Promega V530), 중탄산암모늄(Sigma A6141), C{8}} ZipTip (Millipore ZTC18M096) 및 트리플루오로아세트산(GE HealthCare).
간단히 말해서, 단백질 스폿을 탈색 용액(30mM K3Fe(CN)6:100mM NaS2O3=1:1)으로 탈색하고 100mm 중탄산암모늄 및 아세토니트릴로 탈수하고 실온에서 20분 동안 트리클로로메틸 포스페이트로 환원시키고, 그런 다음 암실에서 30분 동안 요오도아세트산에서 알킬화시켰다. 겔을 37도에서 25mM 중탄산암모늄, pH 8.6 중 12ng/μL 변형된 트립신 용액 50μL에서 밤새 인큐베이션하였다. 1% 포름산/2% 아세토니트릴을 사용하여 젤 플러그에서 펩티드를 추출하고 C{18}} Zip-Tip을 사용하여 농축했습니다. 그 후, 96개 샘플 지점과 24개 보정 지점에 대해 알파-시아노{22}}하이드록시신남산 매트릭스가 있는 Prespotted AnchorChip(PAC96) 타겟을 사용하여 샘플을 준비했습니다. 4700 MALDI TOF/TOF 질량 분석기를 사용하여 질량 스펙트럼 펩티드 정보를 얻었다. 결과 데이터는 National Center for Biotechnology Information 데이터베이스의 마우스 하위 집합을 사용하여 MASCOT 데이터베이스 검색(Matrix Science, London, UK)을 호출한 GPS Explorer(Applied Biosystems Inc., NY, USA)를 사용하여 분석되었습니다.
시스탄체항균 및 예방할 수 있습니다.혈관백치
웨스턴 블롯 분석
상기와 같이 해마를 준비하고 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 샘플을 SDS 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고, 전기영동하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 옮겼다. 막을 Tris 완충 식염수와 Tween 20로 세척하고 10% 무지방 우유로 차단하고 0.05% Tween을 인산염 완충 식염수로 차단했습니다. 막을 토끼 항-미토콘드리아 전구체 단백질 다클론 항체(1:2,{11}}; Proteintech Inc., Chicago, IL, USA) 및 토끼 항-케라틴 유형 II 세포골격 6A(KRT6A)와 함께 4도에서 밤새 인큐베이션했습니다. 10% 무지방 우유에 다클론 항체(1:1,{17}}; Proteintech Inc.)가 들어 있습니다. 2차 항체인 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 염소 항토끼(Google Biotechnology Inc., 중국 후베이성 우한)를 10% 무지방 우유에 희석(1:2,{24}})하고 25도에서 배양했습니다. 1 시간 동안. 마우스 항-쥐-액틴 모노클로날 항체(1:2,{33}}; Google Biotechnology Inc.)를 내부 참조로 사용했습니다. 미토콘드리아 전구체 단백질과 KRT6A 발현 수준을 결정하기 위해 Western blot scanning system(V300; EPSON, Nagano-ken, Japan)과 AlphaEaseFC Adobe PhotoShop(Alpha Innotech, CA, USA)을 사용하여 -actin으로 정규화된 통합 광학 밀도로 표현했습니다.
통계 분석
정량적 데이터는 평균 ± SD로 표현하였다. ImageMaster 2D Platinum 5.0 소프트웨어(GE, Inc.)를 사용하여 2-DE 정보를 스캔하고 분석했습니다. GraphPad Prism 6.{6}}(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하여 양방향 분산 분석을 수행했습니다. P < 0.05는="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="">
결과
혈관성 치매 쥐 모델의 해마에서 GC가 p-tau 및 A 면역 반응성에 미치는 영향
면역조직화학은 대조군보다 GC 처리 14일 후 p-tau 및 A 발현이 더 큰 것으로 나타났다. 그러나 GC 처리군에서 이들 단백질의 발현은 혈관성 치매군보다 유의하게 낮았다(P < 0.05;="" 그림="">
혈관성 치매 쥐 모델의 해마에서 GC 조절된 미토콘드리아 전구체 단백질 및 KRT6A 발현
두 단백질의 발현은 혈관성 치매 그룹에서보다 GC 처리 그룹에서 유의하게 달랐습니다. 미토콘드리아 전구체 단백질(HSP(열 충격 단백질) 75kDa로도 알려짐)은 상향 조절되었고 KRT6A는 하향 조절되었습니다(그림 22, 33). ). 단백질 정보는 표 1에 나와 있습니다.
논의
혈관성 치매는 기억, 행동, 인지 장애를 특징으로 하는 증후군으로, 주로 뇌혈관 질환에 의해 유발된다(Barker et al., 2014; Burke et al., 2014; Oliveira et al., 2014; Szalárdy et al., 2015). 모든 유형의 치매에 공통적이며 진행을 담당하는 병리는 신경변성입니다(Foster et al., 2014; Fischer and Maier, 2015; Kalaria et al., 2015;
시스탄체면역력을 높일 수 있고예방하다혈관백치
Chen et al., 2016; Pérez-Hernández et al., 2016). 많은 식물 추출물에는 치료 특성이 있습니다. 신경변성에 대한 이러한 화합물의 생체 활성은 주로 항산화 및 항아밀로이드 생성 효과 때문입니다(Fischer and Maier, 2015; You et al., 2015; Pérez -Hernández et al., 2016).
시스탄체중국 전통 의학에서 방향성으로 사용되는 중국 허브입니다. 새로운 연구는 다음을 나타냅니다.시스탄체기억 상실증, 특히 기억 상실 진행 억제에 유익합니다(Procaccio et al., 2014; You et al., 2015; Pérez -Hernández et al., 2016). GC가 축삭 재생을 촉진하고 신경 성장 조절제로 작용할 수 있다는 상당한 증거가 있습니다(Talarowska et al., 2014; Gu et al., 2016; Xu et al., 2016). Morris 수중 미로를 사용한 이전 연구에서 우리는 GC 치료 후 혈관성 치매 쥐 모델의 탈출 대기 시간이 감소했음을 발견했으며, 이는 GC가 공간 학습 능력을 향상시킴을 나타냅니다. GC가 신경 보호 효과를 위해 광범위하게 사용되었지만(Chen et al., 2015), 이 효과의 기본 메커니즘은 아직 불분명합니다.
A 펩타이드와 p-타우가 노인성 플라크와 신경섬유 엉킴에서 높게 발현된다는 것은 잘 알려져 있습니다. A 및 타우 단백질은 뉴런의 형태 형성에 중요한 역할을 하지만 특정 병리학적 상황에서는 신경독성이 있는 비정상적인 응집체를 생성합니다(Love et al., 2015; Sadigh-Eteghad et al., 2015; Sinclair et al., 2015; Thomas et al., 2015; Wang et al., 2015; Reijmer et al., 2016). 현재의 면역조직화학 결과는 혈관성 치매의 GC 처리된 쥐 모델에서 p-tau 및 A 단백질 발현이 대조군 쥐보다 유의하게 높았지만 처리되지 않은 모델 쥐보다 낮음을 나타냅니다. 따라서 GC의 신경보호 효과는 A와 p-tau의 독성을 감소시켜 발생할 수 있다.
쥐 해마에서 우리의 proteomic 연구는 미토콘드리아 전구체 단백질, 케라틴 및 KRT6A의 발현에 큰 차이가 있음을 밝혔습니다. 기능면에서 우리는 GC의 신경 보호 효과가 수지상 척추 구조의 리모델링과 관련이 있을 수 있다고 추측합니다.
미토콘드리아 전구체 단백질은 HSP70 계열에 속합니다(Rao et al., 2014; Gutiérrez -Aguilar and Baines, 2015; McGeer and McGeer, 2015). HSP75는 분자 샤페론 활성화 및 성숙에 관여하며 세포의 안정성과 정상 기능을 유지합니다(Booth et al., 2014, 2016; Tavallai et al., 2015).
미토콘드리아 전구체 단백질은 일부 신호 전달 경로의 변환에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각됩니다(Reid et al., 2014; Booth et al., 2015a, b). 최근 연구에 따르면 HSP90 계열이 미토콘드리아 단백질 접힘의 작동 환경을 조절하는 것으로 나타났습니다(An et al., 2014; Liu and Landgraf, 2015; Roberts et al., 2015; Stary and Giffard, 2015). HSP75는 미토콘드리아에 국한되어 있으며 활성산소의 생성을 억제합니다(Radu et al., 2014; Holloway et al., 2016). 우리의 결과는 GC 처리 그룹에서 HSP75의 발현이 2.{13}}배 증가했음을 보여줍니다. 이는 GC가 항산화 역할을 하고 세포 산화 균형을 개선하며 세포자멸사를 지연시킴을 시사합니다. 이 발견은 미토콘드리아 샤페론 단백질과 다른 단백질의 상호작용에 대한 흥미로운 단서를 제공합니다.
또 다른 다르게 발현된 단백질은 KRT6A였다. 사이토케라틴이라고도 하는 케라틴은 세포질을 통해 불용성 조밀한 그물망을 생성하여 상피 세포에 구조적 지지를 제공하는 중간 필라멘트 단백질입니다(Haricharan et al., 2014; Rorke et al., 2015; Szymanski et al., 2015). . 그러나 사이토케라틴은 또한 다양한 세포 생존 과정(증식 및 세포자멸사)에서 적극적인 역할을 합니다(Zhu et al., 2013; Schwingshackl et al., 2015; Popov and Komianos, 2016). 이 단백질은 인산화를 겪을 수 있으며 상피 세포와 미세 환경 사이의 가교 접촉의 일부이기도 합니다(Lessard et al., 2013; Gil Lorenzo et al., 2014; Zhou et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). . CK6a는 유선에서 지배적인 동형이며(Bramanti et al., 2015a, b, 2016) 피부의 상처 가장자리 치유에서 상향 조절되어 사이토케라틴이 세포 증식 및 이동에 관여함을 나타냅니다. 그러나 우리는 해마에서 KRT6A의 하향 조절을 처음으로 보여주었습니다. KRT6A 발현은 혈관성 치매군에 비해 GC 처리군에서 1.{17}}배 감소했습니다.
따라서 GC의 신경보호 효과는 뇌혈관 허혈 동안 신경교세포 증식 억제와 연관될 수 있다.
함께, 우리 연구의 결과는 GC가 A와 p-tau의 발현을 감소시킴으로써 혈관성 치매의 쥐 모델에서 학습 및 기억 증진 효과를 발휘하여 이 두 독성 단백질의 축적을 약화시키고 차례로 감소 신경 독성. 또한, GC는 시냅스 세포골격 형태 형성 및 미토콘드리아 에너지 대사와 관련된 미토콘드리아 전구체 단백질 및 KRT6A의 발현을 조절할 수 있습니다. 따라서 우리의 데이터는 GC의 기본 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하여 GC가 혈관성 치매 치료를 위한 유망한 새로운 치료 옵션을 제공하는 다중 표적을 가질 가능성을 강조합니다.
각주
자금:이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, No. 30960520)의 지원을 받았습니다. 중국 내몽골 자치구 자연과학재단, No. 2016MS0837.
이해 상충: 선언된 바 없음.
연구 윤리:연구 프로토콜은 우한 제1병원 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다. 실험 절차는 미국 국립보건원의 실험동물 관리 및 사용 가이드(NIH Publication No. 8023, 1978년 개정판)와 국제수의편집인협회(IAVE)에서 발간한 "동물 윤리 및 복지에 관한 합의 저자 가이드라인"을 따랐습니다. ). 실험에 사용된 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다. 논문은 "Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments Guidelines"(ARRIVE 가이드라인)에 따라 작성되었습니다.
기고자 동의서: "출판 동의서"는 출판 전에 모든 저자를 대신하여 승인된 저자가 서명했습니다.
표절 검사: 이 논문은 중복 검사 소프트웨어인 iThenticate로 두 번 검사되었습니다.
동료 평가:이 문서의 무결성, 품질 및 중요성을 보장하기 위해 이중 맹검 및 엄격한 피어 리뷰 프로세스가 수행되었습니다.
Copyedited by Slone-Murphy J, Frenchman B, Yu J, Li CH, Qiu Y, Song LP, Zhao M
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