달걀 껍질 막은 칼륨 옥소네이트를 주사한 쥐의 요산염 배설을 증가시켜 고요산혈증을 개선합니다
Mar 16, 2022
추상적인:고요산혈증은 통풍성 관절염 및 기타 대사 장애의 주요 원인입니다. 달걀 껍질 막(EM)은 골관절염과 관련된 통증과 뻣뻣함을 치료하는 효과적이고 안전한 보충제입니다. 그러나 고요산혈증에 대한 EM의 효과는 불분명합니다. 이 연구는 포타슘 옥소네이트 주입된 고요산혈증에 대한 EM의 효과를 결정합니다. 요산, 크레아티닌, 혈청 내 요소 질소 농도 및 간에서의 크산틴 산화효소 활성을 측정합니다. 단백질 수준신장 요산염 운반체 1(URAT1), 유기 음이온 운반체 1(OAT1), 포도당 운반체 9(GLUT9) 및 ATP 결합 카세트 운반체 G2(ABCG2)신장로 결정된다신장조직병리학. 결과는 EM이 고요산혈증 쥐에서 혈청 요산 수치를 감소시키고 소변 요산 수치를 증가시킴을 보여줍니다. 또한 EM은신장URAT1 단백질 발현은 OAT1 및 ABCG2를 상향 조절하지만 GLUT9 발현은 변경하지 않습니다. 또한 EM은 간이나 혈청에서 크산틴 산화효소 활성을 변화시키지 않습니다. EM은 또한 hURAT1을 발현하는 난모세포로의 요산 흡수를 감소시킵니다. 마지막으로 EM은 현저하게 감소합니다.신장염증 및 혈청 인터루킨{0}} 수치. 이러한 발견은 EM이 신장요산 배설 및 조절신장요산염 운반체. 따라서 EM은 통풍 및 고요산혈증의 예방 및 치료에 유용할 수 있습니다.
키워드:신장; 신장; 통풍; 요산염 수송체 1; 요산; 옥소산칼륨
난각막(Eggshell membrane, EM)은 난각 내부에 부착된 필름으로 인간의 주요 건강식품인 계란의 구성성분 중 하나이다. 그것은 산소의 침투를 허용하고 미생물의 침입을 차단합니다. EM은 유기물(70%), 비유기물(10%), 물(20%)로 구성되어 있으며, 유기물의 80%가 단백질로 구성되어 있습니다. 또한 지방 2.3%, 탄수화물 3.4%로 구성되어 있습니다[1,2]. 계란의 구성성분 중 노른자와 흰자는 식품의 원료로 사용되며, 계란껍질은 치아와 뼈를 형성하고 유지하는 칼슘보조제의 원료가 된다[3]. 그러나 EM은 폐기물로 분류되어 자주 사용되지 않습니다. EM의 항관절염 효과는 최근 lipopolysaccharide로 유도된 동물 모델과 인간 임상 연구에서 보고되었습니다[4,5]. EM은 또한 콜라겐 유발 류마티스 관절염이 있는 쥐의 염증을 개선했습니다[6]. 또한 EM은 monosodium iodoacetate로 유발된 골관절염 쥐에서 항관절염 활성을 입증했습니다[7]. 일나트륨 요오도아세테이트는 통풍 관절염을 유발하며 관절에 요산 일나트륨 결정이 축적되면 염증을 일으켜 통풍성 관절염을 유발할 수 있습니다. 고요산혈증은 요산(또는 요산염)의 결정을 형성하게 할 수 있으며 관절에 이러한 결정이 침착되면 매우 고통스러울 수 있는 관절염의 한 형태인 통풍을 유발합니다. EM은 골관절염 치료를 위해 광범위하게 조사된 콜라겐, 황산 콘드로이틴, 글루코사민, 히알루론산 및 칼슘의 공급원입니다[8]. 이 연구의 결과는 통풍과 고요산혈증을 예방하고 치료하기 위한 EM의 잠재적 유용성을 보여줍니다.
고요산혈증은 인슐린저항성, 당뇨병, 비만, 고혈압, 죽상동맥경화증, 심혈관질환 및 통풍성 관절염의 진행을 유발하는 주요 위험인자이다[9-11]. 고요산혈증의 적절한 조절은 이러한 질병의 예방 및 치료에 기여합니다. 고요산혈증은 요산 생산 증가 또는 요산 배설 장애로 발생합니다[12]. 요산의 생성을 감소시키고 배설을 증가시킴으로써 요산을 낮추는 치료는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 장애의 조절에 중요한 역할을 할 수 있습니다[13]. 요산 합성 억제제인 알로퓨리놀(allopurinol)과 페북소스타트(febuxostat)와 같은 일반적으로 사용되는 요산 강하제는 통풍 치료에 널리 사용됩니다. 그러나 이 xanthine oxidase(XO) 억제제는 allopurinol 과민증 증후군과 같은 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다[14-16]. 벤즈브로마론(Benzbromarone)은 지난 30년 동안 통풍을 조절하기 위해 사용되어온 요산결핍증 치료제이지만 심각한 간독성 부작용으로 유럽 시장에서 철수되었다[17]. 따라서, 고요산혈증 관련 장애의 예방 및 장기 치료에 보다 효과적인 독성이 없는 천연물 유래 약물의 개발이 필요하다. 따라서 이 연구는 EM이 고요산혈증을 예방하는지 여부를 조사합니다. 이 연구는 포타슘 옥소네이트(PO)에 의해 유도된 고요산혈증이 있는 쥐에서 EM의 항고뇨산혈증 활성을 평가합니다. PO는 고요산혈증을 유발하는 간 uricase의 효과를 억제하기 위해 널리 사용되는 선택적 경쟁적 uricase inhibitor이다[18,19]. 따라서 PO 처리된 쥐는 고요산혈증의 병리를 조사할 뿐만 아니라 잠재적인 약물을 평가하는 실용적인 동물 모델입니다[20]. 고요산혈증에 대한 EM의 활성 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 고요산혈증 동물에서 요산 생성 억제 및 요산 배설 향상을 통한 EM의 이중 메커니즘을 조사했습니다.
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2. 재료 및 방법
2.1. 동물7주령 수컷 Sprague Dawley 쥐를 Orient Bio(한국 성남)에서 구입했습니다. 그들은 50% ± 10% 습도와 22 ± 1°C의 에어컨이 있는 동물 방에서 적응했습니다. 쥐는 표준 식단과 물을 자유롭게 섭취할 수 있었습니다. 동물 연구는 한국한의학연구원 동물관리위원회의 승인을 받았으며, 실험은 위원회 지침(승인코드 19-024)에 따라 진행되었습니다.
2.2. 고요산혈증 유도 및 EM 투여본 연구에 사용된 EM은 JU-HWAN BIO CELL Co., Ltd.(천안, 한국)에서 건조 분말로 제공되었습니다. 고요산혈증을 유도하기 위해 150mg/kg PO(우리카제 억제제)를 동물에 복강내 주사했습니다. 다음과 같은 양성 대조군 약물이 사용되었습니다: allopurinol(Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 benzbromarone(TCI, Tokyo, Japan). 주입하기 전에 PO를 0.5% 카르복시메틸 셀룰로스(CMC, Sigma, USA) 및 0.1M 아세트산나트륨(Sigma, USA)에 용해시켰다. EM의 항고뇨산혈증 활성을 조사하기 위해(실험 1, 예비 급성 연구), 랫트를 5개 그룹(그룹당 5마리 동물)으로 나누었다: 정상 그룹; PO 주사된 고요산혈증 그룹(PO); PO + 10 mg/kg 알로퓨리놀 투여군; PO + 100 mg/kg EM 투여 그룹; 및 PO + 200 mg/kg EM 투여 그룹. 실험 1에서 샘플을 CMC에 용해시키고 1일 동안 PO 주입 후 1시간 후에 래트에 경구(1회) 투여하였다. EM의 용량 의존적 활성과 분자 메커니즘을 조사하기 위해(실험 2), 쥐를 7개의 그룹(각각 n{21}})으로 나누었습니다. 정상 그룹(N); PO 주사된 고요산혈증 그룹; PO + 10 mg/kg 알로퓨리놀 투여군; PO + 50 mg/kg 벤즈브로마론 투여군; PO + 50 mg/kg EM 투여 그룹; PO + 100 mg/kg EM 투여 그룹; 및 PO + 200 mg/kg EM 투여 그룹. 샘플을 0.5% CMC 용액에 용해시키고 5일 동안 PO 주사 1시간 후 쥐에게 경구(매일) 투여하였다.
2.3. 혈액, 소변 및 조직 샘플 수집약물 투여 후 2시간 후에 혈액을 수집하고, 샘플 처리 후 대사 케이지를 사용하여 2시간 후에 소변도 수집하였다. 혈액과 소변을 채취한 후 조직(신장및 간) 샘플을 조심스럽게 분할하고 추가 분석을 위해 80℃에서 보존했습니다. 혈청을 원심분리(2000×g, 15분, 4℃)로 분리하였다. 그런 다음 혈청 및 소변 샘플을 생화학 분석에 사용했습니다.
2.4. 혈청 및 소변의 요산 농도 분석혈청 및 소변의 요산 농도는 제조업체가 제공한 지침에 따라 상업용 요산 분석 키트(Biovision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 결정되었습니다.
2.5. 혈청 내 염증성 사이토카인 수준 측정혈청 인터루킨(IL){0}} 농도는 쥐 IL{1}} 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정되었습니다.
2.6. 간 및 혈청의 체외 크산틴 산화효소 활성간 조직 및 혈청에서 XO 활성은 제조사의 프로토콜(Sigma, USA)에 따라 XO 활성 분석 키트를 사용하여 결정되었습니다. XO 활성은 이전에 발표된 프로토콜을 사용하여 Spectra Max M3 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)에 의해 측정되었습니다[21]. 기질로 0.5mM 크산틴을 첨가하여 효소 반응을 개시하고 5분 동안 1분마다 요산 농도를 측정하였다. XO 억제제 알로퓨리놀은 참조로 사용되었습니다. 간의 XO 활성은 총 단백질 수준에 의해 정규화되었습니다.
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2.7. 신장 조직병리학적 검사신장 조직을 제거하고 즉시 포르말린에 1일 동안 고정한 후 파라핀에 포매하였다. 각 표본을 6 µm 두께로 절단하고, 절편을 hematoxylin과 eosin 시약으로 염색하였다. 그런 다음 염색된 섹션을 현미경으로 시각화했습니다.
2.8. 웨스턴 블롯 분석신장조직을 pro-prep 추출 용액(Intron, Seoul, Korea)에서 균질화한 다음 15분 동안 원심분리(13,{2}} x g, 4 ℃)하였다. 상층액은 표적 단백질의 웨스턴 블롯팅 분석에 사용되었습니다. 총 단백질 수준은 소 혈청 알부민(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용한 DC 단백질 분석에 의해 결정되었습니다. 1차 항체에는 -액틴(미국 텍사스주 댈러스 산타크루즈), 포도당 수송체 9(GLUT9, MyBioSource, San Diego, CA, USA), 요산염 수송체 1(URAT1; MyBioSource, San Diego, CA, USA) 및 유기 음이온 수송체 1(OAT1; MyBioSource, San Diego, CA, USA). 멤브레인의 밴드는 ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare Life Sciences, Seoul, Korea)을 사용하여 ECL 검출 시약으로 가시화되었습니다. 얻은 이미지의 밀도는 NIH(Bethesda, MD, USA)의 Image J1.49 소프트웨어를 사용하여 결정되었습니다. 시각화된 표적 단백질 수준은 -액틴으로 정규화되었습니다. ATP-결합 카세트 트랜스포터 G2(ABCG2) 발현은 래트 ABCG2 ELISA 키트(MyBioSource)를 사용하여 얻었고 총 단백질 수준으로 정규화되었습니다.
2.9. UART1-발현 난모세포를 사용한 요산염 흡수 측정Xenopus의 hURAT{0}}발현 난모세포는 이전에 설명한 대로 구성되었습니다[20]. URAT1 억제제 benzbromarone(TCI, Tokyo, Japan)을 참조로 처리했습니다. 난모세포는 Dulbecco의 인산완충식염수(DPBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 ND 용액(pH 7.4, 5mM{8}}(2- 하이드록시에틸)) 피페라진{10}}에탄-설폰산 완충액, 2mM KCl, 1mM 염화마그네슘, 1.8mM 염화칼슘 및 96mM 염화나트륨), 1mM 피라진 카르복실산(Sigma-Aldrich, St. Louis , 미주리, 미국) 37 ◦C. 난모세포를 다양한 농도의 EM(1, 10 및 100μg/mL)과 50μM [14C] 요산(Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA)과 함께 37℃에서 추가로 배양했습니다. 60분 후, 차가운 DPBS를 보충하여 요산 흡수를 중단했습니다. 멈춘 후 난모세포를 0.1N 수산화나트륨과 10% 황산도데실나트륨 용액에 녹이고 액체 섬광으로 방사능을 측정하였다.
2.10. 통계모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표현되었습니다. 유의미한 차이는 GraphPad Prism 7.{4}}5 소프트웨어를 사용한 사후 분석에 대한 Dunnett의 테스트에 이어 일원 분산 분석에 의해 통계적으로 평가되었습니다. 차이는 p-값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
3. 결과
3.1. 달걀 껍질막이 혈청 요산 분비에 미치는 영향,1일 동안 단일 PO 주사는 정상 쥐에 비해 PO 주사된 고요산혈증 쥐에서 혈청 요산 수치를 유의하게 증가시켰습니다(그림 1). 한편, 100 및 200 mg/kg의 EM 및 allopurinol(양성 대조군)은 PO 주사된 고요산혈증 쥐에서 혈청 요산을 효과적으로 감소시켰습니다. 따라서 EM의 용량 의존적 활성과 기전을 확인하기 위해 다음 연구를 수행하였다.
3.2. 달걀 껍질막이 혈청 및 소변 요산 수치에 미치는 영향,5일 동안의 APO 주사는 정상 그룹에 비해 PO 그룹의 혈청 요산 수치를 유의하게 상승시켰습니다(그림 2a). 100 및 200 mg/kg의 EM과 allopurinol 및 benzbromarone의 처리는 PO 그룹에서 혈청 요산 수치를 유의하게 감소시켰습니다. 또한, 평가하기 위해신장 기능, 크레아티닌 및 혈액 요소 질소(BUN) 농도를 측정했습니다. 혈청 크레아티닌 농도는 그룹 간에 차이가 없었습니다(그림 2b). 혈청 BUN 농도는 PO 그룹에서 증가했지만 이러한 수준은 EM 200 mg/kg 그룹과 양성 대조군(allopurinol 및 benzbromarone) 그룹에서 감소했습니다(그림 2c).
요산 배설에 대한 EM의 영향을 평가하기 위해 소변 요산 수치를 조사했습니다. PO 그룹은 EM(100 및 200 mg/kg) 및 benzbromarone의 투여에 의해 증가된 소변 요산 수치가 유의하게 감소했습니다(그림 2d). 이러한 데이터는 EM이 고요산혈증 쥐의 혈청 요산 수치를 감소시키기 위해 신장 요산염 추출을 증가시킬 수 있음을 보여주었습니다.
3.3. 난각막이 신장 염증에 미치는 영향경미한 세뇨관 확장, 세뇨관 상피 세포의 액포 변성, 팽창 및 염증 세포 침윤이 관찰되었습니다.신장PO 주사된 고요산혈증 쥐의 (그림 3a). 그러나 EM은 이러한 문제를 효과적으로 개선했습니다.신장고요산혈증 쥐의 조직병리학적 변화. 또한, 고요산혈증 쥐는 증가된 혈청 수준의 전염증성 사이토카인 IL{0}}을 보여주었습니다(그림 3b). 모든 농도에서 EM은 고요산혈증 쥐의 혈청 수준을 현저하게 하향조절했습니다. benzbromarone의 투여는 유의하지는 않지만 PO를 주입한 고요산혈증 쥐보다 혈청 IL{2}} 수치를 증가시켰으며 아마도 이 약물의 부작용일 것입니다. 이러한 결과는 EM이 효과적으로 개선되었음을 시사합니다.신장고요산혈증 쥐의 염증과 기능
3.34. 난각막이 XO 활성에 미치는 영향
간의 XO는 요산 생성을 유도합니다. 따라서 고요산혈증에 대한 EM의 억제 효과의 메커니즘을 정의하기 위해 혈청과 간에서의 XO 활성을 평가했으며, 간 XO 활성은 PO 그룹에서 유의하게 증가했습니다(그림 4a, b). XO 억제제인 알로퓨리놀은 혈청과 간에서 XO 활성을 유의하게 감소시켰다. 그러나 모든 용량에서 EM은 XO 활성을 변화시키지 않았습니다. 이러한 데이터는 EM이 XO 활성을 억제하지 않고 요산 생성을 감소시키지 않음을 나타냅니다.
3.5. 난각막이 요산염 배설에 미치는 영향요산염 배설에 대한 EM의 효과를 평가하기 위해신장 수송체조사되었다. 100 및 200 ug/mL의 EM과 benzbromarone은 URAT1단백질 수준을 유의하게 낮췄습니다.신장(그림 5a,b). 그러나 EM은 GLUT9 단백질 수준을 변경하지 않았습니다(그림 5c). 200ug/mL의 EM은 OAT1 단백질 수준을 증가시켰고 모든 농도에서 EM 투여는 ABCG2 수준을 증가시켰습니다(그림 5d,e).
3.6. 난모세포에서 체외 URAT1 흡수에 대한 EM의 효과또한, 시험관 내 요산염 흡수 시스템에 대한 EM의 효과가 확인되었습니다. 1, 10, 100ug/mL의 EM 처리는 시험관 내 hURAT{3}과발현 난모세포에서 강력한 요산 흡수 억제를 나타냈습니다(그림 6). 이러한 데이터는 EM이 요산염 배설을 증가시키기 위해 요산염 수송체의 발현을 조절함을 나타냅니다.
논의
인간의 경우 신장은 요산 배설의 70% 이상이 요산 항상성에서 중요한 역할을 합니다.신장,나머지 30%는 장에서 대변으로 배설됩니다[22,23]. 그러나 요산 배설은 다음으로 인해 손상될 수 있습니다.신장고요산혈증으로 이어지는 장애. 요산의 배설은 근위세뇨관에 있는 운반체 단백질에 의존합니다.신장혈액과 여과액에서 요산의 분비를 조절합니다[24].신장요산염 수송체 URAT1은 관강막에 위치하며 GLUT9/는 정점막에 있습니다.신장근위 세뇨관은 요산염 재흡수의 주요 경로를 구성합니다.신장[25,26]. 근위세뇨관의 기저외측막에 위치한 OAT1과 정점막에 위치한 ABCG2는 혈액에서 상피세포로의 요산분비를 주로 담당한다[27]. 이러한 요산염 수송체의 조절은 고요산혈증의 주요 치료 표적으로 간주됩니다. 이 연구에서 EM은 효과적으로 감소했습니다.신장GLUT9 단백질 발현은 변하지 않았지만, PO 주사된 고요산혈증 쥐의 URAT1 수준. 또한, OAT1 및 ABCG2 단백질 발현은신장EM 치료 후 요산 배출 효과를 나타냅니다. 이 연구는 URAT{1}}과발현 난모세포에서 URAT1에 의한 요산염 흡수에 대한 EM의 억제 활성과 이 효과가 URAT1에 의해 촉진된 요산염 흡수를 역전시키는 데 효과적임을 확인했습니다. 전체적으로 요산염 재흡수의 90%는 다음을 통해 얻습니다.신장URAT1 [28]. 이들의 통제신장EM 치료에 의한 요산염 수송체는신장고요산혈증 쥐의 요산 배설. 크레아티닌과 요소 질소는 비정상적인신장기능, 능력을 나타내는신장단백질 대사 산물을 배설하기 위해 [24]. 결과는 PO가 혈청 요산과 BUN 농도를 증가시키는 것으로 나타났습니다.신장기능 장애. 그러나 200 mg/kg EM은 개선된신장 기능. 효소 XO는 하이포크산틴 또는 크산틴의 요산으로의 산화를 촉매합니다[28]. 알로퓨리놀과 같은 XO 억제제는 혈청 요산 농도와 주로 XO 과잉 활동과 관련된 활성 산소 종의 과잉 생산을 감소시키며, 이는 종종 혈관 내피에 염증 세포 손상을 일으켜 대사 증후군 및 심혈관 질환의 발병에 기여합니다[29 ]. 따라서 XO 과활성화의 억제는 과잉 요산의 유해한 영향을 제어하기 위한 치료 목표가 될 수 있습니다. 그러나, 우리 연구는 EM이 PO-유도된 고요산혈증이 있는 쥐에서 혈청 및 간 XO 활성을 역전시키지 않는다는 것을 보여주었습니다.
고요산혈증은 다음의 위험 요소일 수 있습니다.신장기능 장애 [23]. 본 연구에서는신장기능장애는 증가된 혈청 BUN 및 염증성 사이토카인 IL{0}}p 수치와신장고요산혈증 쥐의 염증. 이것들신장기능장애는 EM 치료에 의해 약화되었으며, 이는 신장 염증의 개선을 시사합니다. 그러나 benzbromarone이라는 약물은 고요산혈증 쥐에서 혈청 IL{0}}p 수치를 증가시켰고, benzbromarone과 probenecid를 포함한 요산혈증 약물의 주요 부작용으로 신장 손상이 보고되었습니다[30]. EM은 자연적으로 발생하는 글루코사민, 황산 콘드로이틴, 히알루론산, 콜라겐, 펩타이드 및 기타 황 함유 아미노산을 포함합니다[8]. 이전 연구에서는 글루코사민과 콘드로이틴이 항염증 및 항골관절염 효과를 나타냈다고 보고했습니다[31,32]. Hyaluronic acid는 급성 통풍성 관절염 및 고요산혈증에 대한 monosodium urate crystal로 유도된 동물 모델에서 항염증 및 항고뇨산 효과를 나타냈습니다[33]. 이러한 연구의 결과는 고요산혈증을 예방하고 치료하기 위해 이러한 구성요소의 잠재적인 유용성을 보여줍니다. 그러나 우리의 연구는 EM의 어떤 구성 요소가 요산 배설을 향상시키는지를 보여주지 않았습니다. EM에서 파생된 생리활성 성분의 효과는 더 조사되어야 합니다. 이 연구에서 우리는 PO로 인한 고요산혈증과신장 염증EM 치료에 의해 억제되었다. 따라서 EM은 유망한 항고혈산제일 수 있습니다. 쥐에서 EM의 유효 용량이 100mg/kg(최대 용량, 200mg/kg)이라고 가정합니다. 체표면적을 기준으로 EM의 인간 등가 용량은 16.2mg/kg(성인의 경우 972mg/일)입니다. 이러한 생체 내 연구에서 가벼운 조건에서 EM의 권장 일일 복용량은 486mg 또는 972mg이고 심각한 상태의 경우 최대 복용량은 1일 1944mg입니다. 단, 치료 기간과 연령에 따라 용량이 달라질 수 있습니다. 이러한 결과를 바탕으로 가까운 장래에 EM에 대한 인체 임상 연구가 진행될 것입니다.
