FAIMS 1부로 뇌 조직의 하향식 단백질체학 강화
Aug 27, 2024
추상적인
알츠하이머병과 파킨슨병에 대한 단백질체학 조사는 신경퇴행성 장애에 대한 귀중한 통찰력을 제공했습니다. 지금까지 이러한 조사는 주로 상향식 접근 방식으로 제한되어 단백질의 "온전한" 상태를 특성화할 수 있는 정도를 방해했습니다.
알츠하이머병은 사람의 기억력과 인지 능력에 돌이킬 수 없는 영향을 미치는 신경퇴행성 질환입니다. 질병을 완전히 완치할 수는 없으나, 세심한 치료와 예방을 통해 질병의 진행을 최대한 늦추고 환자의 신체적, 정신적 건강을 유지할 수 있습니다.
기억은 알츠하이머 환자의 영향을 받는 가장 분명한 측면 중 하나입니다. 그들은 종종 자신의 이름, 사랑하는 사람의 이름, 중요한 날짜 등과 같은 중요한 정보를 잊어버릴 수 있습니다. 또한 추상적인 개념, 동의어 등 일부 고급 자가 학습 어휘도 잊어버릴 수 있습니다. 그러나 일부 인지 훈련과 치료를 통해 알츠하이머 환자는 여전히 일부 측면에서 기억을 유지할 수 있습니다.
알츠하이머병은 부정적인 영향을 미칠 수도 있지만 긍정적으로 바라봐야 한다. 첫째, 질병에 대한 인식과 이해를 높임으로써 질병을 더 잘 예방하고 치료할 수 있습니다. 둘째, 알츠하이머 환자의 간병인과 가족들도 효과적으로 의사소통하고 교류하는 방법을 배워 환자가 자기 존엄성을 유지하고 최대한 행복하게 살아갈 수 있도록 돕습니다.
일반적으로 알츠하이머병은 기억력과 인지능력에 돌이킬 수 없는 영향을 미칠 수 있지만, 우리는 낙관적인 태도를 유지하고 치료와 예방 조치를 통해 질병의 진행을 늦추기 위해 노력해야 합니다. 동시에 우리는 알츠하이머병 환자를 돌보는 사람들에게 더 많은 도움과 지원을 제공하고, 더욱 따뜻하고 상호 작용하는 커뮤니티를 공동으로 만들어야 합니다. 기억력을 향상시켜야 함을 알 수 있습니다. 시스탄체는 기억력을 향상시키는 것 등 독특한 효능이 많은 중국 전통 약재이기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 시스탄체의 효과는 탄닌산, 다당류, 플라보노이드 배당체 등 포함된 다양한 활성 성분에서 비롯됩니다. 이러한 성분은 여러 가지 방법으로 뇌 건강을 증진할 수 있습니다.
하향식 단백질체학(TDP)은 이러한 한계를 극복합니다. 그러나 일반적으로 상대적으로 작은 크기의 가장 풍부한 프로테오폼만을 관찰하는 것으로 제한됩니다.
따라서 시료의 복잡성을 줄이기 위해 분별 기술이 일반적으로 사용됩니다. 여기에서는 TDP 내에서 FAIMS(High-field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry)를 통해 기체상 분별을 조사합니다.
알츠하이머병(AD) 뇌 조직에서 추출한 복잡도가 높은 샘플을 활용하여 TDP에 FAIMS를 추가하면 프로테옴 적용 범위의 깊이를 어떻게 강력하게 향상시킬 수 있는지 설명합니다.
예를 들어, -50, -40 및 -30 CV에서 외부 보상 전압(CV) 스테핑을 사용하여 FAIMS를 구현하면 FAIMS가 없는 경우에 비해 중복되지 않는 프로테오폼, 유전자 및 프로테옴 서열 범위의 평균 수가 두 배 이상 증가할 수 있습니다.
우리는 또한 FAIMS가 크기에 따라 프로테오폼과 전하 봉투의 전송에 영향을 미칠 수 있음을 발견했습니다. 중요하게도, FAIMS는 AD와 강하게 연관되어 있는 응집 경향이 있는 A 1-42 변종을 포함하여 온전한 아밀로이드 베타(A) 단백질형의 식별을 가능하게 했습니다.
원시 데이터 및 관련 파일은 데이터 세트 식별자 PXD023607을 사용하여 MassIVE 데이터 저장소를 통해 ProteomeXchange Consortium에 기탁되었습니다.
소개
지난 20년 동안 신경퇴행성 질환의 발병률은 전 세계적으로 두 배 이상 증가했으며, 가장 흔한 유형은 알츠하이머병(AD)입니다.1 두 가지 단백질 종, 아밀로이드 베타(A) 펩타이드와 인산화된 미세소관 관련 단백질 타우(tau), 2-5는 AD와 밀접한 관련이 있습니다.
따라서 AD의 상세한 단백질체 특성 분석은 특히 중요합니다.6,7 질량 분석법은 주로 상향식 접근 방식을 통해 이러한 조사에서 중심 역할을 했습니다.9-16
그러나 상향식 분석에 필요한 프로테아제 소화는 단백질의 완전한 상태 캡처를 방해하며, 이는 유전적 대립유전자, 대체 접합, 단백질 분해 처리 및 번역 후 변형("프로테오폼"이라고 함)으로 인해 달라질 수 있습니다.17– 20
하향식 단백질체학(TDP) 접근법은 손상되지 않은 상태에서 단백질을 분석하기 때문에 특정 병리와 관련된 단백질형을 포착할 가능성이 더 크고 유전자형과 표현형 사이의 더 강력하고 직접적인 연결을 허용합니다.20-22
예를 들어, TDP는 특히 알츠하이머병과 연결된 타우와 같은 단백질에서 파생된 내인성 단백질 분해 단편을 포착하는 데 매우 적합합니다. 이전의 여러 TDP 응용 프로그램은 다양한 자극에 대한 반응으로 지역적 뇌 단백질체 이질성과 신경 변화를 밝히는 데 큰 가능성을 보여주었습니다. .27–30
그러나 복잡한 샘플의 TDP에는 일반적으로 인간 프로테옴의 크기와 양이 수십 배에 달하고 단백질은 일반적으로 역상 고성능 액체 크로마토그래피(LC)로 잘 분리되지 않기 때문에 샘플 복잡성을 줄이기 위해 오프라인 분별 기술이 필요합니다.31
이러한 오프라인 분획화는 젤 용출 액체 분획 포착 전기영동, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 정제 등을 통해 수행할 수 있습니다.22,32-35
불행하게도 오프라인 분별은 일반적으로 확장된 시료 처리를 요구하여 수율과 처리량을 감소시킵니다.36 기체상 이온 이동성 분리는 추가 시료 처리 단계 없이 LC와 MS 차원 사이에 도입할 수 있는 매력적인 분별 대안입니다.
FAIMS(고자기장 비대칭 파형 이온 이동성 분광법)는 최근 도입된 FAIMS Pro 장치를 통해 이 작업에 특히 적합합니다. FAIMS Pro 장치의 모듈식 설계를 통해 여러 현재 Orbitrap 기기에 이온 이동성을 쉽게 통합할 수 있습니다.37
차동 이동도 분석법이라고도 하는 FAIMS는 높은 전기장과 낮은 전기장을 갖는 비대칭 파형을 도입하여 크기, 전하 또는 모양과 같은 요인의 조합을 기반으로 운반 가스에서 이온을 분리합니다.38 전극에 DC 보상 전압(CV)을 적용하면 이온 경로의 편차가 발생하여 해당 이온을 선택적으로 전송할 수 있습니다.38
온전한 단백질 분석에 FAIMS를 적용하는 것은 주로 개별 단백질의 형태체 분리 또는 단백질의 작은 조합으로 제한되어 왔습니다.
그러나 FAIMS는 최근 액체 추출 표면 분석을 사용하여 손상되지 않은 및 기본 단백질 분석에 적용되었습니다. 여기에서는 알츠하이머 환자의 내측 전두엽 피질(MFC)의 전체 조직 샘플에 FAIMS-TDP 분석을 적용합니다.
외부 스테핑을 사용하여 -50 ~ -20 CV의 CV 범위를 스캔하면 FAIMS CV의 변조가 원통형 FAIMS 장치를 통해 전송되는 이온의 특성에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 이 관계가 크기에 따라 단백질 형태를 표적으로 삼는 데 어떻게 활용될 수 있는지 확인할 수 있습니다.
FAIMS-TDP는 FAIMS가 없을 때와 비교하여 단일 CV에서 프로테오폼 식별을 두 배 이상 증가시켰으며 -, - 및 -시누클레인, PARK7, 타우 스플라이스 이소폼 및 여러 온전한 A 프로테오폼을 포함하여 신경퇴행성 질환과 관련된 프로테오폼에 대한 심층적인 조사를 가능하게 했습니다.
종합적으로 말하자면, 이 연구는 TDP에서 FAIMS를 사용한 기체상 분별을 통해 어떻게 프로테오폼과 프로테옴 커버리지의 더 큰 식별을 재현성 있게 달성할 수 있는지 설명합니다.
행동 양식
샘플 준비
MFC 샘플은 러시 대학교 알츠하이머병 센터에서 받았습니다. 참가자는 1992년부터 2005년까지 기억 장애 및/또는 정신 장애로 등록한 임상 기반 노인이었습니다.
이들은 러시 기억 클리닉(Rush Memory Clinic)에서 치매 가능성을 평가받았으며 러시 알츠하이머병 핵심 센터(Rush Alzheimer's Disease Core Center)의 임상 핵심 부분으로 뇌 기증에 동의했습니다. 이 연구는 Rush University Medical Center의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다.
사망 후 가장 가까운 친척이 부검에 동의했습니다. 환자의 전반적인 인지 진단 범주는 다른 인지 장애 원인이 없는 알츠하이머 치매였으며51 사후 간격은 230분이었습니다.
모든 샘플 처리 단계는 BSL{{0}} 예방 조치에 따라 수행되었습니다. -80도에 보관된 MFC 조직 33mg을 8M 요소, 10mM 중탄산암모늄(ABC) 및 10mM로 구성된 균질화 완충액 0.5mL를 추가하여 1.5mL LoBind Eppendorf 튜브(Eppendorf, Cat# 022431081)로 옮겼습니다. pH7.5의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP).
균질화는 실온에서 0.5mL의 균질화 완충액을 추가하기 전에 30초 동안 휴대용 모터 구동 펠렛 유봉(SpiralPestle이 포함된 BioVortexer, Biospec 1083 및 1017)을 적용하여 물리적 파괴를 통해 달성되었습니다.
그런 다음 세포 단백질의 추출 및 변성을 허용하기 위해 ThermoMixer를 사용하여 샘플을 1200rpm에서 60분 동안 37도에서 배양했습니다. 우레아 불용성 물질의 펠렛화는 22도에서 20분 동안 18000g에서 원심분리하여 수행되었으며, 생성된 상등액을 3mL의 세척 완충액(WB; 8M 우레아, 10mM ABC, pH7)에 첨가했습니다. .5) 4mL 100kDa 분자량 차단(MWCO) 필터 내에서 큰 MW종을 제거합니다.
22도, 5000g에서 1시간 동안 원심분리한 후 보유액 부피는 200μL이고 여과액 부피는 3.8mL였습니다. 3.8 mL의 여액을 3 kDa MWCO 필터로 옮겨 소분자 오염물질과 저분자량 펩타이드를 제거했습니다.
3 kDa MWCO 필터를 22도, 7300g에서 1시간 동안 원심분리하여 보유물 부피 200 μL를 얻었습니다. 100 kDa MWCO 필터의 잔류물 200μL를 WB로 4 mL로 희석하고 동일한 필터를 통해 다시 필터링하여 한 번 더 세척했습니다.
이 flow-through를 위에서 언급한 것과 동일한 3 kDa MWCO 필터에 첨가하고 한 번 더 농축했습니다.
3 kDa MWCO 필터 세척에서 얻은 최종 보유액 200 μL를 1.5 mL LoBindEppendorf 튜브로 옮겼습니다. 샘플을 산성화하기 위해 10% 포름산(FA) 10μL를 첨가하여 최종 샘플의 FA 농도가 0.5%가 되었습니다.
샘플을 18000g에서 15분 동안 원심분리하여 침전된 물질을 제거한 후 BCA(bicinchoninic acid) 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정했습니다.
소 혈청 알부민 표준은 BCA 분석에 대한 잠재적 완충 기여를 설명하기 위해 8M 요소, 10mM ABC 및 0.5% FA에서 준비되었습니다. BCA 분석에 의한 단백질 농도는 1.1 mg/mL로 측정되었으며, 이는 ~2{11}}0 μL 샘플에서 총 회수된 단백질의 최종 수율 0.22 mg에 해당합니다. 샘플은 0.5% FA를 함유한 WB로 0.5mg/mL로 희석하고 LC-MS 분석까지 -80도에서 보관했습니다.
균질화 완충액 내에서 전통적인 프로테아제/포스파타제 억제제 칵테일을 사용한 초기 실험(데이터 미공개)은 3KMWCO 필터에 의한 여러 칵테일 구성 요소의 유지로 인해 오해의 소지가 있는 BCAassay 및 LC-MS 결과를 초래했다는 점에 유의해야 합니다.
더욱이, 일반적으로 사용되는 많은 포스파타제 및 프로테아제 억제제는 화학적으로 TCEP와 같은 환원제와 호환되지 않습니다. 이러한 비호환성과 10mM TCEP를 포함하는 8M 요소의 강력한 변성 조건을 고려하면 대부분의 프로테아제가 비활성화될 것으로 예상되므로 이러한 조건에서 단백질 분해가 여전히 최소화될 수 있다고 믿었습니다.
LC-MS/MS 분석 및 FAIMS 설정
샘플은 H2O 내 {{0}}.2% FA(이동상 A)와 ACN 내 0.2% FA(이동상 B)로 구성된 이동상을 갖춘 Waters NanoACQUITY UPLC 시스템을 사용하여 분석되었습니다.
트랩핑 프리컬럼(100μm ID, 5cm 길이)과 분석 컬럼(75μm ID, 50cm 길이)은 모두 C2 충전재(트랩/분석용으로 5μm 및 3μm, 각각 300Å, 분리 방법 기술)로 충전된 슬러리였습니다. . 샘플을 2.5ug의 로딩된 물질 양에 해당하는 5μL 루프에 로딩하고, 20분에 걸쳐 3μL/min에서 5% b의 등용매 흐름으로 트랩핑 컬럼에 주입했습니다.
분리는 300nL/min에서 180분에 걸쳐 5~50% b 구배로 수행되었습니다. 단백질의 MS/MS 분석을 위해 NanoACQUITY 시스템을 FAIMS Pro 인터페이스가 장착된 Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid 질량 분석기와 결합했습니다.
소스 매개변수에는 전기분무 전압 2.2kV, 전달 모세관 온도 275도, 이온 깔때기 무선 주파수 진폭 60%가 포함되었습니다. FAIMS는 사용자가 제어하는 추가 운반 가스 흐름과 -5 kV의 분산 전압(-33.3 kV/cm의 분산 필드와 동일) 없이 표준 분해능으로 설정되었으며, CV는 실험에 따라 달라졌습니다("외부 스테핑"이라고 함). ").
Fusion Lumos는 고에너지 C-트랩 해리(HCD) cellN2 압력을 2mTorr로 낮추는 "온전한 단백질" 적용 모드로 설정되었으며 데이터는 전체 프로필로 수집되었습니다. MS1 및 MS2 데이터는 500-2,000 m/z 및 400-2,000 m/z 범위에 걸쳐 120k 및 60k의 해상도, 3 및 2의 마이크로 스캔에서 수집되었으며 AGC 목표는 각각 5 × 106 및 5 × 105입니다.
MS1과 MS2도 최대 주입 시간 400ms로 획득되었습니다. 데이터 종속 설정에는 가장 강한 이온 상위 6개 선택, 충전 상태보다 낮은 이온 제외5+, 미확인 충전 상태 포함, 30초 동안 한 번의 관찰 후 동적 제외가 포함되었습니다.
MS2용으로 선택된 이온은 ±1.5m/z 창에서 분리되었으며 충돌 에너지 35%의 CID(충돌 유도 해리)를 통해 조각화되었습니다. 우리는 해석 가능한 단백질 단편화 스펙트럼을 달성하기 위해 정규화된 충돌 에너지의 의존성이 낮기 때문에 HCD 대신 CID를 활용하여 서열 범위보다 단백질 형태 관찰의 폭을 우선시했습니다.52
각 FAIMS CV에 대한 데이터 세트는 3중으로 수집되었습니다. 모든 원시 파일은 MassIVE 데이터 저장소에 보관되었으며 MSV000086696 액세스 또는 ProteomeXchange의 PXD023607을 통해 액세스할 수 있습니다.
For more information:1950477648nn@gmail.com
