삼투 스트레스에 의한 Cistanche Deserticola의 세포 배양에서 페닐에타노이드 배당체 생합성의 향상
Mar 11, 2022
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류춘자오. 쳉 시유
추상적인삼투압 스트레스가 세포 성장과 페닐에타노이드 배당체(PeGs) 생합성에 미치는 영향은 다음의 세포 현탁액 배양에서 조사되었습니다.시스탄체 데저티콜라YC Ma는 중국 서부 지역에서 자라는 사막 약용 식물입니다. 다양한 초기 자당 농도는 현탁 배양에서 세포 성장과 PeG 생합성에 상당한 영향을 미쳤고, 가장 높은 건조 중량 및 PeG 축적은 초기 삼투압에서 각각 15.9gl-1-DW 및 20.7mg g-1-DW에 도달했습니다. 자당 농도가 175.3mM인 경우 300mOsm kg-1의 응력. 자당과 비대사성 당(만니톨) 또는 비-당 삼투성 제제(PEG 및 NaCl)의 다양한 조합을 사용한 화학량론적 분석은 삼투압 스트레스 자체가 세포 현탁액 배양에서 PeGs 생합성을 향상시키는 중요한 요소임을 밝혀냈습니다.시스탄체 데저티콜라. 26.9 및 23.8 mg g-{4}}DW의 최대 PeG 함량은 각각 87.6mM 자당과 164.7mM 만니톨(303mOsm kg-1) 또는 20mM PEG의 조합에서 21일 후에 얻어졌으며, 이는 30일 후 175.3mM의 초기 자당 농도에서 성장한 C. Deserticola 세포 배양물의 그것. 세포 현탁액 배양에서 자극된 PeG 축적은 삼투압 스트레스에 의해 유도된 페닐알라닌 암모늄 리아제(PAL) 활성의 증가와 상관관계가 있었습니다.
키워드 시스탄체 데저티콜라, 사막 약용 식물, 페닐에타노이드 배당체, 삼투압 스트레스, 페닐알라닌 암모니아-리아제
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소개
시스탄체 데저티콜라귀한 중국 허브인 YC Ma는 Haloxylon ammodendrun의 뿌리에 기생하며 중국 서부의 사막 지역에서 자랍니다. C. Deserticola에서 분리된 주요 생리 활성 성분인 페닐에타노이드 배당체(PeGs)는 자유 라디칼 제거, 면역 강화, 성기능 개선 등에 현저한 활성을 나타냅니다(Zong et al. 1996; Lu 1998; Wang et al. 2001). 통제되지 않은 착취 및 사용으로 인해시스탄체 데저티콜라, 천연 자원시스탄체 데제스티코라 피로의 가장자리에 있었다. 이러한 문제점을 고려하여 C. Deserticola의 세포 현탁 배양에 의한 PeG 생산은 부족을 해결할 수 있는 유망한 대안으로 여겨져 왔다.시스탄체 데저티콜라식물 재료(Lu and Mei 2003; Ouyang et al. 2003; Cheng et al. 2005a).
삼투압 스트레스는 식물 성장, 발달, 형태 형성 및 이차 대사 산물의 형성에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 몇 가지 약용 식물 종에서 최적의 삼투압 스트레스 하에서 시험관 내 조직 배양에서 2차 대사산물의 생산이 증가하는 것으로 보고되었습니다(Kim et al. 2001; Wang et al. 1999; Wu et al. 2005). 자당은 이러한 경우에 사용되는 일반적인 삼투압 스트레스제이며 중요한 탄소 및 에너지원으로도 사용됩니다. 따라서 삼투압 스트레스의 영향과 탄소원으로서의 당의 영양적 역할을 분리하는 것은 매우 어렵습니다. 비대사성 만니톨, 소르비톨 및 PEG를 사용한 초기 삼투압 스트레스의 증가는 또한 Taxus Chinensis 세포 배양에서 파클리탁셀 축적, Panax notoginseng 세포 배양에서 사포닌 및 다당류 축적, Eleutherococcus sessiliflorus 배발생 배양에서 엘류테로시드 축적을 개선했습니다(Zhang et al.1 et al. 2001; Shohael et al. 2006). 그들의 결과는 탄수화물 농도와 삼투압 스트레스의 영향이 식물 종과 이차 대사 산물에 따라 다른 것으로 나타났습니다.
현재 연구의 목적은 sucrose, mannitol, PEG 및 NaCl이 세포 성장 및 PeGs 생합성에 미치는 삼투압 효과에 초점을 맞추고 있습니다.시스탄체 데저티콜라세포 현탁액 배양. 현탁 배양물에서 PAL 활성은 초기 삼투 작용제의 다양한 조합 하에서 조사되었으며, 삼투압 스트레스를 증가시켜 개선된 PeG 축적에 대한 가능한 메커니즘이 논의되었습니다.
재료 및 방법
식물 재료 및 캘러스 유도
의 씨앗시스탄체 데저티콜라YC Ma는 중국 신장(Xinjiang) 성의 사막 지역에서 채취하여 사용하기 전에 4C에 보관했습니다. 식물의 동일성은 중국 중국과학원 식물학연구소의 참조 표준과 비교하여 확인되었습니다. 종자를 70% 에탄올에 30초 동안 담그어 표면 멸균한 다음, 물에 5.4% 차아염소산나트륨의 20% 수용액에 20분 동안 담그고 멸균 증류수로 3회 헹굽니다. 칼리는 표면 살균된 종자로부터 유도되었다.시스탄체 데저티콜라1.0 mg l–1 나프탈렌아세트산(NAA), 2.0 mg l–{6}}벤질 아데닌({{7} }BA), 0.25mg l–{10}}, 4-디클로로페녹시아세트산(2, 4-D), 6gl–1 한천(PhytoTechnology LaboratoriesTM, 제품 ID: A181) 및 30gl-1 자당을 25C의 어둠 속에서 성장 캐비닛에서 60일 동안. 종자 외식편으로부터 유도된 캘러스 배양물은 후속적으로 30일 간격으로 상기 고체 배지에 계대배양되었다(Cheng et al. 2005a).
세포 현탁액 배양의 확립 및 유지
1.{3}} lm 메쉬 스크린을 통해 여과되고 200 lm 메쉬 스크린에 유지된 현탁 캘러스 배양물(3.{1}} g 신선한 중량)을 500-ml Erlenmeyer로 계대 배양했습니다. 18일의 계대배양 간격으로 어둠 속에서 25℃에서 110rpm으로 회전식 진탕기 상에서 상기 액체 배지 100ml를 함유하는 플라스크. 고압멸균 전에 1M NaOH 또는 1M HCl을 사용하여 배지 pH를 5.8로 조정했습니다. 10회 계대 배양한 현탁 캘러스 배양물을 다음 실험 플라스크 배양을 위한 접종물로 사용하였다. 모든 플라스크 실험은 30gl–1 자당이 포함된 50ml 액체 배지가 포함된 250ml 삼각 플라스크에서 수행되었으며 신선한 중량의 18-일령 세포 현탁액 배양액 1.5g을 접종했습니다. 이러한 삼각 플라스크를 회전식 진탕기(110rpm)에서 25℃, 암실에서 인큐베이션하였다.
삼투압 실험
초기 자당 농도의 영향을 조사하기 위해세포 성장 및 PeG 축적,시스탄체 데저티콜라현탁 배양물은 87.6의 MS 배지에서 배양되었고,175.3 및 262.9mM 수크로스. 삼투압 조건의 경우,시스탄체 데저티콜라현탁 배양물을 MS에서 인큐베이션87.6mM 자당을 포함하는 배지와 결합164.7mM 만니톨. 기타 삼투 작용제(PEG 4,000 및NaCl)을87.6mM 자당. 삼투 등가 농도삼투 작용제의 비율은 실험적으로 PEG로 결정되었습니다.4,{1}} 각각 20mM 및 NaCl 50mM. 모든 실험 및 모든 값에 3중 플라스크를 사용했습니다.삼중 플라스크 ± SD의 평균이었습니다.
분석
시스탄체 데저티콜라다양한 삼투압 하에서 배양된 세포를 Nikon AFX-DX 광학현미경(Nikon, Japan)으로 400·배율로 관찰하였다. 배지의 삼투압 농도는 증기압 삼투압계(Fiske One-Ten Osmometer, MA, USA)로 측정하였다. 신선 중량(FW) 측정을 위해,시스탄체 데저티콜라세포를 여과지에 부드럽게 눌러 과도한 물을 제거하고 무게를 잰다. 이어서, 세포를 60℃의 오븐에서 24시간 동안 건조시키고 건조 중량(DW)을 기록하였다. 잔류 당 농도는 포도당을 표준으로 사용하여 페놀과 진한 황산을 사용하여 결정되었습니다(Dubois et al. 1956).
PeGs는 주파수 40kHz, 전력 100W의 초음파 수조(KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, China)에서 60C, 15분 동안 메탄올로 건조된 세포에서 추출되었습니다. 여액을 농축했습니다. 잔류물을 증류수에 녹인 후 거대 망상 수지 컬럼(AB-8, Nankai University, Tianjin, China)을 통과시켰다. 메탄올 용출액을 수집하고 표준으로 echinacoside를 사용하여 총 PeG 함량을 333 nm에서 분석했습니다(Du and Liu 1993a; Du et al. 1993b).
세포 생존율은 2,3,{2}}트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)의 환원에 의해 추정되었습니다(Steponkus and Lanphear 1967). 생존 지수는 신선한 조직 그램당 측정된 흡광도로 정의됩니다. PAL 활동의 결정은 Koukol과 Conn(1961)의 방법을 기반으로 했습니다. PAL 활성(U)의 한 단위는 0.01의 흡광도 변화량으로 정의됩니다.
결과 및 토론
의 세포 현탁액 배양에서 세포 성장 및 PeG 생합성에 대한 초기 자당 농도의 영향시스탄체 데저티콜라.의 응답시스탄체 데저티콜라87.6과 262.9mM 사이의 초기 자당 농도까지 세포 현탁액 배양물을 테스트했습니다. 도 1에 나타난 바와 같이 초기 자당 농도가 87.6mm로 낮았을 때 세포가 빠르게 성장하고 PeG가 축적되었으며, 초기 자당 농도가 높은 262.9mM에서는 세포 성장과 PeG 축적이 현저히 억제되었다. 초기 자당 농도가 262.9mM에서 87.6으로 증가할 때 건조 중량에 대한 신선 중량의 비율은 감소했습니다(데이터는 표시되지 않음). 15.9gl–1의 최대 건조 중량과 20.7mg g–{18}}DW의 PeG 함량은 175.3mM의 초기 자당 농도에서 30일째에 얻어졌으며 이 농도의 삼투압 농도는 약 300mOsm kg–1이었습니다. 현미경 관찰에서 세포벽은 초기 자당 농도가 262.9mM인 388mOsm kg-1의 가장 높은 삼투압 스트레스에서 세포질에서 분리되었으며(그림 2), 가장 높은 삼투압 스트레스는 세포의 대사를 방해하여 다음과 같은 결과를 초래할 수 있습니다. 심각한 성장 억제 및 PeG 생합성 감소. T. Chinensis 현탁 세포 배양물의 현탁 배양에서도 유사한 현상이 관찰되었으며, 파클리탁셀 생산을 위한 최적의 자당 농도는 175.3mM이었다(Kim et al. 2001). 그러나 204.5mM의 초기 자당 농도는 E. sessiliflorus 세포 배양의 성장에 유익했습니다. 262.9mM의 더 높은 자당 농도는 Eleutherococcus 배양에서 eleutherosides, 페놀 및 플라보노이드의 생합성을 향상시켰습니다(Shohael et al. 2006). 초기 자당 농도는 식물 세포 배양의 성장 및 이차 대사 산물 축적에 중요하고 그 효과는 특정 세포주와 관련이 있음이 분명합니다.
C. Deserticola의 세포 현탁액 배양에서 세포 성장 및 PeG 생합성에 대한 다양한 삼투 작용제의 효과
세포 현탁액 배양에서 PeG 생합성에 대한 대사 자당 및 기타 비대사성 화학 기질의 삼투압 역할을 이해하기 위해시스탄체 데저티콜라, 비대사성 삼투제(만니톨, PEG 및 NaCl)와 결합된 자당을 사용하여 일련의 실험을 수행했습니다. 이 실험에서 164.7mM 만니톨, 20mM PEG 및 50mM NaCl을 87.6mM sucrose를 포함하는 배지에 첨가하고 초기 삼투압 농도를 약 300mOsm kg-1로 만들었습니다. 자당.
도 3a, b에 나타난 바와 같이, 만니톨(비대사성 당삼투제)과 PEG(비투과성 삼투제)의 첨가는 세포 성장 속도를 약간 억제하였지만,시스탄체 데저티콜라세포 현탁액 배양. 87.6mM 자당과 164.7mM 만니톨(303mOsm kg-1) 또는 20mM PEG(299mOsm kg–1). PeGs 양은시스탄체 데저티콜라30일에 초기 자당 농도가 175.3mM인 MS 액체 배지에서 성장한 세포 배양. 설탕은 시간 경과에 따라 점차적으로 소비되었습니다.시스탄체 데저티콜라세포 배양 후 당 유도 삼투압 스트레스가 그에 따라 떨어졌습니다(그림 3c, d). 초기 자당 농도가 175.3mM인 액체 배지의 삼투압 스트레스는 세포 배양에서 PeG가 9일째에 축적되기 시작하고 30일째에 최대에 도달했을 때 280에서 110mOsm kg-1로 떨어졌습니다(데이터는 표시되지 않음). 비대사성 삼투 작용제(만니톨 및 PEG)는 세포 배양 과정에서 소모되지 않아 액체 배지의 삼투압 스트레스가 PeG 생합성에 유리한 삼투압인 200 ~ 280 mOsm kg-1 사이에서 유지되도록 했습니다. 이러한 결과는 삼투압 스트레스 자체가 PeGs 생합성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다.시스탄체 데저티콜라세포 배양.
NaCl의 첨가는 Catharanthus roseus와 Panax 인삼의 세포 배양에서 각각 인돌 알칼로이드와 사포닌 생합성을 향상시키는 것으로 보고되었지만(Smith et al. 1987; Wu et al. 2005), NaCl 처리는 T. Chinensis의 세포 성장을 억제했습니다. 팔리탁셀 생합성에서는 차이를 보이지 않는 반면(Kim et al. 2001). 따라서 각 경우에 대한 자세한 조사가 필요합니다. 50mM NaCl의 삼투압 등가물을 첨가하면 세포 성장과 PeGs 생합성이 억제되었습니다. 이 결과는 가뭄 스트레스를 잘 견딜 수 있는 이 사막 식물 종의 세포 배양에 유익하지 않은 NaCl의 투과성 특성 때문일 수 있습니다.
그림 3. C. Deserticola 세포의 세포 성장(a), PeG 축적(b), 당 소비(c) 및 삼투압 스트레스 변화(d)에 대한 자당 및 기타 비대사성 삼투 작용제의 조합 효과 문화. 값은 3중 플라스크 ± SD의 평균입니다.
Cistanche Deserticola의 세포 현탁액 배양에서 세포 생존율 및 PAL 활성에 대한 다양한 삼투 작용제의 효과
우리의 이전 연구(Cheng et al. 2005b, 2006)에서, 유도제 추가는 다음에서 PeGs 생합성을 극적으로 자극했습니다.시스탄체 데저티콜라세포 배양과 자극은 PeG 생합성의 첫 번째 핵심 효소인 PAL의 활성 증가와 상관관계가 있었습니다(Hahlbrock and Grisebach 1979). 도 4에 나타낸 바와 같이, 87.6mM 수크로스를 함유하는 MS 액체 배지에 비대사성 164.7mM 만니톨 또는 20mM PEG를 첨가하면 세포 생존율이 약간 감소하지만, 175.3mM. 강화된 PeG 축적시스탄체 데저티콜라세포 현탁액 배양은 삼투압 스트레스 자체에 의해 자극된 PAL 활성의 증가와 관련이 있습니다. MS 액체 배지에서 초기 자당 농도 175.3mM은 15일 만에 세포 생존력 감소를 일으켰고 21일 만에 PAL 활성을 억제했습니다. 성장에 의해 설탕 소비의 기간 후에시스탄체 데저티콜라세포 배양에서, 배양된 세포의 세포 생존율 및 PAL 활성은 모두 증가하여 각각 24일 및 30일에 최대값에 도달했습니다. 삼투압 스트레스에 의한 강화된 PAL 활성은 또한 P. 인삼 세포 배양에서 사포닌 생합성을 개선하고 C. roseus 배양 세포에서 알칼로이드 축적을 개선하는 것으로 관찰되었습니다(Godoy-Hernandez et al. 2000; Wu et al. 2005). 그러나 87.6mM sucrose를 포함하는 MS 액체 배지에 투과성 NaCl을 첨가하면 전체 배양 기간 동안 세포 생존력이 감소하고 PAL 활성이 억제되었습니다. 그 결과, 세포 성장과 PeGs 생합성이 모두 분명히 억제되었습니다.
그림 4 C. Deserticola 세포 배양에서 다양한 삼투압 스트레스 하에서 세포 생존율(a)과 PAL 활성(b)의 변화시스탄체 데저티콜라세포 배양. 값은 3중 플라스크 ± SD의 평균입니다.
시스탄체 데저티콜라사막 종이며 시험관 세포 배양에서 사막 종의 조사는 식물 생리학과 생태적 적응을 이해하기 위한 새로운 도전과 기회를 제시했습니다. 이 연구에서 우리는 삼투압 스트레스 매개 신호 전달 생합성 경로를 연구할 수 있는 잠재력을 가진 시스템을 개발했으며 시스템은 이를 사용하여 PeG의 대규모 생산을 위한 기반을 제공했습니다.시스탄체 데저티콜라새로운 삼투압 스트레스 조절 전략을 통한 세포 배양.
감사의 말
저자는 중국 과학 아카데미의 혁신 연구 프로그램의 재정 지원을 인정합니다.
출처: Chun-Zhao Liu의 '삼투압 스트레스에 의한 Cistanche Deserticola의 세포 배양에서 페닐에타노이드 배당체 생합성 향상'. 쳉 시유
---식물 세포 담당자(2008) 27:357–362 DOI 10.1007/s00299-007-0443-3
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