간세포암종의 종양세포 사멸과 면역미세환경에 대한 양성자 치료의 효과

추상적인: 양성자치료(PT)를 이용한 방사선치료는 광자치료에 비해 선량계측상의 이점이 있어 간세포암종(HCC)에 대한 방사선치료의 치료 범위를 확대하는 데 도움이 됩니다. 우리는 PT에 대한 HCC의 반응을 평가하고 기본 메커니즘을 조사했습니다. PT 조사에 의해 유도된 반응을 조사하기 위해 인간 간암 세포주 HepG2 및 HuH7과 쥐 간암 세포주 Hepa1-6을 세포 및 동물 실험에 선택했습니다. PT 조사 후 생물학적 변화와 면역학적 반응을 조사하였다. 시험관 내 실험에서는 광자 방사선 치료와 비교하여 PT 후 세포 생존에 유의미한 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 쥐의 종양 모델에서는 PT 조사 후 12일에 종양의 크기가 더 작아졌습니다. 근본적인 변화에는 DNA 손상 증가, IL{5}} 수준의 상향 조절, 면역 종양 미세 환경의 조절이 포함되었습니다. 시험관 내 및 생체 내 단백질 분석은 PT가 종양 세포에서 발현되고 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 모집하는 프로그램된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)의 수준을 증가시키는 것으로 나타났습니다. PD-L1의 증가는 방사선 조사량과 양의 상관관계가 있었습니다. Hepa1-6 동계 마우스 모델에서 PT와 항PD-L1의 조합은 PT 단독에 비해 종양 성장 지연을 증가시켰는데, 이는 종양 침윤 T 세포의 증가와 미세환경에서 MDSC 동원의 약화와 관련이 있었습니다. 더욱이, 원발성 간세포암종 종양에 PT를 적용한 경우, 항PD-L1 항체 처리 마우스는 방사선 조사를 받지 않은 동시 종양의 크기가 더 작은 것으로 나타났습니다. 결론적으로, PT에 대한 HCC의 반응은 종양 세포 사멸과 종양 미세환경에서의 면역학적 반응에 의해 결정되었다. 항종양 면역을 강화하기 위한 항-PD-L1 항체와의 조합은 PT로 치료된 간세포암종에 대한 치료 시너지 효과를 가져왔다. 우리의 결과를 바탕으로 우리는 항-PD-L1과 결합된 PT가 HCC에 대한 유망한 치료 정책이 될 수 있음을 제안합니다.

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키워드: HCC; 양성자 치료; PD-L1; 면역성 있는

1. 소개

간세포암종(HCC)은 전 세계적으로 발생하는 암으로 동남아시아에서 상대적으로 발생률이 높습니다[1]. 대다수의 환자는 진행된 종양 및/또는 불량한 간 기능으로 인해 예후가 좋지 않습니다. 전통적으로 간암 치료를 위해 정해진 용량을 사용하는 방사선 요법(RT)은 방사선 유발 간염의 위험이 높습니다. 방사선요법 전달 기술의 개선은 HCC에 대한 RT 치료 기간을 확대하는 데 도움이 되었습니다. 양성자 치료(PT)를 이용한 RT의 개발로 인해 HCC에 대한 RT의 사용이 주목을 받게 되었습니다[2,3]. PT는 암 치료, 특히 HCC, 두경부암, 유방암 치료를 위한 기존 광자 치료에 비해 선량 측정상의 이점이 있습니다. 최근 연구에 따르면 DNA 손상 유도, 산화 스트레스, 면역 세포 조절 등 RT와 동등한 상대 생물학적 유효 용량에서 광자 사이에 RT로 유발된 생물학적 변화에 차이가 있을 수 있다고 합니다[4-7]. PT의 방사선생물학적 효과에 대한 추가 조사는 암 치료를 위한 유망한 PT 전략 개발을 제공할 수 있는 기회를 촉진할 것입니다. 임상 환경에서 RT와 면역요법의 조합은 많은 적응증에 대해 유망합니다[8,9]. 만성 염증이 간세포암종 발생의 소인이 되므로 간세포암종은 면역치료의 잠재적 표적이 됩니다[10]. RT는 종양 미세환경에 전면역원성 효과와 면역억제 효과를 모두 가지고 있습니다[9]. RT가 면역원성 세포 사멸을 유발하고 항종양 면역 세포 침윤을 강화하는 것으로 나타났지만[11,12], 여러 연구에서는 RT가 사이토카인과 면역 조절 세포를 유도하여 더욱 면역을 억제하는 종양 미세 환경을 조성할 수 있음을 보여주었습니다. 면역요법과 RT의 병용은 단독 요법에 비해 종양 반응을 향상시키고 RT로 유발된 면역억제 효과를 없애는 것으로 나타났습니다[13,14]. 여러 전임상 및 임상 연구에서 광자 RT와 면역요법을 사용한 치료가 HCC의 종양 제어에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다[15,16]. 우리가 아는 한, 방사선 유발 면역 반응에 관한 거의 모든 보고서는 광자를 기반으로 한 조사를 통해 얻어졌습니다. PT에 대한 반응을 담당하는 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 HCC에 대한 보다 강력한 치료 접근법으로 이어질 수 있습니다. 종양 조절과 면역 반응을 담당하는 PT의 생물학적 효과에 대해서는 추가 조사가 필요합니다. 따라서 우리는 PT의 방사선 효과와 종양 미세 환경에서의 면역 반응을 평가하는 것을 목표로 삼았습니다. 우리는 또한 PT와 PD-L1 차단의 병용이 HCC 종양 제어에 시너지 효과가 있는지 조사했습니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 세포 배양 

인간 간암 세포주 HepG2와 쥐 간암 세포주 Hepa1-6은 Bioresource Collection and Research Center에서 입수했습니다. 또한, 인간 간암 세포주인 HuH7 세포는 Dr. Yen-Hao, Chen(Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan)으로부터 친절하게 제공받았습니다. 세포주의 사용은 우리 기관 연구윤리위원회(No. 00464-2021120952922)의 승인을 받았습니다. 세포주를 10% 소태아혈청(FBS)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하였다. 또한, 인간 단핵구 THP-1 세포를 RPMI 1640 배양 배지에서 유지하였다. THP-1 단핵구는 조건화된 배지에서 배양될 때 M1 또는 M2 대식세포로 분화될 수 있습니다[17,18]. M2 대식세포 분화를 유도하는 암세포의 능력에 대한 PT의 영향을 확인하기 위해, PT 조사 유무에 관계없이 HuH7 세포를 M2 대식세포 분극이 끝나기 24시간 전에 6-웰 플레이트에 시딩했습니다. 24시간의 공동배양 후, M2 대식세포 마커인 CD163의 발현을 대식세포로 분석하였다. 분화된 대식세포로부터 제조된 단일 세포 현탁액에 대해 FACS 구경 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 다색 형광 활성화 세포 분석(FACS)을 수행하고, 형광 표지된 단일클론 항체를 사용하여 CD163에 대한 면역염색을 수행했습니다. 시험관 내 실험은 세포 분류기, 다색 세포 분석기, 공초점 현미경을 포함한 서비스 플랫폼을 제공하는 장궁기념병원 공동 연구실에서 수행되었습니다.

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2.2. 조사

양성자의 상대적 생물학적 효과는 1.1로 설정하였고, 이 값에 양성자 선량을 곱하여 상대적 생물학적 효과(RBE) 선량을 계산하였다[19]. 본 연구에서는 RT에 의해 유발된 효과를 평가하기 위해 RBE 용량을 사용했습니다. 양성자 방사선 치료의 선량은 물리적 선량을 10%로 확대하여 Gy(RBE)로 규정됩니다. 즉, 양성자 RBE 선량=물리적 양성자 선량 × 1.1입니다. 세포와 생쥐는 RBE 용량으로 광자 또는 PT 조사를 통해 국소 RT를 받았습니다. 광자 조사는 Varian 21EX와 Eclipse 치료 계획을 사용하여 수행되었습니다. 시험관 내에서 기하급수적으로 성장하는 세포에 광자 방사선 분석을 위해 6 MV 빔을 사용하여 0, 3, 6 및 9 Gy의 단일 용량을 조사했습니다. PT의 경우 연필 빔 스캐닝(PBS)에 의한 조사가 다양한 양성자 선량(0, 3, 6, 9 및 12 Gy(RBE))에서 수행되었으며, 에너지는 세포의 경우 93.6–109.2 MeV 및 72–143.2 MeV에 해당합니다. 그리고 각각 쥐. 세포 및 마우스 조사는 임상 조건을 시뮬레이션하기 위해 확산된 브래그 피크(SOBP, 세포 PT의 경우 1cm 너비, 마우스 PT 조사의 경우 6cm 너비)의 중앙에 세포를 배치하여 수행되었습니다(그림 1a,b). 양성자 조사는 우리 병원(일본 도쿄 스미토모 중공업)에서 사용하는 사이클로트론을 통해 지속적이고 고강도 양성자 빔을 생성하여 전달되었습니다. RT 필드 크기는 전신 효과를 조사하기 위해 20 x 10 cm2, 생체 내에서 PT의 종양 제거 효과를 조사하기 위해 20 x 15 cm2, 시험관 내에서 PT의 효과를 조사하기 위해 20 x 20 cm2였습니다. Ray Station은 RT 선량 계산에 사용된 치료 계획 시스템이었습니다(버전 8.1, Ray Search Laboratories, Stockholm, 스웨덴).

그림 1. PT의 전임상 모델. 시험관 내(a) 및 동물 종양 모델에 대한 실험적 양성자 빔 설계(간 종양 조사를 위한 RT 필드, 파란색 선, 전신 효과를 조사하기 위한 RT 필드, 빨간색 선)(b).

2.3. T 세포 증식 분석

PT가 암세포와 골수 유래 억제 세포(MDSC)가 CD{1}} T 세포 증식에 ​​미치는 영향을 조절할 수 있는지 알아보기 위해 자극 후 CD{3}} T 세포의 증식을 측정했습니다. 항-CD8 마이크로비드를 사용하여 분리한 CD{4}} T 세포를 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지하고 PT 48시간 후 암세포가 있거나 없는 상태에서 CD11b+ 세포가 있는 96-웰 플레이트에 접종했습니다. CD{11}} T 세포의 증식은 항-CD3/CD28 비드(Invitrogen, Waltham, MA, USA)에 의해 자극되었습니다. CFSE 형광 염색은 자극 3일 후 유세포 분석을 사용하여 분석되었습니다.

2.4. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 CD14+HLA-DR 유도

암 환자의 말초혈액에서 CD14 발현은 있지만 인간 백혈구 항원(HLA)-DR 발현(CD14+HLA-DR-)은 없는 것을 기반으로 MDSC의 새로운 하위 집합이 확인되었습니다. PBMC에서 CD{4}}HLA-DR- 세포의 비정상적 축적은 종양 면역 회피에 기여하고 암 예후와 상관관계가 있는 것으로 보고되었습니다[20-22]. MDSC 유도에서 PT 조사의 역할을 평가하기 위해 PT 조사 암세포와 함께 24시간 동안 배양된 PBMC에서 CD{8}}HLA-DR-골수 세포의 비율을 평가했습니다. FACS(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 CD14+HLA-DR- 골수세포의 비율과 PD-L1의 발현 정도를 분석하였다.

2.5. 클론 생성 분석

생식 세포 생존 손실에 대한 RT(PT 대 광자 RT)의 효과를 조사하기 위해 클론 생성 분석을 사용했습니다. 세포 배양물에 방사선을 조사한 후 콜로니 형성을 위해 37°C에서 배양했습니다. 10일 후, 콜로니를 고정하고 콜로니 계수를 위해 크리스탈 바이올렛으로 염색했습니다. 주어진 RBE 용량에서 플레이팅 효율과 생존 분획을 결정하기 위해 콜로니에 점수를 매겼습니다. 생존율은 도금 효율을 보정한 RT 노출 후 콜로니 수입니다.

2.6. 동계(이소성 및 동소성) 종양 모델

모든 동물 연구는 동물 연구와 관련된 모든 윤리 규정을 준수했으며 우리 병원 실험 동물위원회의 승인을 받았습니다. 동물실험은 AAAALAC(국제실험동물관리평가인증협회)로부터 정식 인증을 받은 장궁기념병원 실험동물센터에서 수행되었습니다. 우리는 간 종양 이식 모델로 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다. 이소성 및 정위 종양 모델에서 종양 세포(Hepa 1–{3}} × 106 세포)를 오른쪽 허벅지 부위에 피하로 이식하거나 수술 중 간 돔 부위에 이식했습니다. 생체 내에서 PT에 대한 간 종양의 반응을 조사하기 위해 Hepa1-6 암세포를 이식한 지 14일 후에 종양에 12 Gy(RBE)에 대한 국소 PT 조사를 실시했습니다(그림 1b). 대조 마우스에는 가짜 방사선 조사를 실시했습니다. 종양 보유 면역 능력이 있는 숙주에 대한 PT의 전신 효과를 다루기 위해 우리는 Hepa1-6 암세포를 오른쪽 허벅지(1차 종양)와 등 위쪽(2차 동기 종양)에 동시에 이식했습니다. 종양 이식 후 14일째, 원발 종양에는 12 Gy(RBE)의 PT를 투여했지만 이차 동기 종양에는 투여하지 않았습니다. 그런 다음 표시된 시점에서 종양 성장(1차 조사 및 동기 비조사 종양 포함)을 관찰했습니다. PT 매개 국소 종양 조절 및 전신 효과에 대한 항PD-L1의 효과를 조사하기 위해, 종양이 있는 쥐에게 PT 조사 직후 및 치료가 끝날 때까지 2일마다 250μg의 항PD-L1 항체를 복강내 투여했습니다. 실험. 항-마우스 PD-L1(B{26}}H1, 10F.9G2) 항체는 Bio X Cell(Lebanon, NH, USA)에서 구입했습니다.

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2.7. MDSC 유세포 분석의 생체 내 분석

MDSC는 골수 세포 계통 분화 항원 Gr1과 CD11b의 공동 발현을 특징으로 합니다. 따라서 우리는 Ly{6}}G 및 Ly{7}}C의 공통 에피토프와 반응하는 특정 항-Gr1 항체와 CD11b에 특이적인 항체(BD Pharmingen)를 사용하여 마우스 MDSC를 CD11b로 정의했습니다. + Gr1+ [23]. 또한, 골수 분화 항원 Gr-1은 항-Ly-6G 및 항-Ly6C 항체에 의해 인식되는 두 개의 에피토프로 구성됩니다. CD11b+Gr-1+ MDSC 집단은 Ly-6G를 발현하는 과립구 표현형을 갖는 세포와 Ly6C를 발현하는 단핵구 표현형을 갖는 세포라는 두 가지 주요 하위 집합으로 구성됩니다. MDSC의 새로운 하위 집합은 마우스에서 CD11b+Ly6G-로 정의된 단핵구 MDSC로 확인되었습니다. 우리는 생쥐가 방사선 조사를 받은 후 MDSC 모집에 대한 조사 효과를 조사하기 위해 FACS 및 면역형광 분석을 수행했습니다. FACS는 형광 표지된 단일클론 항체(BD PharMingen)를 사용하여 CD11b, Gr1 및 LY6G에 대한 소화 및 면역염색 후 전체 종양 및 비장에서 제조된 단일 세포 현탁액에서 수행되었습니다. MDSC의 백분율은 위에서 언급한 단일클론 항체를 사용하여 다색 유세포 분석을 통해 측정했습니다. 이소형-특이적 항체는 FACS에서 음성 대조군으로 사용되었습니다.

2.8. 통계 분석

샘플은 스튜던트 t-테스트를 ​​사용하여 분석되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차(SD)로 표시됩니다. 모든 세포 실험은 조건당 3번의 생물학적 반복으로 구성되었으며[24] 적어도 3번은 독립적으로 수행되었습니다. 생체 내 실험을 위해 그룹당 6마리의 동물을 사용했으며 최소 2번의 독립적인 실험을 수행했습니다. 달리 명시하지 않는 한 통계적 유의성을 나타내기 위해 p < 0.05의 확률 수준을 사용했습니다.

3. 결과:

3.1. 간세포암종의 PT 반응에 대한 간세포암종의 반응

인간 암세포와 쥐 암세포를 0, 3, 6 또는 9 Gy(RBE)의 단일 PT 용량에 노출시키고 48시간에서의 세포 사멸과 콜로니 형성 세포의 생존율을 검사하고 비교했습니다. 광자-RT로. PT와 Photon-RT 사이의 동등한 RBE에서 세포 생존에는 유의미한 차이가 없었습니다(그림 2a,b). p-H2AX의 형성은 DNA 이중 가닥 절단에 대한 세포 반응이며, 칼레티쿨린 노출 및 높은 이동성 그룹 Box 1(HMGB1)의 존재는 RT 유발 면역원성 세포 사멸의 특징으로 작용합니다[25-27]. 그림 2c에서 볼 수 있듯이 PT는 RT 후 24시간에 DNA 손상 증가와 관련된 calreticulin 및 HMGB1 발현을 향상시켰습니다. 이전 연구[28]에서는 photon-RT가 IL-6을 상향 조절했다고 보고했는데, 이는 HCC의 RT에 대한 저항성과 관련이 있습니다. 데이터(그림 2c,d)는 PT가 PT 후 24시간과 48시간에 IF와 실시간 RT PCR을 사용하여 분석한 간암 세포에서 IL-6 수준을 상향 조절했음을 보여줍니다. PT에 의한 IL-6의 증가가 IL6 프로모터 활성과 연관되어 있는지 여부를 추가로 특성화하기 위해 IL-6 프로모터 구성체를 발현하는 벡터로 안정적으로 형질감염된 HepG2 및 HuH7 세포를 사용하여 루시퍼라제 활성 분석을 수행했습니다(그림 2e). . 정량적 데이터는 PT가 대조군 세포와 비교하여 6 Gy(RBE) 후 48시간에 IL{34}} 프로모터 활성을 증가시켰음을 시사합니다.

3.2. 면역능력이 있는 숙주의 PT 치료에 대한 반응

생체 내에서 동물 종양 모델은 새로운 항암 전략의 효능을 예측하는 데 필수적인 도구입니다. 우리는 HCC 종양 제어에 대한 PT의 효과를 조사하기 위해 동계 마우스 종양 모델을 사용했습니다. 현장에서 형광 분자 단층 촬영(FMT) 분석과 종양 크기 측정을 통한 종양 활성 관찰을 바탕으로, 우리는 sham-RT와 비교하여 PT 후 12일에 종양 포도당 흡수 활성이 유의하게 감소하고 종양이 더 작은 것을 발견했습니다(그림 3a, 비). PT에 대한 반응을 담당하는 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 PT 또는 가짜 방사선 조사 3일 후 종양을 사용하여 FACS 및 면역형광 분석을 수행했습니다. 칼레티쿨린에 대한 노출은 저용량 RT 유발 세포사멸의 면역원성 지표이며 HMGB1은 고용량 RT 유발 세포 사멸과 관련이 있는 것으로 보고되었습니다[29]. 또한 IL-6은 RT 유발 면역 조절에 역할을 하는 것으로 보고되었습니다[30]. 우리는 이전에 IL{14}} 발현이 광자 RT에 의해 상향 조절되었으며 IL6의 증가가 간 종양의 방사선 반응과 상관관계가 있음을 보고했습니다[28]. 그림 3c, d에서 볼 수 있듯이 PT는 가짜 방사선 조사와 비교하여 DNA 손상 증가와 IL6 및 HMGB1 발현과 관련된 종양 세포 사멸을 증가시켰습니다.

3.3. PT에 의해 유도된 면역조절 효과

대식세포 M2 분극화의 유도는 조사된 종양 미세환경에서 주요 면역억제 성분인 것으로 보고되었습니다[17,18]. PT가 M2 세포로의 단핵구 분화를 강화했는지 테스트하기 위해 우리는 M2 분극화를 위해 72시간 동안 조절된 배지에서 휴지 단계(M0)의 THP{4}} 단핵구를 배양했습니다. 그런 다음 M2 대식세포 분극이 끝나기 24시간 전에 PT 조사 HuH7 세포 유무에 관계없이 배양 상등액에서 공배양하여 단핵구의 대식세포에서 M2 마커의 수준을 분석했습니다. 도 4a에 도시된 바와 같이, PT 조사된 암세포를 대식세포 배양물에 첨가하면 시험관내 대식세포에서 M2 마커 CD163의 발현이 증가하였다. 우리는 48시간 동안 PT 유무에 관계없이 암세포와 공동 배양하여 기증자의 말초 혈액에 있는 단핵구에서 MDSC를 유도하는 암세포의 능력에서 PT의 역할을 추가로 연구했습니다. MDSC의 새로운 하위 집합은 PBMC의 CD14+HLA-DR 세포에 의해 식별되었습니다. 그림 4b는 PT 조사가 대조군과 비교하여 CD{21}} HLA-DR 골수 세포의 더 높은 빈도와 연관되어 있음을 보여줍니다. 또한, PT 조사 암세포와 함께 배양된 세포의 하위 집합에서 MDSC 매개 면역억제의 기능적 마커인 iNOS의 발현이 더 높았습니다(그림 4c). 또한, CD163은 M2 대식세포와 M1 대식세포를 구별하는 데 사용할 수 있는 M2 대식세포의 표현형 마커임이 확인되었습니다. 그림 4d, e에서 볼 수 있듯이 PT는 종양 보유 마우스에서 단핵구 MDSC의 유도와 관련된 PT 조사 종양에서 CD{32}} 세포의 증가를 초래했습니다. RT는 면역원성 세포 사멸을 유발하고 면역 세포 침투를 강화시키는 것으로 보고되었습니다. MDSC 매개 T 세포 억제에 대한 암세포의 기능적 결과에서 PT의 역할을 추가로 테스트하기 위해 분류된 CD{37}} T 세포의 증식을 6 Gy(RBE)가 있거나 없는 종양 세포의 존재 하에서 평가했습니다. ) PT 조사. 데이터는 MDSC-CD11b+ 세포가 T 세포 증식을 감소시켰으며, PT 조사 종양 세포와 함께 배양하면 자극 후 CD{44}} T 세포의 증식이 역전되었음을 보여줍니다(그림 4f).

그림 2. 시험관 내에서 PT에 대한 HCC의 반응. HuH7 세포의 세포 사멸에 대한 PT 치료의 효과. (a) 표시된 용량(RBE)에 대해 PT 후 48시간에 염색된 요오드화 프로피듐 및 Annexin V를 사용한 형광 활성화 세포 분류, 및 (b) 제어 조건 하에서 생존 분율에 의해 표준화된 비율로 제시된 클론 생성 분석에 의한 세포 생존 분획. 0, 3, 6 및 9 Gy(RBE)에 대한 도금 셀 수는 웰당 각각 500, 1000, 1500 및 3000이었습니다. ( c ) PT 유발 DNA 손상에 대한 면역 형광 및 면역 원성 세포 사멸에 대한 마커는 대표적인 슬라이드와 정량 데이터 (DAPI, 파란색, pH 2AX 및 칼레티쿨린, 녹색, HMGB1 및 IL6, 빨간색)로 표시됩니다. y축은 표적 단백질 발현의 상대적 배수 변화를 나타냅니다. (d) IL-6 수준은 PT 48시간 후 실시간 RT-PCR을 통해 검사되었습니다. (e) IL-6 프로모터-리포터 구성물을 포함하는 플라스미드로 HepG2 및 HuH7 세포의 안정적인 형질감염. 값은 표시된 조건에서 리포터 플라스미드의 루시퍼라제 활성의 배수 활성화로 표시됩니다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표시됩니다. * p < 0.05

그림 3. 면역 능력이 있는 마우스의 PT 치료에 대한 반응. 대표 이미지와 정량적 데이터는 PT 조사 여부에 관계없이 0, 3일 또는 12일에 포도당 흡수에 대한 FMT 분석을 통해 결정되었습니다(a). y축은 가짜 방사선 조사를 실시한 0일의 종양 값으로 표준화된 비율을 나타냅니다. 12 Gy(RBE) PT 또는 가짜 방사선 조사 후 12일째에 sc 종양이 있는 마우스의 종양 사진(b)의 대표 이미지 및 정량적 데이터가 표시됩니다. y축은 PT 후 표시된 시간에 종양 크기의 상대적 배수 변화를 나타냅니다. IF에 의한 DNA 손상(c)과 FACS에 의한 세포 사멸(d)은 PT 후 3일에 평가되었습니다. y축은 PT 후 3일째의 표적 단백질 발현 및 세포 사멸률의 상대적 배수 변화입니다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표시됩니다. * p < 0.05

3.4. 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)의 발현에서 PT의 역할

PD-L1은 면역 종양 미세환경의 균형을 결정하는 중요한 요소입니다[31]. PT는 간 종양 세포에서 PD-L1의 발현을 증가시켰으며, 발현 수준은 시험관 내에서 PT의 RBE 용량과 양의 상관관계가 있었습니다(그림 5a,b). 생체 내 PD-L1에 대한 PT의 효과를 추가로 검증하기 위해 IF 및 FACS를 사용하여 쥐 HCC 종양에서 PD-L1의 발현 수준을 조사했습니다. 그림 5c,d의 데이터는 PT 후 3일에 종양에서 PD-L1 발현이 유의하게 증가했음을 나타냅니다. 우리는 또한 종양에서 분류된 CD11b+ 골수 세포를 사용하여 PT가 MDSC에서 PD-L1의 발현을 조절하는지 여부를 조사했습니다. 결과는 PT가 분류된 CD11b+ 세포에서 PD-L1 발현을 증가시켰음을 나타냅니다(그림 5e,f).

3.5. 생체 내 PT에 대한 HCC의 반응에 대한 PD-L1의 효과

PD-L1이 면역적격 숙주에서 PT에 대한 간 종양의 방사선민감성에 역할을 하는지 확인하기 위해, 항PD-L1 치료 여부에 관계없이 마우스의 피하 이식 종양에 PT 12 Gy(RBE)를 이용한 국소 RT를 투여했습니다. 그림 6a-c에서 볼 수 있듯이 항PD-L1은 방사선 조사 후 세포 증식 감소 및 세포 사멸 증가와 관련된 PT 유발 종양 억제 효과를 증가시켰습니다. 또한, PT 후 면역 종양 미세환경에 대한 항-PD-L1의 조절 효과를 검증하기 위해 쥐 HCC 동소 종양 모델을 사용하여 면역 반응을 조사했습니다. 데이터는 항-PD-L1이 PT 단독에 비해 MDSC 모집을 약화시키고 더 작은 종양과 관련된 CD{15}} TIL을 증가시켰음을 보여줍니다(그림 6d-f).

3.6. PD-L1 차단은 PT 후 간암에 대한 전신 효과를 향상시킵니다.

방사선은 면역조절 약물의 사용에 의해 증폭되는 먼 곳에 있는 치료되지 않은 암 부위에 전신 효과를 유도하는 것으로 보고되었습니다[32-34]. 이에, 우리는 간 종양에 대한 PT에 의해 유도된 전신 효과 및 항-PD-L1 항체와의 병용 치료의 영향을 추가로 조사하였다. 그림 7a, b 및 보충 그림 S1에서 볼 수 있듯이 종양에 국소 PT를 단독으로 적용하면 오른쪽 허벅지 위의 조사된 종양에서 포도당 대사가 낮은 작은 종양이 유도되었지만 등 상부의 이차 조사되지 않은 종양에서는 유의미한 종양 억제가 나타나지 않았습니다. , sham-RT 그룹과 비교. PT 직후 항-PD-L1 항체와의 병용 치료는 PT 조사 영역에서 종양 제거 효과를 강화했으며 조사 영역 외부의 2차 종양의 퇴행을 가져왔습니다. 종양 침윤 면역 세포를 분석한 결과 항-PD-L1은 MDSC 모집을 약화시키고 CD{16}} TIL을 증가시키며 원발 종양에 국소 PT를 투여한 생쥐의 방사선 조사되지 않은 종양(그림 7c,d)에서 세포 증식을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 항-PD-L1이 국소 PT 조사 후 항종양 면역 반응을 강화하고 면역 능력이 있는 숙주의 전신 효과를 증가시켰음을 시사합니다.

그림 4. PT와 관련된 면역 반응. M2 대식세포 분극화 말기의 세포에서 CD163 마커의 발현을 FACS(a)를 통해 분석했습니다(I: 대조군; II: + 암세포 배양 상층액; III: + 암세포; IV: +6 Gy (RBE) PT-조사된 암세포 배양 상청액, V: +6 Gy(RBE) PT-조사된 암세포). 48시간 동안 0, 3 또는 6 Gy(RBE)로 조사된 HuH7 세포와 함께 또는 없이 배양된 PBMC로부터의 CD14+HLA-DR- 세포의 백분율을 분석하고(b), 발현 분류된 CD14+HLA-DR- 세포의 iNOS를 IF(DAPI, 파란색, iNOS, 빨간색)(c)를 통해 분석했습니다. PT 12일 후 방사선 조사된 종양의 CD{18}} 세포의 정도를 IF(DAPI, 파란색; CD163, 빨간색)를 통해 검사하고(d), 단핵구-MDSC 모집에 대한 PT 조사 효과를 FACS를 통해 평가했습니다( 이자형). 또한, PT 조사 암세포와의 배양 유무에 관계없이 FACS를 통해 T 세포 증식 속도를 조사했습니다. 대표 이미지와 정량적 데이터가 표시됩니다 (f). 치료는 PT 조사 유무에 관계없이 암세포와 결합된 MDSC의 존재 하에 항-CD3/CD28 자극 비드를 갖는 CD{24}} T 세포를 나타냅니다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표시됩니다. * p < 0.05.

그림 5. PD-L1 발현에 대한 PT의 효과. PD-L1의 수준은 (a) IF(DAPI, 파란색, PD-L1, 녹색), (b) 시험관 내 PT 후 48시간 후 인간 및 쥐 간암 세포에 대한 FACS 염색 및 (c) FACS를 사용하여 평가되었습니다. 및 (d) 생체 내 12 Gy(RBE)에 대한 PT 후 표시된 시간에 쥐 간 종양에 대한 IF. y축은 PT 후 표시된 조건에서 PD-L1 발현의 상대적 배수 변화입니다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표시됩니다. * p < 0.05. 또한, PT 조사 후 쥐 CD11b+ 세포에서 PD-L1의 발현을 (e) IF 및 (f) FACS 분석(CD11b+ 세포, 파란색 반점)을 통해 평가했습니다.

그림 6. 생체 내에서 PT에 대한 HCC의 반응에 대한 PD-L1의 효과. (a) 종양 성장 지연에 대한 항-PD-L1 요법의 효과. y축은 PT 후 항-PD-L1에 의해 유도된 피하 종양 크기의 상대적 배수 변화입니다. 데이터는 실험 수단을 나타냅니다. * p < {{10}}.05. (b) Annexin V-PI 염색을 이용한 FACS를 사용하여 평가한 치료 유발 세포사멸의 생체 내 효과. y축은 PT 후 세포 사멸률의 상대적 배수 변화입니다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표시됩니다. * p < 0.05. (c) 12 Gy(RBE)에 대한 PT 후 지정된 시간에 종양의 RT 유발 DNA 손상 및 Ki-67에 대한 면역조직화학. (d) 종양 억제에 대한 항-PD-L1 요법의 효과를 정위 종양 모델에서 평가하였다. 대표 이미지와 정량적 데이터는 국소 PT 조사 또는 가짜 조사 후 12일 후에 표시됩니다. y축은 간 종양 크기의 상대적 배수 변화입니다. 데이터는 실험 수단을 나타냅니다. * p < 0.05. (e) PT 12일 후 조사된 종양에서 ki67+, CD3+TIL 및 CD11b+ 세포의 정도를 IF(DAPI, 파란색; ki{32}} 및 CD3, 녹색을 사용하여 검사했습니다. ; CD11b, 빨간색). (f) MDSC 모집에 대한 PT 조사와 결합된 항-PD-L1의 효과는 FACS를 사용하여 평가되었습니다.

그림 7. PT 후 간암에 대한 전신 효과. 등 상부에 대한 방사선 조사되지 않은 종양의 성장은 오른쪽 허벅지 위의 원발 종양에 대해서만 12 Gy(RBE)에 대한 PT를 받은 마우스로부터 지정된 시간에 포도당 흡수(a) 및 종양 사진(b)의 FMT 분석을 통해 결정되었습니다( PT (+): 마우스는 오른쪽 허벅지 위의 1차 종양에 12 Gy(RBE)를 받았지만 등 위쪽의 2차 종양에는 12 Gy(RBE)를 받았습니다. 항PD-L1 치료 여부에 관계없이 PT 조사 후 0, 3일 및 12일에 방사선 조사되지 않은 종양의 대표 이미지 및 정량 데이터가 표시됩니다. y축은 PT 후 표시된 시간에 FMT 값과 종양 크기의 상대적 배수 변화를 나타냅니다. 또한, IF를 사용한 국소 PT 후 12일 후 방사선 조사되지 않은 이차 종양에서 ki-67 수준과 CD11b+ 세포 및 CD{14}} 세포의 침윤에 대한 대표적인 이미지가 표시됩니다(DAPI, 파란색; ki{16 }} 및 CD3, 녹색, CD11b, 빨간색) (c). 2차 조사되지 않은 종양에서 MDSC(d)의 축적을 유동 세포측정법을 사용하여 분석했습니다. y축은 상대적인 접기 변화입니다. 데이터는 실험 수단을 나타냅니다. * p < 0.05

4. 토론

이 연구의 결과는 PT에 의해 유발된 집락 형성 세포의 손실이 용량 의존적이며 광자 조사에 의한 손실과 유사하다는 것을 보여줍니다. 방사선으로 인한 복구되지 않은 DNA 손상 수준은 조직 특이적 방사선 반응을 결정하는 주요 요인입니다. 우리의 데이터는 PT에 의해 유발된 세포 사멸이 DNA 손상 마커 수준의 증가와 상관관계가 있음을 보여줍니다. 몇몇 종양 관련 사이토카인은 방사선 조사에 의해 조절되는 것으로 보고되었으며 종양 미세 환경에서 면역 하위 집합을 모집하고 분극화할 수 있습니다[35,36]. 우리는 이전에 IL-6 발현이 광자 RT에 의해 상향 조절되었으며 IL6의 증가가 간 종양의 방사선 반응과 상관관계가 있음을 보고했습니다[28]. 전임상 연구에서는 IL-6[6,7,37]을 포함하여 PT와 광자 방사선 후에 염증 요인에 대한 차등적 조절이 있음을 보여주었습니다. 우리는 세포 실험을 통해 PT 조사가 IL-6의 발현 수준을 용량 의존적으로 상향조절한다는 것을 보여줍니다. 치료에 대한 종양 반응성은 종양 세포 증식과 종양 미세환경에 의해 영향을 받습니다. 마우스 모델을 사용하는 것은 치료 반응을 평가하는 최적의 전략입니다. 우리가 아는 한, 지금까지 간 종양의 PT에 대한 반응을 제시한 전임상 시리즈는 거의 없습니다. 간 종양 보유 마우스에서 PT에 의해 유도된 종양 세포 사멸 및 종양 성장 지연에 대한 생체 내 데이터가 본 연구에서 입증되었습니다. 내인성 세포 방사선 민감성 외에도 생체 내 방사선 치료 후 종양 재성장은 여러 염증 및 간질 인자에 의해 실질적으로 영향을 받을 수 있습니다[38,39]. 면역자극 및 면역억제 효과를 포함하여 다양한 면역 관련 하위 효과가 RT에 의해 유도됩니다. RT는 면역원성 세포 사멸 유도를 통해 항암 면역을 자극하고, 면역체계 구성 요소에 새로운 항원을 방출하여 효과기 T 세포의 프라이밍 및 활성화를 개선합니다. 반면, RT는 조사된 미세 환경에 MDSC를 모집하는 등의 면역 억제 효과를 유발합니다[39,40]. MDSC의 모집은 RT 후 면역억제성 종양 미세환경을 결정하는 요소입니다. MDSC는 암 및 기타 병리학적 상태에서 면역 반응의 주요 조절자로 등장했습니다. 증거는 종양 진행에 대한 MDSC의 주요 기여를 뒷받침합니다. 우리는 이전에 증가된 MDSC가 RT에 의해 유발될 수 있으며 증가가 HCC 동물 모델에서 RT 저항과 연관되어 있음을 보고했습니다[28]. 제시된 연구는 PT가 종양 보유 마우스에서 단핵구 MDSC의 유도와 관련된 MDSC 모집의 활성화를 유도한다는 것을 입증했습니다. 단핵구 MDSC로 식별된 MDSC의 새로운 하위 집합은 환자의 말초 혈액에서 얻은 CD{24}}HLA-DR- 단핵구와 생쥐의 CD11b+Ly6G-로 정의됩니다[20,23,41]. T 세포 억제의 기능적 마커로서 iNOS의 발현은 MDSC 기능 평가를 위한 최적의 표준입니다[42]. 암세포와 함께 PBMC 배양을 사용한 실험에서는 PT가 단핵구에서 MDSC를 유도하는 암세포의 능력을 향상시키고 세포 하위 집합에서 iNOS의 발현을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 또한, 우리의 데이터는 CD11b+ 세포와의 공동배양이 T 세포 증식을 감소시키고, PT 조사 암이 공동배양 실험에서 T 세포 증식에 ​​대한 CD11b+ 세포의 억제 능력을 약화시킨다는 것을 보여줍니다.

골수 세포 계통은 대부분의 암 환자에게 존재하고 항종양 면역의 생성을 근본적으로 억제하는 면역 억제 세포 네트워크를 구성하는 것으로 보고되었습니다. 종양 미세환경에 풍부한 면역 세포인 대식세포는 만성 염증의 중요한 조절자입니다. 대식세포는 면역억제 미세환경에 기여하는 M2 표현형 쪽으로 분극화될 수 있다고 제안되었습니다[43]. 종양의 단핵 세포는 단핵구/단핵구-MDSC에서 종양 관련 M2 대식세포에 이르기까지 다양한 분화 단계에 존재할 가능성이 높습니다. MDSC와 종양 관련 M2 대식세포 사이의 이러한 네트워크는 M2가 단핵구 MDSC와 구별될 수 있음을 보여줍니다. 증거에 따르면 RT는 M1/M2 분극화를 통해 대식세포에서 면역 반응을 조절하는 조절 역할을 하는 것으로 나타났습니다[44,45]. 우리는 PT 조사 세포와의 공동 배양으로 인해 시험관 내에서 M2 마커의 발현이 증가하고 생체 내에서 PT 조사된 종양이 증가한다는 것을 보여주었습니다. 항암 면역 반응의 활성화는 RT의 효과에 매우 중요합니다.

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다양한 면역 기전은 간세포암종의 발생과 진행에 중요하며 예후와 상관관계가 있습니다. PD1 및 PDL1을 표적으로 하는 체크포인트 억제제는 활성적이고 내약성이 있으며 진행성 간세포암종에 대해 임상적으로 유익합니다[46]. 주요 세포 바이오마커인 PD-L1은 T 세포 매개 면역 감시 억제 및 대식세포 M2 분극화 조절을 포함하여 면역 회피에 역할을 합니다[13,31,47]. PD{11}}/PD-L1 축의 상향 조절은 T 세포의 세포독성 작용을 억제하는 것으로 관찰되었으며, 이는 방사선 조사 후 종양 회피 숙주 면역 반응 및 불완전한 종양 세포 사멸의 원인일 수 있습니다. PD-L1은 T 세포, 대식세포, 종양 세포를 포함한 조혈 세포에 널리 위치했습니다. PD-1/PD-L1은 T 세포 무반응을 유발하는 주목할만한 면역 관문입니다. 면역 체크포인트 차단제인 PD-L1에 대한 항체는 일부 암의 보조 요법 및 진행성 간세포암종 환자를 위한 유망한 면역요법으로 승인되었습니다[48,49]. PDL1 억제제는 임상 실습에서 또는 간세포암종에 대해 개발 중인 전신 요법의 중추 중 하나입니다. 더욱이, RT로 유도된 면역억제 효과는 이러한 면역억제 효과를 없애기 위해 방사선과 다양한 형태의 면역요법을 성공적으로 결합할 수 있는 가능성을 보여줍니다. MDSC는 면역 체크포인트 억제에 대한 환자의 저항성에 기여할 수 있습니다. 우리는 PT가 시험관 내 및 생체 내에서 용량 의존적 방식으로 종양 및 MDSC에서 PD-L1의 발현을 상향조절한다는 것을 입증했습니다. RT로 유발된 면역억제 효과는 이러한 면역억제 효과를 없애기 위해 방사선과 다양한 형태의 면역요법을 성공적으로 결합할 수 있는 가능성을 보여줍니다. 전임상 연구에서는 광자 RT와 면역요법의 조합이 종양 제어를 개선하는 치료 시너지 효과를 나타내는 것으로 나타났습니다[15]. 우리가 알고 있듯이 RT와 면역요법의 조합은 아직 초기 단계에 있으며 RT 용량, RT 유형 또는 RT와 면역요법에 대한 순서에 대한 최적의 사양이 없습니다. 면역요법과 결합된 PT 조사 문제를 명확히 하기 위해 우리는 동계 종양 모델에서 항PD-L1 요법과 간 종양의 PT 조사를 결합했습니다. 우리는 증가된 종양 세포 사멸과 관련된 더 작은 종양에 의해 입증된 바와 같이 항-PD-L1 항체와의 조합이 간암을 PT 조사에 민감하게 한다는 것을 발견했습니다. 또한, 항PD-L1 치료법은 MDSC 동원을 억제하고 PT 조사 종양에서 CD{41}} T 세포의 여과를 증가시켰습니다.

RT는 전통적으로 방사선 분야의 본질적인 DNA 손상을 통해 종양 세포를 죽이는 국소 치료법으로 간주됩니다. 또한, 방사선에 대한 전신 반응은 방사선 조사장 외부의 종양도 치료에 반응하는 잘 확립된 현상입니다. 전신 효과는 면역 매개되는 것으로 생각됩니다. 종양 내 암세포의 일부는 방사선이 치료 용량으로 사용될 때 면역원성 세포 사멸을 통해 죽습니다. RT로 유발된 종양 세포 사멸은 특정 분자 신호의 생성 및 면역 체계의 구성 요소에 더 많은 항원이 제시되는 것과 관련이 있습니다. RT가 면역 관련 전신 효과를 유발할 수 있다는 것이 보고되었으며, 이는 RT가 표적 종양에 대한 종양 제거 효과를 가질 뿐만 아니라 멀리 떨어져 있는 치료되지 않은 암 부위에 대해서도 항종양 효과를 갖는다는 것을 의미합니다[32,50,51]. RT 유발 요인 중에서 T 세포에 의한 암세포 인식을 촉진하는 방사선의 능력은 전신 효과에 특히 중요할 것 같습니다. 이 효과는 면역조절제의 사용으로 증폭될 수 있는 항종양 면역을 자극하는 종양 세포 사멸과 관련이 있습니다. 더욱이, pembrolizumab은 간세포암종의 생존 연장과 관련된 객관적 관해율을 15~20%로 나타냅니다[46]. 체크포인트 억제제에 관한 한 가지 중요한 점은 효능과 안전성입니다. 면역요법이 모든 환자에게 이점을 제공하지 않는다는 것은 분명합니다. 면역요법에 대한 종양의 저항성을 어떻게 극복하는가가 중요한 문제이다. 종양 저항성의 잠재적 원인에는 내인성 저항성과 면역요법의 활성을 중화시키는 항약물 항체의 발생이 포함됩니다. 강력한 면역 자극을 얻기 위해 다양한 국소 요법을 전신 면역 요법과 순차적으로 또는 동시에 결합할 수 있습니다. 면역요법은 HCC에 대한 국소적 개입과 시너지 효과를 낼 가능성이 높습니다. HCC는 종종 다발성이며 잠재적인 전암성 영역이 전반적으로 이시성으로 발전합니다. 여기서 우리는 PT와 항PD-L1의 병용이 PT의 전신 효과를 향상시켜 이시성 간 종양의 조절을 증가시키는지 추가로 조사했습니다. 우리의 데이터는 PT와 항PD-L1의 조합이 PT 또는 항PD-L1 단독에 의해 유도된 것과 비교하여 이차 미조사 종양에서 더 작은 종양 크기를 유도했음을 보여줍니다. 우리의 데이터는 또한 항-PD-L1과의 조합이 국소 PT를 받은 생쥐의 먼 방사선 조사되지 않은 종양에서 TIL 증가 및 MDSC 모집 약화와 관련이 있음을 보여줍니다. 이러한 결과는 항-PD-L1이 항종양 면역을 증가시켰으며, 이는 국소 PT 조사를 받은 종양 보유 마우스의 증가된 원발성 종양 사멸 활성 및 전신 효과를 매개함을 시사합니다.

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5. 결론

방사선요법과 면역요법을 결합하는 이유는 방사선요법이 시너지적인 항종양 면역을 생성할 수 있고 면역요법이 조사된 종양 미세환경에서 면역 억제 반응을 극복한다는 것입니다. 요약하면, PT는 암세포에 대한 생물학적 효과 외에도 종양 미세환경에 대한 면역 조절 효과도 있음을 시사합니다. 우리의 데이터에 따르면 항-PD-L1은 항암 면역을 유도하고 이후 PT 조사에 대한 원발성 종양과 원격 종양의 반응을 증가시켰습니다. PT와 결합된 항-PD-L1의 적용은 HCC 치료를 위한 유망한 전략이 될 수 있습니다.

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