1부: 에키나코사이드는 뉴클레오티드 풀 살균 효소 MTh1을 억제하여 세포자멸사 암세포 사멸을 유도합니다

연락하다:joanna.jia@wecistanche.com

추상적인:뉴클레오티드 풀 살균 효소 MTH1의 억제는 암세포에서 광범위한 산화적 DNA 손상과 세포 사멸을 유발하므로 항암 전략으로 사용될 수 있습니다. 천연물은 의약 화학물질의 풍부한 공급원이었기 때문에 본 연구에서는 MTH1을 억제할 수 있는 천연 화합물을 찾기 위해 시험관 스크리닝 분석에서 MTH 촉매 효소 반응을 높은 처리량으로 사용했습니다.{1}에키나코사이드, 약용 식물에서 추출한 화합물시스탄체및 Echinacea는 시험관 내 분석에서 MTH1의 촉매 활성을 효과적으로 억제했습니다. 다양한 인간 암세포주 치료에키나코사이드그 결과 산화된 구아닌({0}}옥소구아닌)의 세포 수준이 크게 증가한 반면 세포의 활성 산소 종 수준은 변하지 않았으며, 이는에키나코사이드또한 세포 MTH1의 활성을 억제했습니다. 결과적으로, Echinacoside 치료는 DNA 손상 마커의 즉각적이고 극적인 증가와 G1/S-CDK 억제제 p21의 상향 조절을 유도했으며, 그 결과 암에서는 현저한 세포 사멸 및 세포 주기 정지가 뒤따랐지만 비암 세포에서는 그렇지 않았습니다. 종합하면, 이러한 연구는 천연 화합물을 MTH1 억제제로 확인하고 천연물이 항암제의 중요한 공급원이 될 수 있음을 시사합니다.

키워드: 에키나코사이드, MTH1, 8-oxoG, DNA 손상, 세포자멸사, 세포 주기 정지

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시스탄체추출물은항암건강 혜택

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소개

세포 및 미토콘드리아 뉴클레오사이드 삼인산(NTP) 및 데옥시뉴클레오사이드 삼인산(dNTP) 풀은 다양한 활성산소종(ROS)의 중요한 표적입니다.1-3 DNA 중합효소의 특이성은 완벽하지 않기 때문에4,5 산화된 dNTP는 고정되지 않은 경우 새로 합성된 DNA에 통합되어 유전적 이상을 유발합니다.6 예를 들어, 뉴클레오타이드 풀의 주요 산화 염기인 8-옥소구아닌(8-oxoG)은 시토신 및 아데닌과 염기쌍을 이룰 수 있습니다. DNA 복제 동안 반대 아데닌에 삽입되면 잠재적으로 T: A=G: C 전환을 유발할 수 있으며, 이는 인간 암에서 발견되는 가장 흔한 돌연변이 중 하나입니다.8,9 대부분의 산화된 유리 dNTP가 있지만 뉴클레오티드 풀 살균 효소에 의해 제거되지만, 과거의 연구에 따르면 뉴클레오티드 풀은 여전히 DNA 분자의 산화 염기의 중요한 공급원이며 산화적 DNA 손상의 중요한 기여자입니다.3,10 뉴클레오티드의 살균을 위한 가장 중요한 효소 pools.15 그럼에도 불구하고, nucleotide pool sanitizing enzymes의 감시하에서도 산화된 dNTPs의 상당 부분이 DNA에 통합되며 DNA 분자의 염기도 ROS에 의해 직접 산화될 수 있습니다. OGG1 및 MUTYH와 같은 DNA 글리코실라제와 염기 절단 복구(BER) 및 불일치 복구(MMR)를 포함한 DNA 복구 프로세스는 DNA 분자에서 문제가 있는 염기를 수정합니다.10,16,17 BER a nd MMR은 일반적으로 하루에 DNA의 수많은 산화된 염기를 복구하므로 게놈의 무결성과 안정성을 보호하는 데 중요한 역할을 합니다.

높은 산화 스트레스 하에 있는 세포에서 산화된 뉴클레오티드의 DNA로의 통합 증가는 세포 복구 능력을 압도하고 DNA 손상 반응(DDR)을 유발할 수 있습니다.18 지속적인 DDR 신호 전달은 세포 주기 정지, 조기 세포 노화 또는세포자멸사, 따라서 종양 형성에 대한 장벽을 설정합니다.19 그러나 암세포가 고도로 증가된 산화 장력을 나타내고 산화된 뉴클레오티드의 잠재적으로 치명적인 부담을 생성하더라도20 DDR 관련 노화 또는세포자멸사.21 많은 연구에서 MTH1이 종양 세포에서 위험할 정도로 풍부한 8-oxodGTP와 2-OH-dATP를 효과적으로 제거함으로써 암 발병에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다.22 MTH1은 다른 유형의 암,23-25 및 8-oxoG 수준에서 과발현되는 것으로 밝혀졌으며 산화성 DNA 병변의 정도는 주변 정상 조직보다 종양에서 낮았습니다.26-28 기능적으로 MTH1의 과발현은 유의하게 감소했습니다. MMR이 결핍된 마우스 배아 섬유아세포10에서 볼 수 있는 DNA 돌연변이의 수와 세포가 발암성 Ras로 유발된 조기 세포 노화 및 세포자멸사를 극복할 수 있게 하는 반면,29 MTH1의 억제는 OGG 결핍 마우스30에서 암 발병을 예방하고 ROS-유도 DDR 및 Ras-형질전환 세포의 세포 노화 암세포의. 최근 연구는 암 발병에서 MTH1의 역할을 뒷받침하는 더 많은 증거를 제공했습니다.31-34 다양한 암세포주에서 RNAi 또는 소분자 억제제에 의한 MTH1 억제는 게놈 DNA에 8-oxo d G의 통합을 현저히 증가시켰습니다. , 광범위한 DNA 손상, 세포 사멸 및 암세포 생존 감소로 이어집니다.32,33 마우스 이종이식 연구에서 MTH1의 억제는 암 외식편의 성장을 효율적으로 억제했습니다. 중요하게도, MTH1 억제는 정상 세포의 성장과 생존에 영향을 미치지 않았습니다. 아마도 정상 세포는 ROS가 낮고 따라서 생존을 위해 MTH1에 덜 의존하기 때문일 것입니다.32,33 이러한 발견은 MTH1 억제가 암과 싸우는 유망한 새로운 전략임을 시사합니다.

천연물은 의약 화합물의 풍부한 원천이었습니다.35 항암제를 포함한 많은 현대 치료제가 약초 또는 식물 제제에서 파생되었습니다.36-39 그럼에도 불구하고 많은 전통 약초가 다양한 치료 특성을 가지고 있다고 제안되었습니다. 그 구성을 조절하여 효능과 작용 기전을 명확하게 정의하는 데 어려움이 있기 때문입니다.40 활성 화합물의 검출과 분자 기전의 분석을 가능하게 하는 새로운 접근 방식이 필요합니다. 이와 관련하여 표적 유도 고처리량 체외 스크리닝은 천연 자원에서 기계적으로 정의된 의약 화합물을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 현재 연구에서 우리는 MTH1을 억제할 수 있는 천연 화합물을 검색하기 위해 높은 처리량의 시험관 내 분석으로 MTH{7}}촉매 효소 반응을 사용했습니다. 놀랍게도 심사 결과에키나코사이드강력한 항산화 활성으로 가장 잘 알려진 천연물은 MTH1을 억제할 수 있습니다.

Echinacoside in cistanche can anti-apoptosis

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재료 및 방법

재료

천연 허브 화합물은 중화인민공화국 상하이의 Yuanye Biological Technology Co.에서 구입했습니다. 각 화합물의 이름, 카탈로그 번호, CAS(Chemical Abstracts Service) 등록 번호 및 순도는 표 S1에 나열되어 있습니다. 화합물의 스톡 용액은 100% 디메틸 설폭사이드(DMSO)(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)에서 제조되었고 작업 용액은 분석 완충액 또는 완전 세포 배양 배지에서 제조되었습니다. 시험 화합물은 없지만 동일한 양의 DMSO를 함유하는 동일한 용액을 비히클 대조군으로 사용하였다. (S)-크리조티닙은 미국 텍사스주 휴스턴에 있는 Selleck Chemicals에서 구입했습니다.

체외 스크리닝

천연 허브 화합물을 스크리닝하는 데 사용되는 시험관 내 효소 분석은 Gad et al.32에 의해 기술된 절차를 따랐습니다. 간략하게, 개별 화합물의 연속 희석액은 100mM Tris- 아세테이트(pH 8.{11}}), 4{15}} NaCl, 10mM Mg 아세테이트, 0.005% Tween 20 및 1mM DTT. 다음으로, 0.5 nM 재조합 인간 MTH1(Abcam, Cambridge, UK), 100 μM dGTP(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 0.2 U/mL 무기 피로포스파타제(Thermo Fisher Scientific)를 첨가하고 플레이트를 인큐베이션하였다. 실온에서 1시간 동안 플레이트 셰이커. 최종 반응 부피는 96-웰 플레이트에서 100μL였습니다. 반응이 끝나면 말라카이트 그린(J&K Scientific, Beijing, People's Republic of China)41을 첨가하고 플레이트를 실온에서 추가로 15분 동안 배양했습니다. 630 nm에서의 흡광도는 BioRad 680 마이크로플레이트 판독기(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)로 측정되었습니다. 억제 농도(IC50) 값은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용한 비선형 회귀 분석에 의해 결정되었습니다.

세포 배양

인간 MG{0}} 골육종, SK-HEP{2}}간암종, MCF7 유방암, SW480 결장직장암, HEK293 배아 신장 및 마우스 NIH/3T3 섬유아세포 세포주는 American Type Culture Collection에서 가져왔으며 인간 정상 간 세포주 L-O2는 중화인민공화국 난징의 KenGen Biotech에서 구입했습니다. 이 세포는 공급자의 지시에 따라 5% CO2가 포함된 습한 대기에서 37도를 유지했습니다. 이러한 세포주의 사용에 대해 기관 검토 위원회에서 윤리 성명서를 요구하지 않았습니다.

세포내 {{0}}옥소 측정 세포내 8-oxoG 수준은 Cy{2}}접합 아비딘으로 염색하여 측정했습니다.42 총 1x1{18}}4 세포는 12-웰 플레이트의 둥근 커버슬립에 파종합니다. 다음날, 세포를 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM 또는 80 μM Echinacoside로 5시간, 12시간 또는 24시간 동안 처리한 다음 얼음으로 고정했습니다. -차가운 메탄올을 20분 동안 처리한 후 0.1% Triton X{20}}(Sigma-Aldrich)가 포함된 Tris-완충 식염수(TBS)에서 15분 동안 배양합니다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 0.1% Triton X{25}} 및 15% 소 태아 혈청이 포함된 TBS에서 차단한 다음 Cy{28}}접합 아비딘(0.5ug/mL)(Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) 37도에서 1시간 동안 용액을 차단합니다. PBS(phosphate-buffered saline)에서 5분 동안 3번 세척한 후 커버슬립을 4',{37}}디아미디노{38}}페닐린돌(Vector Laboratories, Burlingame, CA , 미국). Zeiss LCM 510 공초점 현미경으로 이미지를 촬영하고 분석했습니다.

세포내 Ros 측정 세포내 ROS 수준은 세포 기반 ROS 분석 키트(Beyotime Biotechnology, Haimen, People's Republic of China)를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정되었습니다. 6-well plate에서 성장한 세포를 0μM, 15μM, 30μM, 60μM, 80μM Echinacoside로 5시간, 12시간 또는 24시간 동안 처리하고 PBS로 2회 세척하고 10 37도에서 30분 동안 μM 디클로로플루오레세인 디아세테이트. 그런 다음 세포를 트립신 처리하고 FACSCaliber 유세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 분석했습니다. 세포 내 ROS 수준은 세포의 평균 디클로로디하이드로플루오레세인 형광 강도로 표현되었습니다. 표시된 숫자는 세 번의 독립적인 실험의 평균입니다.

면역형광 염색

커버슬립에서 성장한 세포를 {0}} μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM 또는 80 μM Echinacoside로 5시간, 12시간 또는 24시간 동안 처리한 다음 PBS로 1회 세척하고 고정했습니다. PBS 중 4% 파라포름알데히드를 20분 동안, 0.1% Triton X{12}} 및 15% 소 태아 혈청이 포함된 TBS에서 실온에서 1시간 동안 차단합니다. 고정된 세포는 8-oxoG(mouse monoclonal anti{17}}oxoG, Abcam), 53BP1(토끼 항{20}}BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery)에 대한 1차 항체로 실온에서 2시간 동안 염색되었습니다. , TX, USA) 또는 활성 caspase-3(rabbit anti-caspase-3, Bioss, Beijing, China), Alexa 488-conjugated donkey antimouse( Abcam) 또는 Cy{26}}접합 염소 항토끼(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 처리합니다. PBS에서 5분 동안 3번 세척한 후 커버슬립을 DAPI(Vector Laboratories)가 포함된 VECTASHIELD Mounting Medium에서 유리 슬라이드에 밀봉했습니다. 이미지는 Zeiss LCM 510 공초점 현미경으로 촬영했습니다.

콜로니 형성 분석

처리 전날, 세포를 6웰 플레이트에 웰당 1×1{3}}4개의 세포 농도로 파종하였다. 그런 다음 0 μM, 60 μM 또는 80 μM Echinacoside로 7일 동안 처리했습니다. PBS로 세척한 후, 세포를 얼음처럼 차가운 메탄올로 고정하고 크리스탈 바이올렛 용액(Sigma-Aldrich)(25% 메탄올 중 0.5%)으로 염색했습니다. 플레이트를 밤새 건조시킨 후 이미지를 촬영했습니다. 70% 에탄올을 첨가하여 크리스탈 바이올렛 결정을 용해시키고, BioRad 680 마이크로플레이트 판독기로 595 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다.

MTT 분석

처리 하루 전 96-웰 플레이트에 세포를 웰당 1×104개의 세포 농도로 파종한 후 Echinacoside의 연속 희석액으로 24시간 또는 48시간 동안 처리하거나 60μM Echinacoside로 5시간, 12시간 동안 처리했습니다. , 또는 24시간. 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척한 다음 3-(4,{12}}디메틸티아졸{13}}일)-2,{15} }디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT) 용액(PBS 중 5mg/mL, pH 7.2)(Thermo Fisher Scientific)을 각 웰에 첨가했습니다. 플레이트를 37도에서 추가로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, MTT 용액을 제거하고 150 μL의 DMSO를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 진탕기에서 10분 동안 인큐베이션하고, BioRad 680 마이크로플레이트 판독기로 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 실험은 3회씩 두 번 수행되었습니다. 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. IC50 값은 비선형 회귀 분석을 사용하여 결정되었습니다.

세포주기 분석

6웰 플레이트의 세포를 24시간 동안 0 μM, 6{{1{13}}}} μM 또는 80 μM Echinacoside로 처리하고 트립신으로 수확했습니다(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). , PBS로 2회 세척한 후 -20도에서 2시간 동안 얼음처럼 차가운 에탄올(70%)로 고정하였다. 고정된 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척하고 0.1% Triton X{12}}, 0.2mg/mL DNase-free RNase A(Sigma-Aldrich), 10ug/mL 요오드화 프로피디움( PI)(스위스 바젤 소재의 Hoffman-La Roche Ltd.). 암실에서 37도에서 20분 동안 배양한 후, 세포를 Falcon 나일론 메쉬(BD Biosciences)를 통해 여과하고 FAC-SCalibur 유세포 분석기에 로딩하고 ModFit 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석했습니다.

DNA 단편화 분석

6웰 플레이트에서 성장한 세포를 24시간 동안 0μM, 6{10}}μM 또는 80μM Echinacoside로 처리하고 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich)에 20분 동안 고정했습니다. PBS로 세척한 후, 세포를 DAPI(Vector Laboratories)가 포함된 VECTASHIELD 마운팅 배지에 밀봉했습니다. 핵 형태는 Olympus 형광 현미경으로 촬영되었습니다. 아가로스 겔에서 DNA 단편화를 검출하기 위해 QIAamp DNA 마이크로 키트(Qiagen NV, Venlo, the Netherlands)를 사용하여 DNA를 추출하고 0.1ug/mL ethidium bromide를 포함하는 2% agarose 젤에서 전기영동을 수행했습니다.

유세포 분석에 의한 세포자멸사 분석 아폽토시스 세포는 제조사의 지침에 따라 Annexin V-FITC Apoptosis 검출 키트(Bestbio, Shanghai, People's Republic of China)를 사용하여 조사되었습니다. {{1}웰 플레이트에서 성장한 세포를 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM 또는 160 μM Echinacoside로 2시간, 5시간, 12시간 또는 24시간 동안 처리했습니다. PBS로 2회 세척한 후, 결합 완충액에 재현탁시켰다. 다음으로 annexin V-FITC 5μL와 PI(Roche) 5μL를 순차적으로 첨가하고 암실에서 15분간 상온에서 배양하였다. 세포를 FACSCalibur 유세포 분석기(BD Biosciences)에 로딩하고 Cell Quest 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 데이터를 분석했습니다.

웨스턴 블롯 분석

6웰 플레이트에서 성장한 세포를 0 μM, 6{{1{12}}}} μM 또는 8{14}} μM Echinacoside로 5시간, 12시간 또는 24시간 동안 처리하고, PBS로 두 번 세척하고 1{18}}0μL의 방사성면역침전 완충액(150mM NaCl, 1.0% IGEPAL CA{11}}, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트)을 사용하여 플레이트를 긁어냈습니다. 및 1mM 페닐메탄 설포닐 플루오라이드를 함유하는 50mM Tris, pH 8.0)(Sigma-Aldrich). 샘플을 4도에서 20분 동안 12,{22}} x g에서 원심분리했습니다. 상층액의 단백질 농도는 Bradford 시약(Dingguo, Changchun, China)으로 측정했습니다. 샘플을 95도에서 10분 동안 변성시키고 12% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 겔에서 분리하였다. 전기영동 후, 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(Millipore)으로 옮기고 5%(w/v)를 함유한 Tween 20(10mM Tris, pH 7.5; 100mM NaCl; 0.1% Tween 20)으로 Tris 완충 식염수에서 차단했습니다. 실온에서 1시간 동안 무지방 우유. 블롯은 p21(Abcam), 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(Bioss) 또는 활성화된 카스파제{42}}(Bioss)에 대한 1차 항체로 조사한 다음 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 이차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)로 조사했습니다. 신호는 향상된 화학발광 웨스턴 블롯팅 검출 키트(Transgen Biotech, Changchun, China)를 사용하여 개발되었습니다. 실험은 세 번 반복되었습니다.

Echinacoside in cistanche can anti-apoptosis and anti-oxidation

에키나코사이드cistanche 캔에서항아폽토시스그리고항산화

미토콘드리아 측정

막 전위

제조업체의 지침에 따라 JC{0}} 염료(Biotechnology)를 사용하여 미토콘드리아 막 전위를 측정했습니다. 6-well plate에서 배양한 세포에 0μM, 60μM, 80μM Echinacoside를 5시간, 12시간, 24시간 동안 처리하고 PBS로 2회 세척한 후 JC{8}}로 20분 동안 배양했습니다. 이미지는 Olympus 형광 현미경을 사용하여 촬영되었습니다.